肺炎链球菌自溶酶(LytA)蛋白T细胞表位的预测、筛选及确定

目的确定肺炎链球菌自溶酶(LytA)蛋白CD4 T细胞及CD8 T细胞的表位。方法通过生物信息学方法预测肺炎链球菌LytA蛋白分子小鼠的MHC-Ⅰ结合肽(CD8 T细胞表位)和MHC-Ⅱ结合肽(CD4 T细胞表位)序列并人工合成相应肽段;经诱导表达、纯化、透析、去内毒素、定量等步骤得到纯化的rLytA蛋白用以免疫小鼠;分离每只免疫组小鼠和对照组小鼠的脾及淋巴结细胞并分别与每条人工合成的候选表位肽段体外共培养,取培养上清进行双夹心ELISA检测每组细胞IFN-γ的产生情况;用初步筛选到的表位多肽刺激小鼠的脾及淋巴结细胞并进行细胞内染色及细胞流式技术检测,筛选出LytA蛋白分子T细胞表位。结果利用多种方法分析了LytA蛋白分子的MHC-Ⅰ结合肽及MHC-Ⅱ结合肽,经整理得到候选MHC-Ⅰ结合肽26条,候选MHC-Ⅱ结合肽7条,并进行了人工合成。利用分子生物学技术获得了rLytA蛋白并成功免疫了小鼠;双夹心ELISA结果初步提示:肽段LⅠ4、LⅠ5、LⅠ6、LⅠ7、LⅠ11、LⅠ12、LⅠ13、LⅠ14、LⅠ25以及肽段LⅡ3、LⅡ4、LⅡ5刺激免疫小鼠细胞产生的IFN-γ量比相应的对照小鼠显著升高;细胞流式技术进一步确定:经肽段LⅠ4、LⅠ6、LⅠ7、LⅠ11、LⅠ12、LⅠ13、LⅠ14及LⅠ25刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD8双阳性的细胞百分比较对照小鼠细胞的百分比显著升高;经肽段LⅡ4和LⅡ5刺激后,免疫小鼠细胞中IFN-γ和CD4双阳性的细胞百分比较对照小鼠细胞的百分比显著升高。结论确定了肺炎链球菌LytA蛋白分子2个CD4 T细胞及8个CD8 T细胞的表位。     

CPP Tat49-57促进外源CTL表位进入MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的机制研究

目的 研究穿膜肽（cell-penetrating pepfides，CPP）促进外源CTL表位进入抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的效应及呈递机制。方法应用多肽固相合成技术，将源于HIV-Tat的穿膜序列Tat49-57连接在H-2K^b限制性CTL表位0VA257-264的氨基端形成融合肽即Tat49-57-CTL257-264，同时合成该表位和氨基端自然延伸的对照肽NH2 extended-0VA257-264。采用流式细胞仪（FACS）分析技术，检测APC对各肽的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学，并进行MHC-Ⅰ类抗原呈递阻断和TAP依赖性实验。结果在所测时间点，APC对于Tat49-57-CTL257-264的呈递强度均明显高于NH2 extended OVA257-264；氨基肽酶抑制剂Bestatin可部分抑制APC对于Tat49-57-CTL257-264的MHC-Ⅰ类抗原呈递，而蛋白酶体抑制剂Lactacystin则无抑制效应；Tat49-57-0VA257-264可被TAP缺陷细胞RMA-S内MHC-Ⅰ类分子有效呈递，其呈递强度远超过RMA-S细胞对NH2 extended-0VA257-264的呈递。此外，RMAS固定后则丧失对Tat49-57-0VA257-264和NH2 extended-0VA257-264的MHC-Ⅰ类限制性呈递能力，但其表面的“空”MHC-Ⅰ类分子仍可呈递单纯表位肽0VA257-264。结论CPP Tat49-57可有效促进与之融合的CTL表位肽被细胞内MHC-Ⅰ类分子提呈，表现为动力学显著增强，且该过程表现为蛋白酶体／TAP非依赖、氨基肽酶依赖。     

