细粒棘球蚴细胞系培育及其免疫研究

从细粒棘球蚴病人体内获取生发层和原头节作为培养材料,采用改良DMEM培养液和胶原蛋白包被的培养瓶进行细胞培养,建立了适合人源细胞棘球蚴细胞体外培养的方法,并探讨棘球蚴细胞培养的刺约因素。首次成功培育出一株人源细粒棘球蚴细胞系（13G－5）,至1997年3月1日为止该细胞系已培养了140d,其间传了21代。该细胞系主要以成纤维型细胞为主,呈贴壁生长;用该细胞系细胞接种于昆明（km)小鼠胜利腹腔内,能形成具包囊样结构的类似包裹;接种鼠产生对囊液抗原的特异性抗体;ELISA能够检测出细胞代谢物中特异性抗原;该细胞系细胞和E.granulosus原头节、包裹液具有相同的EST酶带;使用该细胞系细胞的代谢物作为粗制抗原进行免疫预防接种,能使60％的Km小鼠获得安全抵抗E.granulosus感染的能力,该抗原能使43．33％－77．42％的包虫病诊断出来。此外,检定了人源细胞粒棘球蚴染色体,染色体数为14－18条,并首次对其进行了G－、C－带分析。     

细粒棘球蚴细胞系(13G-5)鉴定

:【目的】鉴定 13G 5细胞系细胞是否来源于细粒棘球蚴细胞。【方法】用不同代次的细胞系细胞接种Km小鼠腹腔 ,观察是否形成包囊或类似包囊 ,病理切片证实 ;用形成的包囊材料进行体外培养 ;测定接种小鼠的特异抗体效价 ;用酯酶同工酶鉴定细胞系。【结果】细胞系细胞在小鼠腹腔能形成包囊或类似包囊 ,病理切片观察包囊结构清楚 ,体外培养 ,未能见到细胞贴壁生长和活原头节 ,将培养悬液涂片 ,吉姆萨染色后镜检 ,只见到极少量细胞 (类似于生发层细胞 ) ,也未见到原头节。实验鼠抗体滴度的倒数为 32 0～ 5 12 0之间 ;酯酶同工酶检测结果 :细粒棘球蚴原头节、13G 5细胞系细胞、包囊液含有相同的酯酶同工酶谱 ,在同一位点出现相同的一条酶带。【结论】 13G 5细胞系来源于细粒棘球蚴细胞。     

昆明种小鼠棘球蚴病感染动物模型的建立

目的建立细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病小鼠的动物实验模型。方法 4周龄昆明种小鼠60只,分为细粒棘球蚴病组和多房棘球蚴病组(每组20只),并各设空白对照组(10只),均雌雄各半。分别腹腔注射人源细粒棘球绦虫原头蚴悬液或鼠源泡球蚴原头蚴混悬液0.2 mL(含庆大霉素250 IU.mL-1,原蚴头500个.mL-1),空白对照组腹腔注射0.2 mL,含庆大霉素250 IU.mL-1,PBS液。通过病检和腹外观察,了解小鼠包囊的生长情况、重量、数量、直径和不育囊率。结果两种包虫病的感染率均为100%。第350天剖杀细粒棘球蚴原头节感染的昆明小鼠,不育囊率为100%,所有细粒棘球蚴包囊内未见原头蚴,雌、雄小鼠体内包囊的直径和数量差别无统计学意义;而第90天剖杀的泡球蚴感染小鼠动物模型不育囊率平均为15%,85%的感染泡球蚴病灶内含原头蚴。雌、雄小鼠体内泡球蚴包囊的体积大小和重量差异有统计学意义(P<0.01)。结论雌鼠对多房棘球蚴感染比雄鼠更敏感,多房棘球蚴在小鼠体内生长快,适宜保种;雌鼠和雄鼠对细粒棘球蚴的敏感性无明显区别,细粒棘球蚴在小鼠体内生长慢,不宜保种。     

