与内皮抑制素相互作用的蛋白及其抑制血管生成作用的分子机制

目的：探讨与内皮抑制素相互作用的蛋白，阐明其抑制血管生成作用的分子机制。方法：实验于2002-01／2004-12在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成。应用酵母双杂交系统3，以内皮抑制素为诱饵，筛选人肝cDNA文库，寻找与之相互作用的蛋白。再利用一对一酵母回复性杂交、β-GAL实验和生物信息学分析技术筛除假阳性克隆。结果：成功构建稳定表达内皮抑制素基因的载体；酵母双杂交共获得281个克隆，经验证，6个为阳性克隆，测序发现其中一个克隆为未知序列；FASTCAT试验发现阳性克隆中4个克隆可明显的与内皮抑制素相互作用。结论：6个阳性克隆表达的蛋白可能能与内皮抑制素相互作用，并不同程度的参与了内皮抑制素调节的血管生成过程。     

内皮抑制素相互作用蛋白HT036基因的全长克隆及其促血管上皮细胞凋亡的分子机制

目的:克隆与内皮抑制素(endostatin)相互作用蛋白HT036基因的全长,进一步验证其与内皮抑制素的相互作用,初步阐明其促血管上皮细胞凋亡的分子机制。方法:实验于2004-10/2006-03在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成。①根据已知HT036的EST序列设计引物,应用RACE技术,从人胎肝cDNA文库获取该基因全长。②采用免疫共沉淀和WesternBlot验证HT036蛋白与内皮抑制素在真核细胞内存在相互作用。③利用真核瞬时表达载体pCDNA3.1( )在EVC304细胞中瞬时表达HT036蛋白,转染了HT036基因的EVC304细胞为试验组(重复两次);没有转染HT036基因的细胞为对照组,用流式细胞仪检测HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响。结果:①HT036基因全长克隆及生物信息学分析结果:利用RACE技术成功获得HT036基因的全长,并在GENEBANK进行了注册,注册号AY775560。②免疫共沉淀和Western-blot的验证结果:证实HT036蛋白能与内皮抑制素在真核细胞中相互作用。③HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响:成功构建了表达HT036基因的真核表达载体,两次试验转染ECV304细胞后24h的凋亡率平均为23.63%,而对照组仅为0.10%。结论:获得了一与内皮抑制素相互作用的新的蛋白HT036基因的全长,初步表明HT036参与了内皮抑制素调节的血管生成过程,并对血管上皮细胞具有促进凋亡的作用。     

内皮抑制素相互作用蛋白HT036基因的全长克隆及其促血管上皮细胞凋亡的分子机制

目的：克隆与内皮抑制素（endostatin）相互作用蛋白HT036基因的全长，进一步验证其与内皮抑制素的相互作用，初步阐明其促血管上皮细胞凋亡的分子机制。 方法：实验于2004—10／2006-03在解放军总医院呼吸科实验室、军事医学科学院放射医学和生物工程研究所实验室完成。①根据已知HT036的EST序列设计引物。应用RACE技术，从人胎肝cDNA文库获取该基因全长。②采用免疫共沉淀和Western Blot验证HT036蛋白与内皮抑制索在真核细胞内存在相互作用。③利用真核瞬时表达载体pCDNA3．1（＋）在EVC304细胞中瞬时表达HT036蛋白，转染了HT036基因的EVC304细胞为试验组（重复两次）；没有转染HT036基因的细胞为对照组，用流式细胞仪检测HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响。 结果：①HT036基因全长克隆及生物信息学分析结果：利用RACE技术成功获得HT036基因的全长，并在GENEBANK进行了注册，注册号AY775560。②免疫共沉淀和Western—blot的验证结果：证实HT036蛋白能与内皮抑制素在真核细胞中相互作用。③HT036基因对细胞凋亡和细胞周期的影响：成功构建了表达HT036基因的真核表达载体，两次试验转染ECV304细胞后24h的凋亡率平均为23．63％，而对照组仅为0．10％。 结论：获得了一与内皮抑制紊相互作用的新的蛋白HT036基因的全长，初步表明HT036参与了内皮抑制索调节的血管生成过程，并对血管上皮细胞具有促进凋亡的作用。     