ER滞留信号肽对外源CTL表位进入胞内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的促进作用

目的探讨哺乳动物内质网（endoplasmic reticulum，ER）滞留信号肽（retrieval signal sequence）能否促进外源CTL表位肽进入抗原呈递细胞（antigen-presenting cell，APC）内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径。方法应用多肽固相合成技术将哺乳动物内质网滞留信号——赖氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-亮氨酸（Lys-Asp-Glu-Leu，KDEL）基序融合在H-2K^b限制性CTL表位OVA257-264的羧基端，同时合成该表位和氨基端自然延伸四个氨基酸（TEWT）的对照肽OVA257-268。选择巨噬细胞系Ana-1作为本研究的APC，采用流式细胞仪（FACS）分析技术，检测各抗原肽在Ana-1内的MHC-Ⅰ类抗原呈递动力学。结果羧基端KDEL基序可明显增强与之偶联的CTL表位在APC内的MHC-Ⅰ类抗原呈递效率，并且显著延长APC表面MHC／肽复合物的呈递时间。结论羧基端KDEL基序修饰是将外源肽有效导入APC内MHC-Ⅰ类抗原呈递途径的一个简单有效的新策略，可为肿瘤治疗性肽疫苗的分子设计与研究提供新思路和实验依据。     

CD4~+ T细胞表位预测方法的研究进展

CD4~+T细胞表位是指外源性抗原经过抗原提呈细胞加工后,由MHC-Ⅱ类分子提呈给初始CD4~+T细胞受体的短肽。在过去的20年中,随着分子免疫学技术和生物信息学技术的发展及应用,CD4~+T细胞表位的预测技术获得了较大的进展,其预测效率也在逐步提高,这对于减少实验合成重叠肽、研究抗原与机体作用的免疫机制以及研制蛋白质亚单位疫苗和表位疫苗等均有重要意义。本文就CD4~+T细胞表位预测的分子基础和CD4~+T表位生物信息学预测分析进行阐述。     

结核分枝杆菌PPE家族蛋白CD4+T细胞泛宿主表位的计算机预测及其γ干扰素释放实验研究

目的 利用计算机预测结核分枝杆菌PPE家族蛋白MHC-Ⅱ类分子限制性CD4+T细胞泛宿主表位,并利用γ干扰素释放实验进行体外验证.方法 利用网上数据库提取PPE家族全部蛋白序列.使用生物信息学软件包括SignalP4.1,SecretomeP 2.0,DAS和NetMHCII2.2等分析工具预测、筛选出MHC-Ⅱ类分子限制性CD4+T细胞泛宿主表位.最后利用γ干扰素释放实验进行合成肽段的体外实验验证其刺激激活CD4+T细胞的能力.结果 发现了34个泛宿主表位多肽,其中21个来自于PPE8蛋白,其余来自于PPE12、PPE21和PPE62蛋白.γ干扰素释放实验并未发现预测出的泛宿主表位多肽可刺激大量的CD4+T淋巴细胞产生IFN-γ的分泌,但来自于PPE8蛋白的两个泛宿主表位多肽可刺激少量的CD4+T淋巴细胞产生反应.结论 这些计算机预测出来的泛宿主表位多肽,尤其是来自PPE8蛋白的泛宿主表位多肽,可能是下一步亚单位疫苗或诊断性标志物的重要候选抗原.但仍需进一步扩大样本量进行验证.     

C3bAN42与OVA257-264融合基因的构建及表达产物生物学活性的鉴定

目的：探讨补体系统在T细胞活化中的作用。方法：构建补体组分C3活化片段C3b的受体结合片段C3bAN42与OVA257-264CTL表位融合基因表达质粒，并对融合蛋白的表达以及生物学活性进行检测。结果：以重组质粒转染COS-7细胞后，用FACS检测融合蛋白在COS-7细胞中得到表达。将转染细胞的培养上清与巨噬细胞系Ana-1共孵育，通过激光共聚焦显微镜扫描观察，发现融合蛋白可与Ana-1发生特异性结合，并且重组的融合蛋白被Ana-1细胞内吞后，可释放出表位肽OVA257-264。后者与MHC-Ⅰ类分子结合后，以OVA257-264-MHCⅠ类分子复合物的形式被交叉呈递于Ana-1细胞的表面。结论：C3bAN42与OVA257-264CTL表位融合基因在真核细胞中能正确表达，且重组的融合蛋白具有其天然的生物学活性。     