昆明种小鼠棘球蚴病感染动物模型的建立

目的建立细粒棘球蚴病和多房棘球蚴病小鼠的动物实验模型。方法4周龄昆明种小鼠60只,分为细粒棘球蚴病组和多房棘球蚴病组（每组20只）,并各设空白对照组（10只）,均雌雄各半。分别腹腔注射人源细粒棘球绦虫原头蚴悬液或鼠源泡球蚴原头蚴混悬液0．2mL（含庆大霉素250IU·mL^-1,原蚴头500个·mL^-1）,空白对照组腹腔注射0．2mL,含庆大霉素250IU·mL^-1,PBS液。通过病检和腹外观察,了解小鼠包囊的生长情况、重量、数量、直径和不育囊率。结果两种包虫病的感染率均为100％。第350天剖杀细粒棘球蚴原头节感染的昆明小鼠,不育囊率为100％,所有细粒棘球蚴包囊内未见原头蚴,雌、雄小鼠体内包囊的直径和数量差别无统计学意义;而第90天剖杀的泡球蚴感染小鼠动物模型不育囊率平均为15％,85％的感染泡球蚴病灶内含原头蚴。雌、雄小鼠体内泡球蚴包囊的体积大小和重量差异有统计学意义（P〈0．01）。结论雌鼠对多房棘球蚴感染比雄鼠更敏感,多房棘球蚴在小鼠体内生长快,适宜保种;雌鼠和雄鼠对细粒棘球蚴的敏感性无明显区别,细粒棘球蚴在小鼠体内生长慢,不宜保种。     

细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗诱导小鼠脾细胞增殖变化的研究

目的 探讨细粒棘球绦虫(Eg)重组双歧杆菌(Bb)-Eg95-EgA31疫苗免疫和Eg原头节攻击后小鼠的囊重抑制率及脾细胞增殖的变化.方法 将细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗分别采用皮下注射、肌肉注射、鼻腔内接种和口服灌胃4种途径免疫BALB/c小鼠,免疫后8周每鼠用50个Eg原头节攻击感染,感染后25周剖杀小鼠,分离细粒棘球蚴包囊并称重,计算囊重抑制率;取脾,分离脾细胞,用Eg粗抗原(EgAg)或刀豆素A(ConA)刺激培养,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测免疫小鼠脾细胞增殖反应,同时设有空载体、Bb和MRS对照.结果 以上4种疫苗接种组小鼠的囊重抑制率分别为45.33%、41.33%、70.67%和62.67%;疫苗接种组的脾细胞明显增殖:鼻腔内接种和口服免疫组的脾细胞增殖显著高于皮下和肌肉注射组.结论 细粒棘球绦虫重组Bb-Eg95-EgA31疫苗可诱导小鼠产生特异性的细胞免疫反应.     

细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因的克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）诊断抗原（diagnostic antigen）P-29基因并进行序列分析。方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA，根据GenBank公共数据库检索出细粒棘球蚴诊断抗原P-29基因的已知序列设计一对引物，通过RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因，将其重组到pGEM-T载体后进行序列测定和分析。结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因，测序表明该片段由717bp组成，与已发表基因核苷酸序列相比，同源性为100％，推导编码氨基酸序列同源性为100％。结论成功克隆细粒棘球蚴中国大陆株诊断抗原P-29基因序列，可做为包虫病重组抗原的候选基因。     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因分子克隆和序列分析

目的获得细粒棘球蚴（E.granulosus）亲肌肉基因（myophilin）序列并进行序列分析.方法从包虫病患者体内获取细粒棘球蚴原头蚴提取总RNA,根据GeneBank公共数据库检索出细粒棘球蚴亲肌肉基因的已知序列设计一对引物,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,将其克隆到pGEM-T载体,进行序列测定和分析.结果成功扩增出细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因,测序表明该基因为573bp;该基因序列与检索基因核苷酸序列相比,同源性为100%,推导编码氨基酸序列同源性为100%.结论测序的亲肌肉基因序列有完整的编码框,可做为包虫病重组抗原的候选基因.     