重组内皮抑制素抑制大鼠角膜移植术后的新生血管

目的:内皮抑制素是一种内源性血管内皮细胞的强效抑制剂,实验拟验证局部应用重组内皮抑制素滴眼液对大鼠角膜移植术后新生血管的抑制作用.方法:实验于2005-09/2006-03在重庆医科大学附属第一医院实验动物中心完成.①选用清洁级成年雌性SD大鼠(受体)60只,Wistar大鼠(供体)30只,建立大鼠同种异体穿透性角膜移植模型,供体提供双眼角膜,受体均选择右眼手术.移植术后按随机数字表法分成内皮抑制素组和对照组,分别用50mg/L的内皮抑制素眼液及赋形剂滴眼.②于术后1周、2周、3周、1个月及2个月5个时间点,麻醉后每组随机处死6只大鼠.观察角膜新生血管生长状况;比较各组角膜植片透明度、水肿、新生血管程度及移植排斥反应指数;检测角膜植片上内皮抑制素及血管内皮生长因子的表达情况.结果:60只受体大鼠全部进入结果分析.①内皮抑制素组大鼠角膜新生血管面积显著低于对照组(P＜0.05～0.01).②内皮抑制素组大鼠的排斥反应指数在术后1周、2周、3周、1个月及2个月均低于对照组(P＜0.05～0.01).③与对照组相比,内皮抑制素组角膜植片组织中内皮抑制素的表达明显增强(P＜0.05～0.01),血管内皮生长因子的表达明显降低(P＜0.05～0.01).结论:内皮抑制素滴眼液可以有效抑制大鼠角膜移植术后角膜新生血管的形成,下调角膜植片中血管内皮生长因子的表达,从而降低角膜移植术后免疫排斥反应的发生,为临床防治角膜移植术后新生血管提供了新的思路.     

利用酵母双杂交研究与Ca~(2 )CRAC通道Orail相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交等技术研究与CRAC通道蛋白Orail发生相互作用的蛋白质,从而揭示CRAC通道分子作用机制。方法:以Orail-C端为诱饵蛋白筛选大鼠海马和皮质cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,运用营养缺陷型培养,X-β-Gal蓝斑筛选等实验去除假阳性克隆,并通过GST-Pulldown体外实验验证其相互作用。结果:以Orai1-C端为诱饵最终筛出了几个阳性克隆,经测序分析,发现了其中一个感兴趣的蛋白。结论:Orail可以和该蛋白发生相互作用,其相互作用可能与CRAC通道功能调节有关。     

一个phiC31相互作用的蛋白:人锌指蛋白403功能分析

背景:phiC31是重要的基因治疗工具酶,其与细胞内蛋白的相互作用可能影响细胞内各种通路,从而关系到基因治疗的安全性.目的:构建锌指蛋白403基因原核表达载体,观察其在真核细胞的表达情况.设计、时间及地点:单一样本观察,于2007-10/2008-12在复旦大学遗传工程国家重点实验室完成.材料:大肠杆菌DH5a菌株及大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株均为实验室保存.方法:用pLexA-phiC31作为"诱饵",对人胎脑cDNA文库通过酵母双杂交进行筛查,分离阳性克隆.对锌指蛋白403基因构建原核表达载体并纯化鉴定.脂质体介导真核细胞进行转染并细胞定位观察.主要观察指标:锌指蛋白403的原核表达载体的构建、纯化及在真核细胞细胞质中定位的结果.结果:酵母双杂交进行筛查后分离61个阳性克隆中,有1个包含17号染色体17q12上的基因序列,其具有一个锌指结构,故名锌指蛋白403.成功构建了锌指蛋白403的原核表达载体,并纯化组氨酸标记的锌指蛋白403.在真核细胞中,构建了绿荧光融合载体,证明了此蛋白在细胞质中的定位.结论:实验结果发现了一个新的phiC31整合酶相互作用蛋白,成功构建了znf403基因的原核表达载体,znf403蛋白主要在细胞质中聚集和分布.     

利用酵母双杂交研究与Ca2+CRAC通道Orai1相互作用蛋白

目的:利用酵母双杂交等技术研究与CRAC通道蛋白Orai1发生相互作用的蛋白质,从而揭示CRAC通道分子作用机制.方法 :以Orai1-C端为诱饵蛋白筛选大鼠海马和皮质cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质, 运用营养缺陷型培养,X-β-Gal蓝斑筛选等实验去除假阳性克隆,并通过GST-Pulldown体外实验验证其相互作用.结果:以Orai1-C端为诱饵最终筛出了几个阳性克隆,经测序分析, 发现了其中一个感兴趣的蛋白.结论:Orai1可以和该蛋白发生相互作用,其相互作用可能与CRAC通道功能调节有关.     