人食管癌TE-1细胞MHC-Ⅰ相关抗原肽的初步研究

目的寻找TE-1细胞MHC-Ⅰ类分子提呈的抗原肽。方法用弱酸洗涤法获得TE-1细胞表面与MHC-Ⅰ类分子结合的抗原肽，经SepPak-C18柱、Centrion-3超滤器和RP-HPLE去盐纯化后，用负载该抗原肽的树突状细胞刺激生成肿瘤特异性杀伤细胞，以Cr^51释放法测定CTL的杀伤活性。结果高效液相色谱图显示多个峰；负载抗原肽DC刺激的CTL比未负载抗原肽DC刺激的CTL对TE-1细胞杀伤率高，两者差异有统计学意义；负载抗原肽DC刺激的CTL对与抗原肽孵育的T2细胞比对未经与抗原肽孵育的T2细胞杀伤率高，两者差异有统计学意义。结论弱酸洗涤法可从TE-1细胞上获得有效的抗原肽；混合抗原肽中有可与HLA-A2分子结合并能激发CTL的抗原肽。     

用竞争结合法检测HLAⅠ类分子抗原呈递能力

目的：建立弱酸处理后荧光素标记肽竞争结合法分析MHCⅠ类分子抗原呈递能力的方法，并评估其实用性。方法：pH2．7～3．1的柠檬酸缓冲液对B淋巴母细胞进行短时处理后，即用IMDM培养液中和pH，然后加入β2微球蛋白、荧光素标记的9肽及竞争肽共同孵育，FACs检测细胞表面的平均荧光强度，以达到50％抑制所需的竞争肽浓度作为衡量竞争肽与MHC分子结合能力的指标。结果：通过不同pH的柠檬酸缓冲液处理、处理后不同时间加β2微球蛋白和，或荧光素标记肽、加入不同稀释度的竞争肽等角度，对方法进行评估，结果显示本方法操作简便、结果可靠、非特异性吸附小。结论：在排除其它MHCⅠ类分子的干扰后，本方法适合在国情条件下广泛开展MHCⅠ类分子抗原呈递能力及T细胞肽表位筛选等研究。     

诱导杀伤性T细胞反应的恶性疟疫苗研究进展

杀伤性Ｔ细胞（ＣＴＬ）是恶性疟红前期免疫反应的关键环节。本文主要就利用ＭＨＣ分子结合肽基序确定ＣＴＬ表位进行综述，并围绕如何克服ＣＴＬ的ＭＨＣ限制性，对多抗原成分疫苗的设计、多表位疫苗的设计和ＭＨＣⅠ类分子结合亚型和共用肽段等方面的研究进行了探讨。     

抗原加工和提呈的研究进展

抗原加工和提呈是指抗原提呈细胞（APC）摄取抗原并加工成肽分子，以MHC-肽分子复合体表达于细胞表面，由T细胞上TCR识别，与APC产生共刺激因子，表达共刺激分子与T细胞上相应受体结合，激活特异的T细胞反应这一复杂的多步骤过程。本文综述了该过程中抗原分子的加工过程，MHC分子与肽分子的组装等方面的最新进展。     

特异性HPV16E7 CTL表位肽-MHC I复合物单抗的制备及鉴定

目的制备抗HPV16E7CTL表位（49-57）-MHC Ⅰ类分子复合物的特异性单克隆抗体，并对其敏感性、特异性及亲和力进行鉴定，为今后研究HPV16感染后机体对病毒蛋白的免疫呈递途径研究奠定基础。方法制备高纯度的HPV16E7 CTL表位（49．57）肽RAHYNIVTF，将其与TAP缺陷的RMA-S细胞孵育后免疫BALB／c小鼠，常规收集小鼠脾细胞与SP2／0细胞融合，筛选杂交瘤细胞株的阳性克隆，并对其进行一系列鉴定。结果筛选出的杂交瘤细胞株能稳定分泌抗HPV16E7（49．57）-MHC Ⅰ类分子复合物的单抗，不仅能与装载有RAHYNIVTF的TAP缺陷的RMA-S细胞结合，也能与具有内源性抗原处理能力的RMA细胞结合，但不能与装载有类似变异肽（进行氨基置换后的RAHYNIVTF）或乙肝病毒对照肽的RMA-S或RMA细胞反应，具有良好的敏感性、特异性及亲和力。结论本实验制备表位肽．MHC Ⅰ类复合物单抗的方法，对今后研究包括HPV16感染在内的病毒感染免疫有很大的临床应用价值。     

