改进酶消化法培养SD大鼠成骨细胞及其鉴定

摘要 目的：改进SD大鼠成骨细胞的体外分离、培养方法并进行功能鉴定。方法：将新生SD大鼠处死，无菌条件下取出颅骨，剔净骨膜后剪成1mm3大小组织块。组织块经0.25%胰蛋白酶消化20min，继以0.1% II型胶原酶消化60 min，收集上清离心，所得成骨细胞接种于培养瓶中并行“多次贴壁法”纯化。观察细胞形态学，选用ALP Gomori 钙钴法染色，钙结节茜素红法染色及I型胶原免疫组化染色等方法进行鉴定。 结果：培养的细胞具有典型的成骨细胞形态特征，在体外培养时可维持其在体内的功能:合成碱性磷酸酶、形成矿化结节，I型胶原染色阳性。结论：用改进后的酶消化法分离、培养SD大鼠成骨细胞，更能减少胰蛋白酶在消化过程中对细胞造成的损伤，所获成骨细胞量多、纯度高，操作简易可行，可作为骨组织工程种子细胞常规的培养方法。     

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法：采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景:组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的:建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法:采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论:二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

乳兔成骨细胞原代培养与鉴定：改良胶原酶与胰酶的分段消化

背景：成骨细胞获取的方法较多,如何简便而迅速的获得高纯度的成骨细胞成为研究的热点。目的：比较组织块法、胶原酶消化法、改良胶原酶和胰酶分段消化法体外培养纯化乳兔颅骨来源的成骨细胞结果及其细胞的生物学特点。方法：取新生24 h内新西兰大白兔乳兔颅盖骨,采用组织块法、胶原酶消化法和改良胶原酶和胰酶分段消化法分离获取兔原代成骨细胞,并进行传代培养。通过倒置显微镜下形态学观察、锥虫蓝排斥法计数活细胞率及MTT法绘制细胞生长曲线、茜素红染色、细胞培养上清液碱性磷酸酶和骨钙素检测、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组织化学法和RT-PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达等对成骨细胞进行鉴定。结果与结论：分离培养的成骨细胞均一性好、增殖能力强,具备成骨细胞的典型特征,茜素红染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅲ型胶原免疫组织化学染色阴性,细胞培养上清液碱性磷酸酶、骨钙素均有表达,PT-PCR结果有Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素mRNA表达。改良胶原酶和胰酶分段消化法较传统胶原酶消化法有更高的细胞获取率,更好的细胞活性,且比传统胶原酶消化法耗时短（P〈0.05）;组织块法操作方法最为简单,细胞活性最高,但是细胞产出率最低、耗时最长,不适合用于成骨细胞大规模培养。用改良的胶原酶和胰酶分段消化法可获得数量较多且纯度较高的成骨细胞,可以成为一种相对可靠、有效的原代成骨细胞的体外培养方法。     