异源接种建立小鼠和兔包虫病动物模型的初步探讨

目的采用人工接种羊源细粒棘球绦虫原头蚴感染法建立小鼠与兔包虫病动物模型。方法 6周龄昆明小鼠经皮穿刺腹腔内接种羊源细粒棘球绦虫原头蚴悬液,新西兰大白兔于腹部手术后肝脏接种羊源细粒棘球绦虫原头蚴悬液。接种原头蚴6个月后剖检动物,观察小鼠腹腔和新西兰大白兔肝脏内包虫囊生长情况。结果接种羊源细粒棘球绦虫原头蚴6个月后,小鼠腹腔内包囊生成率为95%,新西兰大白兔肝内包囊生成率为50%。光镜观察见在小鼠腹腔和兔肝脏形成的囊泡具有与羊肝脏棘球蚴囊壁类似的类上皮细胞层和板层状结构。3种动物体内棘球蚴均有原头蚴。结论以羊源细粒棘球绦虫原头蚴悬液接种昆明小鼠腹腔和新西兰大白兔肝脏,可以建立小鼠和兔包虫病动物模型。     

细粒棘球蚴延伸因子-1基因的克隆、测序及特性分析

目的 对细粒棘球蚴（E.granulosus）翻译延伸因子（translation elongation factor）EF-1基因片段进行分子克隆及序列分析。方法 从细粒棘球蚴原头蚴中提取RNA,采用RT-PCR技术扩增出细粒棘球蚴EF-1基因片段,与pGEM-T载体重组并转化E.Coli JM109,经筛选扩增获得重组基因克隆,再进行序列测定和分析。结果 成功构建了EF-1／pGEM—T／JM109克隆体系,测序表明该基因开放阅读框为693bp,与已发表基因核苷酸序列相比,同源性为99％,推导编码氨基酸序列同源性为99％。结论 扩增获得的基因片段可能为细粒棘球蚴（E.granulosus）翻译延伸因子EF－1基因片段。     

细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列分析

【目的】获得细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,并进行序列分析。【方法】从包虫病羊体内获取细粒棘球蚴原头节 ,使用TRIZOL试剂提取总RNA ,逆转录成cDNA。根据E .granulosus抗原B亚单位基因的已知序列设计一对引物 ,采用RT PCR技术扩增出抗原B亚单位基因 ;将PCR产物纯化后用双脱氧链末端终止法进行序列测定 ,并进行序列分析。【结果】用RT PCR成功扩增出细粒棘球蚴抗原B亚单位基因序列 ,测序表明该基因ORF为 2 70bp ,和已发表基因核苷酸序列相比 ,缺失 3个碱基 ,同源性为 84 2 % ,推导编码氨基酸序列同源性为 77 8%。【结论】从E .granulosuscDNA扩增出抗原B亚单位基因 ,该基因编码 8ku亚单位前体蛋白。     

Echinococcus granulosus 14-3-3 protein: a potential vaccine candidate against challenge with Echinococcus granulosus in mice

Objective To investigate the protective immunity against Echinococcus granulosus in mice immunized with rEg14-3-3.Methods ICR mice were subcutaneously immunized three times with rEg14-3-3,followed by the challenge with Echinococcus granulosus protoscoleces intraperitoneally and then sacrificed after six months of post-challenge to detect the proliferation of splenocytes by MTT assay,and to measure the secretion of IL-2,IL-4,IL-10,and IFN -γ by ELISA.The rate of reduced hydatid cyst and the levels of IgE,IgG and IgG subclasses in sera were examined.Results Mice vaccinated with rEg14-3-3 and challenged with protoscoleces revealed significant protective immunity of 84.47％.ELISA analysis indicated that the immunized mice generated specific high levels of IgG and the prevailing isotypes of IgG were IgG1 and IgG2a,Splenocytes from mice immunized with rEg14-3-3 showed a significant proliferation response.The secretion of IFN-y and IL-2 increased significantly in the vaccinated mice whereas there was no significant difference in IL-4 and IL-10 levels between vaccinated and control mice.Conclusion The results indicate that the rEg14-3-3 vaccine could induce a high level of protective immunity as a promising vaccine candidate to prevent cystic echinococcosis.     