诱导杀伤性T细胞反应的恶性疟疫苗研究进展

杀伤性Ｔ细胞（ＣＴＬ）是恶生疟红前期免疫反应的关键环节。本文主要就利用ＭＨＣ分子结合肽基序确定ＣＴＬ表位进行综述，并围绕如何克服ＣＴＬ的ＭＨＣ限制性，对多抗原成分疫苗的设计、多表位疫苗的设计和ＭＨＣⅠ类分子结合亚型和共用肽段等的研究进行了探讨。     

利用MHC-I/肽结合的预测与免疫学实验相结合的方法鉴定肿瘤抗原表位

目的:建立中国人群常见的人类白细胞抗原(HLA)分子限定的肿瘤抗原免疫表位的鉴定技术,为分离及鉴定肿瘤特异性T细胞以及克隆肿瘤抗原特异性T细胞受体基因提供实验基础。方法:以肿瘤/睾丸抗原NY-ESO、MAGE-A1和KK-LC-1作为模型,选用中国人群常见的HLA-I分型,利用主要组织相容性复合体(MHC)/肽预测软件对这3个抗原的MHC-I类表位进行预测。用PCR技术测定健康志愿者的HLA分型,以志愿者含有的中国人群常见HLA-A*11:01和HLA-B*46:01分型选择预测的抗原表位,设计合成KK-LC-1长肽,进行T细胞刺激实验,用ELISPOT和流式细胞仪分析产生干扰素γ(IFN-γ)的T细胞数量和CD137上调反应,以验证肽对T细胞特异性刺激的有效性。对其中一个反应最好的KK-LC-1长肽,开展短肽的验证。结果:(1)3个肿瘤/睾丸抗原在我国人群35种常见HLA分型中存在众多的强结合表位,在不同蛋白质的序列中分布不均匀;(2)KK-LC-1长肽可刺激T细胞产生T细胞活化反应,即释放IFN-γ和T细胞上调CD137分子,与预测的HLA分型基本吻合;(3)KK-LC-1短肽比长肽刺激效果更好,有更精确的抗原表位。结论:利用MHC/肽预测法并结合抗原特异性刺激实验可快速鉴定肿瘤抗原的T细胞表位;根据长肽的结果缩短肽段,可确定抗原表位。本研究为快速确定肿瘤抗原表位提供了新的途径。     

MHCⅠ类分子及与之结合的抗原肽

细胞内生性抗原需降解成抗原肽，由ＭＨＣⅠ类分子呈递给ＣＤ８￣＋Ｔ细胞识别，从而诱导特异性细胞免疫应答。ＭＨＣⅠ类分子与抗原肽之间的结合表现出ＭＨＣ等位基因特异性，根据此特点可以预测抗原的Ｔ细胞识别表位，对于阐明自身免疫病和器官移植排斥反应的机理，指导人工合成肽疫苗用于病毒感染及肿瘤的免疫防治均具有重要意义。     

T细胞表位预测研究进展

T细胞表位是指抗原经过抗原提呈细胞加工后，由MHC分子提呈给T细胞受体的短肽。随着分子生物医学和分子免疫学技术的发展，尤其是计算机在生物学中的广泛应用，对T细胞表位可以进行初步预测。本文就T细胞表位预测的分子基础、CTL抗原表位和Th抗原表位预测研究进展作一简要综述。     

HLA-F的研究进展

人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）系统，是目前已知人类最复杂的显性遗传多态系统，由主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）基因所编码。MHC包括Ⅰ类与Ⅱ类分子。MHC-Ⅰ类分子分为两类：一类是多态性显著的经典MHC-Ⅰ类分子（MHC-Ia），包括ⅢA-A，-B，-C，它们在免疫应答中起重要作用；另一类为非经典MHC-Ⅰ类分子，包括HLA-E，-F，-G，其在组织中分布有所不同。     