优化酶消化法体外培养及鉴定SD大鼠的成骨细胞

背景:体外成骨细胞的培养技术已经有了很大的发展.但是,在培养过程中,如果胰蛋白酶的消化时间过长,成骨细胞膜便易受到损伤;同时,传统的培养方法存在所获得的成骨细胞数量少、纯度不高等不足.因此,有必要探求一种新的体外培养成骨细胞的方法.目的:优化成骨细胞在体外条件下的培养方法并对其进行鉴定.设计:观察性实验.单位:暨南大学附属第一医院骨科.材料:实验于2007-03/05在暨南大学附属第一医院骨科完成.选用出生24h的SD大鼠8只,由南方医科大学实验动物中心提供,雌雄不拘.实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.实验用Ⅱ型胶原酶由美国Sigma公司分装,胰蛋白酶为Sigma公司产品,碱性磷酸酶试剂盒由南京建成生物制品公司生产,SABC-1021试剂盒由武汉博士德公司进口分装.方法:挑选24h之内的新生SD乳鼠麻醉后处死,无菌条件下取出颅骨,剔除附着的结缔组织及骨膜,D-Hank's液冲洗3次.不强调对颅骨内、外膜,骨缝连接处等附着的结缔组织及颅顶的透明软骨结节等进行反复多次的剔除,避免操作时间过长影响细胞的存活率.结合0.1%Ⅱ型胶原酶来消化SD乳鼠颅骨,减少并严格控制胰蛋白酶的消化时间.组织块经0.25%胰蛋白酶消化20 min,继以0.1%Ⅱ型胶原酶消化60 min,收集上清离心,所得成骨细胞接种于培养瓶中并行"多次贴壁法"纯化.主要观察指标:应用倒置相差显微镜、透射电子显微镜、扫描电子显微镜观察成骨细胞形态特点.采用碱件磷酸酶Gomori钙钴法染色、钙结节茜素红法染色及Ⅰ型胶原免疫组织化学染色方法进行鉴定成骨细胞生物学特性.结果:原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,细胞呈多角形或梭形,具有多个突起可互相连接,细胞核较幼稚,细胞器丰富,具有典型的成骨细胞形态特征.体外培养的成骨细胞可分泌碱性磷酸酶,改良钙钴法染色阳性率可达90%,并可形成钙结节,Ⅰ型胶原染色阳性,具有成骨细胞的生物学功能.结论:实验用优化后的酶消化法分离、培养的SD大鼠成骨细胞具有典型的成骨细胞生物学特征.     

脂质体介导的rhIGF-1基因对成骨细胞增殖分化的影响

目的探讨重组人胰岛素生长因子（rhIGF-1）基因对体外培养大鼠成骨细胞增殖分化的影响。方法采用酶消化法获取大鼠乳鼠颅骨成骨细胞，传至第3代进行成骨细胞鉴定，钙化结节用茜素红（ARS）染色，钙钴法显示成骨细胞中碱性磷酸酶（ALP）的表达。用脂质体法将pcDNA3．1-rhIGF-1质粒转染成骨细胞。倒置显微镜下观察细胞的生长形态，MTT法检测成骨细胞增殖情况，碱性磷酸酶及骨钙素（OCN）测定成骨细胞活性。结果建立了稳定的大鼠成骨细胞模型；pcDNA3．1-rhIGF-1质粒转染组与对照组及空质粒pcDNA3．1组比较成骨细胞增殖旺盛、ALP和OGN的分泌增加，有显著性差异（P〈0．01）。结论外源性rhIGF-1基因能够刺激大鼠成骨细胞增殖、分化，促进骨形成。     

胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞

目的：改良成骨细胞分离培养方法，为骨形成、骨代谢以及骨组织工程等基础研究提供种子细胞。 方法：实验于2002—09／2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。①无菌条件下取五六个月龄流产胎儿颅盖骨（家属知情同意），去除骨膜及周围结缔组织，然后用2．5g/L胰蛋白酶消化20min，终止消化后，去除骨缝组织，剪碎，将碎骨块接种于培养瓶中分离培养成骨细胞。②细胞纯化采用差速贴壁法。通过相差显微镜观察人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征。③用碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色等方法对所获得的成骨细胞进行鉴定。 结果：①人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征：原代培养至第5天，骨块边缘出现零散的细胞，这些细胞的形态主要为梭形、三角形或多边形。原代培养第14天后，形成融合层，细胞呈圆形、卵圆形或方形紧密排列，叠层生长。传代细胞主要呈三角形或方形细胞，细胞排列无方向性，出现集落样生长趋势。②人胚成骨细胞的鉴定结果：90％以上分离获得细胞碱性磷酸酶染色和钙结节染色均呈阳性。 结论：采用酶消化后植块的改良植块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞，这些细胞具有典型的成骨细胞形态和功能，是一种较好的分离培养人胚成骨细胞的方法。     