泡球蚴组织及囊液同工酶初步分析

应用 PAGE 法对多房棘球绦虫的泡球蚴囊液、全囊、原头蚴及囊壁组织的乳酸脱氢酶(LDH)、酯酶(EST)和酸性磷酸酶(AP)的同工酶进行了分析.结果 LDH 同工酶仅囊液与全囊各出现4条酶带.EST 同工酶全囊、囊液、原头蚴和囊壁分别出现14、17、3和13条酶带;而 AP 同工酶4种样品的酶带则分别是2、4、1和1条.3种同工酶的酶带数均以囊液样本为多且染色深,提示囊液可能是泡球蚴物质代谢的一个重要场所.     

几种化疗药物杀原头蚴的效果比较

离体试验0.062～0.25％新洁尔灭,0.125～O.25％醋酸,O.1～O.2％安替福民和0.05～0.2％麝香草酚溶液均具有较强的杀原头蚴作用。均在5～10分钟内可达到100％杀死原头蚴的效果,作用迅速可靠,毒性小。原头蚴与药液接触后可在2～3分钟内出现皮层起泡、起刺、皮层分离、溶解及虫体发暗、钙粒减少等形态结构变化,原头蚴经药液处理10分钟后,给小白鼠腹腔接种,均未发育成棘球蚴。原头蚴经10％甲醛和3％双氧水溶液处理10分钟,死亡率(染色法的着色率)分别为5.2％和O,用5％甲醛和1.5％双氧水溶液处理原头蚴10分钟后接种小鼠腹腔其感染率分别为16.6％和22.2％。     

An extremely large primary omental hydatid cyst: report of a rare case

Hydatid disease is a parasitic infection caused by Echinococcus granulosus (larval form) in humans with lesionsmost frequently encountered in the liver and lungs. It can rarely involve extra-hepatic organs. It is endemicin some regions of Iran. The omental hydatid cyst is a very rare manifestation of the disease. This report presentsthe interesting case of a very large omental hydatid cyst.     

细粒棘球绦虫(中国大陆株)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性研究

目的:探讨细粒棘球蚴(Eg)诊断抗原P-29重组蛋白的免疫保护性及其作为候选疫苗的潜在价值.方法:ICR小鼠随机分为蛋白免疫组和佐剂对照组,每隔2wk皮下免疫1次,在第3次免疫后2wk,用Eg原头蚴进行攻击感染,感染后20wk剖杀小鼠,检获棘球蚴包囊,计算免疫保护力,并用ELISA法测定血清中IgG及其亚型和IgE水平.结果:与佐剂对照组比较,蛋白免疫组小鼠的免疫保护力为96.6%;与免疫前比较,免疫后和攻击感染后蛋白免疫组小鼠血清IgG,IgG1,IgG2a和IgE水平均明显升高(P<0.05),IgG2b降低(P<0.05).结论:细粒棘球绦虫诊断抗原P-29重组蛋白能诱导小鼠产生一定的保护性免疫,是潜在的疫苗候选抗原分子.     

人体细粒棘球蚴接种小鼠体早期发育观察

人体肺或肝内棘球蚴的生发囊或原头蚴接种杂交小白鼠腹腔,最初可见游离的原头蚴周围有大量中性细胞及少数嗜酸性细胞,原头蚴结构模糊,生发囊外有明显的细胞反应带。如系存活的原头蚴其内部结构多集聚于一处,并有少数顶突钩,原头蚴可向不同方向形成有角质层外被的突起,突起可脱离原头蚴,形成有角质层的新个体,但未见内侧有生发层存在。     

骨桥蛋白在肝包虫动物模型外囊壁中的表达

目的:观察动物模型肝包虫囊壁情况,研究骨桥蛋白(Osteopontin,OPN)在小鼠肝细粒棘球蚴外囊壁中的分布特征及表达相关因素,并探讨其意义.方法:肝包虫动物模型的制作、HE染色观察、免疫组化观察53例小鼠肝细粒棘球蚴外囊壁中OPN及巨噬细胞的表达与分布.结果:HE染色外囊的着色明显较周围巨噬细胞带深,不存在渐变的过程;83%肝细粒棘球蚴外囊壁中有不同程度OPN表达,且集中分布于肝包虫纤维囊壁(外囊),与外侧巨噬细胞带比较有显著差异(P＜0.01).结论:在动物模型上证明了外囊与肝实质间存在可分离间隙,OPN主要分布在肝细粒棘球蚴外囊,并在其形成过程中起重要作用.