HLA-DRB1结合性变构肽对T细胞活化的竞争性抑制作用

目的：研究去除T细胞受体（TCR）识别表位的HLA-DRB1结合性Ⅱ型胶原（CⅡ）变构肽对T细胞活化的抑制作用。方法：将人CⅡ的抗原性片段（CⅡ263-272）中与T细胞识别有关的268—270位氨基酸分别用丙氨酸和甘氨酸替换，形成CⅡ变构肽S268-270，并将该多肽与表达HLA-DR1的抗原呈递细胞（APC）及抗原性原型CⅡ263-272多肽共同孵育，研究变构肽S268-270在竞争性抑制CⅡ263-272与HLA-DR1分子结合中的作用；利用HLA-DR1转基因APC及其特异性T细胞，研究S268-270对抗原性CⅡ263-272及流感病毒血凝素（HA）306—318诱导的T细胞活化的抑制作用。结果：CⅡ变构肽S268-270可结合APC表面的HLA—DR1分子，并可抑制CⅡ263-272及HA306-318两种不同抗原诱导的HLA-DR1限制性T细胞活化。结论：替换CⅡ263-272中与TCR识别有关的氨基酸所形成的CⅡ变构肽S268-270可与APC表面的HLA-DR1分子结合，并可抑制HLA-DR1结合性抗原肽CⅡ263-272及HA306-318诱导的T细胞活化。CⅡ变构肽S268-270可能对类风湿关节炎患者的HLA-DR1限制性T细胞异常活化具有抑制作用。     

MHC-Ⅰ分子抗原呈递的研究进展

细胞表面的MHC-Ⅰ类分子主要早递细胞内的抗原,是细胞毒T淋巴细胞发挥免疫保护功能的重要基础.二十多年来.随着基因组学等实验技术的不断发展和新的生物信息学方法的不断提出和应用,MHC-Ⅰ分子抗原呈递的研究取得了巨大进展.本文从MHC-Ⅰ抗原加工呈递的分子机制、MHC-Ⅰ结合多肽的来源蛋白以及MHC-Ⅰ结合多肽的结构和构成特征等三个方面对MHC-Ⅰ分子抗原呈递这一基本的免疫学问题进行综述.     

轮状病毒结构蛋白VP7 HLA-A2.1限制性CTL表位的初步鉴定

目的 预测并初步鉴定轮状病毒Wa株结构蛋白VP7 HLA—A2．1限制性CTL表位。方法 用BIMAS软件预测VP7 HLA—A2．1限制性CTL表位；分子模拟技术对分值最高的4条肽进行分子模建；最后测定候选肽与HLA-A2．1分子的亲和力及结合稳定性。结果 结合BIMAS及分子模拟的预测结果，选择4条肽QLYCDYNLV（132—140）、LLNYILKSV（18—26）、VLMKYDQSL（140—148）及VNWKKWWQV（287—295）作为候选表位肽；4条肽与HLA—A2．1结合的荧光系数（FI）值分别为2．58、3．83、3．19及0．82，肽-HLA-A2．1复合物半数解离时间（DC50）分别为2-4、6-8、8及2h。结论 QLYCDYNLV（132—140）、LLNYILKSV（18—26）及VLMKYDQSL（140—148）为潜在的HLA-A2．1限制性CTL表位。     

人Ⅱ型胶原的HLA-A~*0201限制性CTL表位的预测及初步鉴定

目的预测和初步鉴定类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)主要自身抗原Ⅱ型胶原(CollagenⅡ,CⅡ)的HLA-A*0201限制性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)表位,为基于CⅡ抗原表位的特异性免疫治疗奠定基础。方法选取BIMAS、SYFTEPITHI、IEDB、SVMHC、AntiJen预测工具预测该抗原HLA-A*0201限制性结合肽;人工合成待测表位肽,利用T2细胞株通过直接免疫荧光法测定各肽与HLA-A*0201分子的结合力。利用酶联免疫斑点检测(enzyme-linked immunospotassay,ELISPOT)方法检测候选肽刺激关节滑液单个核细胞(synovial fluid mononuclear cell,SFMC)分泌IFN-γ的能力。结果综合BIMAS、SYFTEPITHI、IEDB、SVMHC、AntiJen预测结果筛选出来可能与HLA-A*0201结合的5条肽。MHC亲和力实验表明,在候选的5条肽中,P1261、P1365及P1399具有与HLA-A*0201分子结合的能力,平均荧光强度分别为:1.35、2.53、1.78。ELISPOT试验结果表明,P1365具有刺激SFMC分泌IFN-γ的能力。结论表位预测结果与初步鉴定结果具有一致性,两者联合应用初步认为P1365是HLA-A*0201限制性CTL表位的可能性最大,为下一步表位鉴定及基于人CⅡ抗原表位的特异性免疫治疗奠定理论基础。