骨组织块法和酶消化法联合培养人成骨细胞

背景：成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的：探讨理想的人成骨细胞体外培养的方法。方法：取人髂骨松质骨,同时结合骨组织块法和酶消化法分离培养人成骨细胞。结果与结论：分离培养的人成骨细胞生长状态良好,纯度较高。细胞贴壁生长,形态多样化,多呈多边形、纺锤型、梭形、三角形,胞浆丰富向外伸展出生长突,具有典型的成骨细胞形态特征;细胞增殖良好,碱性磷酸酶染色及矿化结节茜素红染色阳性。说明联合骨组织块法和酶消化法可成功分离培养人成骨细胞,是进行人成骨细胞体外培养较为理想的方法。     

比较不同来源人成骨细胞的体外培养模式及其生物学特性

目的：建立不同来源人成骨细胞的体外培养模式，比较颅骨、骨膜、骨髓来源的成骨细胞的生物学特性。 方法：实验于2002-9／2004—3在东南大学修复重建外科研究所完成。①从人4个月龄胚胎骨膜、颅骨及骨髓组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞，颅骨来源的成骨细胞和骨髓基质干细胞并对骨髓基质干细胞进行成骨诱导培养。②体外动态观察细胞的生长情况和形态学变化，用第2-4代细胞进行细胞鉴定和生物学特性的比较。③通过相差显微镜，Giemsa染色及透射电镜观察比较细胞的形态和超微结构，通过生长曲线，比较细胞的增殖能力。经碱性磷酸酶染色和钙结节染色比较细胞的成骨活性，并经X射线能量散射分析鉴定钙结节的元素成分。 结果：培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质干细胞具有成骨细胞的形态、生长及功能特点。骨膜、颅骨来源的成骨细胞以功能态为主，骨髓基质干细胞以增殖态为主。①体外增殖结果：3种细胞的增殖能力依次为：骨髓基质干细胞、颅骨来源成骨细胞、骨膜来源的成骨细胞。②形态学观察：第3代后3种细胞在形态上无明显的差别，在超微结构上骨膜来源的成骨细胞和颅骨来源的成骨细胞为高分化细胞，骨髓基质干细胞为低分化细胞。③成骨功能表达：骨膜来源成骨细胞第15天，颅骨来源成骨细胞第17天光镜下可见褐色的钙化结节形成，骨髓基质干细胞在诱导液条件下培养24d时可见褐色结节：矿化结节X射线能量散射分析，其Ga／P元素含量比值，骨膜来源成骨细胞为2．16&;#177;0．17，颅骨来源成骨细胞为2．39&;#177;0．21，骨髓基质干细胞为2．57&;#177;0．15；骨膜来源成骨细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为95．2％，颅骨来源成骨细胞为89．6％。骨髓基质干细胞（诱导后）为69．0％。骨髓基质干细胞（未诱导）碱性磷酸酶染色阴性。3种不同来源的人成骨细胞成骨能力依次为：骨膜来源的成骨细胞、颅骨来源成骨细胞、骨髓基质干细胞。 结论：采用改良的酶消化法，培养骨、骨膜来源的成骨细胞，通过加以改进的密度梯度离心法，培养骨髓基质干细胞，可得到均一性好，活性强的3种不同来源的人成骨细胞。     

不同强度静磁场对成骨细胞细胞骨架改建的影响

背景：静磁场对成骨细胞增殖活性、细胞因子分泌及碱性磷酸酶表达等功能活性影响的机制尚不清楚。目的：观察不同强度静磁场加载对成骨细胞骨架改建和细胞骨架蛋白表达的影响。方法：取新生24h内SD大鼠颅骨进行成骨细胞的培养和鉴定。采用静磁场加载装置对体外培养的成骨细胞进行0,8,50,160mT的静磁场加载,分别于静磁场加载24,48,72h应用BODYPY-Phaloidin进行成骨细胞骨架染色,激光扫描共聚焦显微镜和图像处理软件ImageJ测定细胞骨架蛋白的荧光强度。结果与结论：8,50,160mT静磁场加载24,48,72h,荧光标记的成骨细胞骨架蛋白向细胞核周围集中,荧光强度增强（P〈0.05）,其中经50mT静磁场加载的成骨细胞骨架蛋白的荧光最强。说明一定强度的静磁场可以影响成骨细胞骨架的改建和重组。     

大鼠骨髓基质干细胞的成骨诱导及鉴定

目的：研究大鼠骨髓基质干细胞（BMSCs）在体外培养、诱导后的形态学改变及生物活性．探讨BMSCs作为骨组织工程种子细胞的可能性和可行性。方法：通过改良的骨髓培养法分离成年大鼠BMSCs，经条件培养液诱导培养后，进行形态学观察和碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（OCN）的测定。结果：经过体外成骨诱导的BMSCs表现出增殖、聚集、结节和矿化期的阶段性形态特征，同时在诱导2周后表达ALP活性，在结节期和矿化期OCN表达呈阳性。结论：体外成骨定向诱导的BMSCs具有典型的成骨细胞的形态和功能性特征，可以作为骨组织工程的种子细胞。     

胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞

目的:改良成骨细胞分离培养方法,为骨形成、骨代谢以及骨组织工程等基础研究提供种子细胞。方法:实验于2002-09/2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。①无菌条件下取五六个月龄流产胎儿颅盖骨(家属知情同意),去除骨膜及周围结缔组织,然后用2.5g/L胰蛋白酶消化20min,终止消化后,去除骨缝组织,剪碎,将碎骨块接种于培养瓶中分离培养成骨细胞。②细胞纯化采用差速贴壁法。通过相差显微镜观察人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征。③用碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色等方法对所获得的成骨细胞进行鉴定。结果:①人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征:原代培养至第5天,骨块边缘出现零散的细胞,这些细胞的形态主要为梭形、三角形或多边形。原代培养第14天后,形成融合层,细胞呈圆形、卵圆形或方形紧密排列,叠层生长。传代细胞主要呈三角形或方形细胞,细胞排列无方向性,出现集落样生长趋势。②人胚成骨细胞的鉴定结果:90%以上分离获得细胞碱性磷酸酶染色和钙结节染色均呈阳性。结论:采用酶消化后植块的改良植块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞,这些细胞具有典型的成骨细胞形态和功能,是一种较好的分离培养人胚成骨细胞的方法。     

比较不同来源人成骨细胞的体外培养模式及其生物学特性

目的:建立不同来源人成骨细胞的体外培养模式,比较颅骨、骨膜、骨髓来源的成骨细胞的生物学特性。方法:实验于2002-9/2004-3在东南大学修复重建外科研究所完成。①从人4个月龄胚胎骨膜、颅骨及骨髓组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞,颅骨来源的成骨细胞和骨髓基质干细胞并对骨髓基质干细胞进行成骨诱导培养。②体外动态观察细胞的生长情况和形态学变化,用第2～4代细胞进行细胞鉴定和生物学特性的比较。③通过相差显微镜,Giemsa染色及透射电镜观察比较细胞的形态和超微结构,通过生长曲线,比较细胞的增殖能力。经碱性磷酸酶染色和钙结节染色比较细胞的成骨活性,并经X射线能量散射分析鉴定钙结节的元素成分。结果:培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质干细胞具有成骨细胞的形态、生长及功能特点。骨膜、颅骨来源的成骨细胞以功能态为主,骨髓基质干细胞以增殖态为主。①体外增殖结果:3种细胞的增殖能力依次为:骨髓基质干细胞、颅骨来源成骨细胞、骨膜来源的成骨细胞。②形态学观察:第3代后3种细胞在形态上无明显的差别,在超微结构上骨膜来源的成骨细胞和颅骨来源的成骨细胞为高分化细胞,骨髓基质干细胞为低分化细胞。③成骨功能表达:骨膜来源成骨细胞第15天,颅骨来源成骨细胞第17天光镜下可见褐色的钙化结节形成,骨髓基质干细胞在诱导液条件下培养24d时可见褐色结节;矿化结节X射线能量散射分析,其Ga/P元素含量比值,骨膜来源成骨细胞为2.16±0.17,颅骨来源成骨细胞为2.39±0.21,骨髓基质干细胞为2.57±0.15;骨膜来源成骨细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为95.2%,颅骨来源成骨细胞为89.6%,骨髓基质干细胞(诱导后)为69.0%。骨髓基质干细胞(未诱导)碱性磷酸酶染色阴性。3种不同来源的人成骨细胞成骨能力依次为:骨膜来源的成骨细胞、颅骨来源成骨细胞、骨髓基质干细胞。结论:采用改良的酶消化法,培养骨、骨膜来源的成骨细胞,通过加以改进的密度梯度离心法,培养骨髓基质干细胞,可得到均一性好,活性强的3种不同来源的人成骨细胞。     

成人成骨细胞骨髓培养法与组织块培养法的对比

目的:观察成人成骨细胞在两种不同培养方法下的增殖、分化、成骨能力以及细胞形态学方面的差异,探讨成人成骨细胞培养的更为便捷有效的方法。方法:实验于2006-03/10在南京大学附属鼓楼医院科研部完成。①实验分组:分为两组。一组取前后交叉韧带断裂患者关节镜下重建术修整髌韧带时残留的松质骨块;另一组抽取同一患者骨髓进行成骨细胞原代培养,患者均知情同意。②实验方法:在相同的培养条件下,对松质骨块及骨髓分别用组织植块培养及骨髓培养法进行成骨细胞原代培养。③实验评估:倒置相差显微镜观察记录原代成骨细胞的形态学变化,改良钙钴法染色计算两组碱性磷酸酶染色阳性细胞数及其百分比;分别在第2,3,4,5,6天以四甲基偶氮唑盐比色法绘制细胞增殖曲线,磷酸对硝基苯酯二钠盐法测定碱性磷酸酶含量并检测成骨细胞的增殖、分化活性;以VonKossa染色比较成骨细胞成骨能力。结果:①细胞形态学观察结果:倒置相差显微镜观察证实成骨细胞组织块培养法与骨髓培养法培养出的成骨细胞在形态上无明显差异。②碱性磷酸酶染色后阳性细胞的表达:组织块培养法成骨细胞纯度为(90±6)%,高于骨髓培养法(68±10)%。③成骨细胞增殖、分化活性的测定:四甲基偶氮唑盐比色法培养第3天后可见细胞增殖趋势发生明显变化,组织块法的增殖优于骨髓培养法;碱性磷酸酶检测表明在细胞分化方面,骨髓培养法优于组织块培养法。④成骨细胞的成骨能力:VonKossa钙结节染色证实骨髓培养法与组织块培养法形成的钙结节数量分别为(8±6)个/视野及(12±3)个/视野,无显著差异。结论:骨髓培养法与组织块培养法各有优点与不足,需根据具体实验要求确定相应的培养方法。     

脱蛋白骨为支架材料的体外细胞相容性特点

目的:前期实验应用过氧化氢-乙醚法已成功将天然骨制成脱蛋白骨支架材料,进一步观察脱蛋白骨支架材料与成骨细胞在体外的生物相容性,旨在为组织工程骨构建提供良好的支架材料。方法:实验于2003-01/2005-12在重庆医科大学实验动物中心进行。①酶消化-组织块联合培养法体外培养胎兔颅骨成骨细胞:取新西兰大白兔胎兔颅骨骨块,制成2mm×2mm骨块,Ⅰ型胶原酶室温下消化。再制成1mm×1mm骨块并孵育,待细胞爬满骨块间隙后传代,行细胞形态学观察、碱性磷酸酶染色、钙化结节染色等方法行鉴定。将第3代成骨细胞复苏培养,制成2×1010L-1的细胞悬液备用。②将成年兔干骺端松质骨用过氧化氢-乙醚法制成脱蛋白骨。将备用细胞悬液均匀浸滴在脱蛋白骨上,使细胞悬液渗入材料孔隙内,并行体外复合培养。通过酶消化法、倒置显微镜及扫描电镜了解脱蛋白骨的细胞相容性。结果:①酶消化-组织块联合培养法成功获得胎兔颅骨成骨细胞:倒置显微镜观察示原代细胞呈不规则多边形,传代细胞均为长梭状或长不规则多边型,碱性磷酸酶化学染色示大多数细胞染色呈黑色阳性,钙结节染色示大量黑色的矿化结节分布在细胞外基质。②成骨细胞与脱蛋白骨材料体外复合培养后第3日进入对数生长期;倒置相差显微镜可见复合培养后第7日成骨细胞数量有明显增加,部分细胞出现连接生长;扫描电镜证实复合培养后第7日可见连接成片生长的成骨细胞。结论:过氧化氢-乙醚法制备的脱蛋白骨具有良好的细胞相容性,可作为组织工程骨的支架材料。     

新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一。但是成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的：验证及比较成骨细胞原代培养常用的3种方法,探索一种操作简便,既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法,为进一步的实验研究奠定基础。方法：取新出生72 h 内SD大鼠乳鼠颅骨,以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞,进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。结果与结论：分离培养的成骨细胞增殖良好,具备典型成骨细胞特性,细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多,细胞存活率高(P<0.05);且比分段胶原酶消化法操作简单,耗时短。组织块法操作最为简单,对细胞损伤较小,但是细胞数量低、耗时长,很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。     

4，5，6—三羟基异黄酮对原代培养大鼠成骨细胞增殖、分化、钙含量及矿化功能的影响

背景：骨质疏松症是人类老年时生活质量下降和寿命缩短的主要原因之一，而其发生与成骨细胞和破骨细胞的功能失偶联有关，因而在细胞水平上观察药物对成骨细胞功能的调整作用是评价骨质疏松症防治药物药效的方法之一。目的：了解4，5，6—三羟基异黄酮(Genistein)对体外培养成骨细胞的作用。设计：以大鼠成骨细胞为研究对象的随机对照单盲研究。单位：一所市级医院的检验科。材料：本实验于2001—02／2001—12在北京中日友好医院核医学科同位素室完成。选择10只出生24h的SD大鼠，(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号为SCXK11—00—0008)，实验室级别为SPF级。方法：取小鼠头盖骨成骨细胞进行体外培养，应用四氮唑盐(MTT)法、对硝基苯磷酸盐法、原子吸收分光光度法及茜素红染色方法观察Genistein对体外培养成骨细胞的增殖、碱性磷酸酶表达、基质钙含量及矿化结节形成的影响。主要观察指标：形态观察、增值率测定、碱性磷酸酶染色、细胞基质钙含量测定、茜素红染色显示矿化结节数。结果：Genistein刺激成骨细胞的增殖，提高了碱性磷酸酶活性，细胞基质钙含量及矿化结节形成的数量增大。结论：Genistein具有刺激体外培养成骨细胞增殖、分化成熟及促进矿化的作用。     

灰色数列预测模型在成骨细胞体外培养中的应用

目的：灰色模型是运用一定的数学方法使信息不完全明确的系统经数据处理后能得到较明确结果的一种数学预测模型，体外细胞培养的影响因素较多，属于信息不完全明确的灰色系统，故运用灰色GM（1，1）模型对成骨细胞增殖、分化的变化规律进行预测，验证模型在体外细胞培养中的可应用性。方法：实验于2005—11／2006—03在广东医学院药理教研室完成。①实验过程：应用酶序列消化分离培养法培养新生大鼠颅骨成骨细胞；用MTT法测定体外培养成骨细胞在不含血清培养液A值，以了解成骨细胞的增殖情况；对硝基苯磷酸盐法观察体积分数为0．01的胎牛血清培养液对体外培养成骨细胞分泌碱性磷酸酶活性的影响，代表成骨细胞的分化情况。②灰色GM（1，1）模型建立：运用灰色系统理论，通过SAS8．1软件对体外培养成骨细胞MTT值和碱性磷酸酶OT值进行分析和预测。结果：运用灰色系统理论的后验差检验方法对模型进行检验，MTT这一指标的平均相对误差为4．4％，碱性磷酸酶这一指标的平均相对误差为7．04％，后验差比值为0．048和0．315，综合评定该模型为“好”。结论：灰色GM（1，1）模型对体外培养成骨细胞MTT值和碱性磷酸酶的OT值变化的预测精度高，结果可靠。体外培养成骨细胞MTT值和碱性磷酸酶的OT值的变化可用灰色GM（1，1）模型进行预测。     

骨髓基质干细胞成骨分化过程中Wnt、骨形态发生蛋白2信号通路相关因子与辛伐他汀的作用

背景：辛伐他汀可促进体外培养的人或鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化,但作用机制尚不清楚。目的：观察辛伐他汀对大鼠骨髓基质干细胞向成骨细胞分化过程中Wnt与骨形态发生蛋白2信号途径中相关因子表达的影响。方法：取6周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨全骨髓进行体外成骨细胞诱导培养。实验分为对照组及SIM组。SIM组加入浓度为10-7mol/L辛伐他汀,对照组加入等量无水乙醇和PBS。培养14d,行碱性磷酸酶染色,28d时,行vonKossa染色观察细胞外基质矿化情况;培养14,21d,免疫荧光细胞化学染色观察成骨细胞中β-catenin,Smad1/5,Cbfa1的表达及分布。结果与结论：大鼠骨髓基质干细胞经体外诱导后可分化为具有碱性磷酸酶活性和矿化细胞外基质能力的成熟成骨细胞。辛伐他汀可显著上调骨髓基质干细胞成骨分化过程中碱性磷酸酶的表达。同时,与对照组比较,SIM组β-catenin,Smad1/5,Cbfa1表达明显增多（P〈0.05）,且呈现明显的核内聚集趋势。说明辛伐他汀促进骨髓基质干细胞向成骨细胞分化的作用可能与调控Wnt与骨形态发生蛋白2信号通路中相关因子的表达及细胞内分布有关。     

大鼠成骨细胞增殖及护骨素蛋白含量与甲状旁腺激素的调节效应

目的:体外观察甲状旁腺激素对大鼠成骨细胞增殖和护骨素分泌的调节作用。方法:实验于2005-06/2006-05在四川大学华西医院生物治疗国家重点实验室干细胞与组织工程研究室完成。采用酶消化法和骨组织块法联合分离培养新生SD大鼠颅骨成骨细胞,间歇加药方法将不同浓度0,10-6,10-7,10-8,10-9mol/L甲状旁腺激素作用于大鼠成骨细胞(0mol/L作为空白对照组),经碱性磷酸酶染色及钙结节茜素红染色证实培养的成骨细胞后,采用四甲基偶氮唑盐比色法检测细胞增殖能力,蛋白免疫印迹测定护骨素的分泌量。结果:①成骨细胞的形态变化:倒置相差显微镜下可见培养的成骨细胞呈短梭形、三角形和多边形。碱性磷酸酶染色光镜下可见成骨细胞胞浆中分布特征性蓝紫色细颗粒;成骨细胞的钙结节在镜下可见部分细胞聚集一起呈"集落状"生长。②成骨细胞增殖率:10-6～10-9mol/L浓度甲状旁腺激素对成骨细胞增殖均显示刺激作用,与空白对照组相比,差异显著(P<0.05),增殖率以10-8mol/L甲状旁腺激素组最高。③成骨细胞护骨素的表达:甲状旁腺激素下调成骨细胞中护骨素的分泌,与空白对照组相比,10-6mol/L甲状旁腺激素组抑制作用最明显(P<0.01),无显著剂量依赖性。结论:甲状旁腺激素对体外培养成骨细胞的增殖具有明显促进作用,通过下调成骨细胞中护骨素的分泌,促进破骨细胞生成、活化,促进骨吸收。