血管生成抑制因子人内皮抑素基因的克隆与原核表达

目的:构建血管生成抑制因子人内皮抑素非融合蛋白大肠杆菌表达载体。方法:实验于2004-02/12在中山大学生命科学院医药分子生物学实验室完成,表达质粒由中山大学医药分子实验室保存,肝细胞来源于南方医科大学珠江医院引产胎儿肝脏。用反转录多聚合酶链反应得到人内皮抑素全基因,连接PGEM-T载体,在16℃下以进行16h连接反应,转化大肠杆菌DH5α,对所获克隆扩大培养,提取质粒经EcoRI,BamHI酶切鉴定。将带有插入片段的重组质粒命名为PGEM-Tendo。对其阳性克隆扩大培养,大量提取质粒,以T7,SP6为测序引物进行全自动正、反向测序确认。将PGEM-Tendo质粒及表达载体pBV220经EcoRI,BamHI酶切后定向连接,转化入大肠杆菌DH5α,聚合酶链反应鉴定阳性克隆,命名为pBV220-endo。将含pBV220-endo的DH5α工程菌在30℃小量培养,经42℃热诱导4h后收菌,对所收菌和诱导前细菌进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶。离心收集菌体并超声破碎,将超声后的上清液和沉淀进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果:反转录—聚合酶链反应获得内皮抑素基因含酶切位点约573bp,用EcoRI,BamHI双酶切,10g/L琼脂糖凝胶电泳上可见约为552bp的内皮抑素片段和约为3000bp的PGEM-T载体片段,说明内皮抑素已成功构建在PGEM-T载体上。经全自动正、反向测序,Genbank分析证实,所获得的552bp基因片段序列属于人内皮抑素功能区段基因,该基因的第471位氨基酸编码碱基由G突变为A,但编码的氨基酸都是精氨酸,经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,出现特异性蛋白质条带,大小与人内皮抑素蛋白大小相符合。非融合重组蛋白内皮抑素主要以不溶的包涵体形式表达,表达量为14.5%。结论:克隆的552bp的内皮抑素基因,经与GenBank中人胶原XVIIIcDNA中内皮抑素基因比较,基因序列基本一致,说明人内皮抑素基因在大肠杆菌中获得非融合表达,为应用内皮抑素进行抗血管生成基因治疗奠定了实验方法学基础。     

酵母双杂交系统筛选和验证与RARα-V相互作用的蛋白

目的 利用酵母双杂交技术筛选与RARα-V相互作用的蛋白,研究RARα-V的作用靶点及其生物学功能.方法 构建诱饵质粒pGBKT7-RARα-V,利用酵母双杂交技术从K562细胞cDNA文库中筛选与RARα-V相互作用蛋白的基因序列,并通过酵母回转试验与GST pull-down技术进行验证.结果 成功构建诱饵质粒,且没有毒性、渗漏和自激活现象;利用酵母双杂交技术筛选到16个能与RARα-V相互作用的蛋白质;经酵母回转试验得到8个阳性克隆;并经GST pull-down技术在体外验证了RARα-V与JTV-1蛋白的相互作用.结论 在细胞内RARα-V与多种蛋白有相互作用,白血病的发病机制可能与这些蛋白相互作用所致的生物学功能改变有关.     

肌肉生长抑制素前肽融合蛋白的重组表达及其抗萎缩活性的初步鉴定

目的:探讨“白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽”融合蛋白在抗肌萎缩中的作用.方法:首先将肌肉生长抑制素前肽基因第76位天冬氨酸对应的碱基突变为丙氨酸对应的碱基,获得了“突变型肌肉生长抑制素前肽”基因.再将该基因与大鼠白蛋白基因片段连接,克隆至酵母表达载体.利用酵母表达系统,重组表达“白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽”融合蛋白.纯化的重组蛋白用于尾悬吊大鼠的治疗实验.结果:大鼠经过21天的尾悬吊,后肢骨骼肌发生了明显的萎缩.注射“白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽”融合蛋白的尾悬吊大鼠,其后肢骨骼肌未发生萎缩.结论:重组表达的“白蛋白-突变型肌肉生长抑制素前肽”     

The characteristics of interpretation of results of analysis of protein amount in urine of pregnant women

The adequacy of implementation of present proteinuria diagnostic thresholds under examination of pregnant women was examined. The analysis was applied to all urine samples of pregnant women from December 2009 to March 20010. The amount of protein in urine was concurrently evaluated by turbidimetric analysis with sulfosalicylic acid, colorimetric analysis with pyrogallol red, "dry chemistry" technology (the diagnostic strips). It is established that the mentioned techniques of analysis of protein in urine provide independent results. The results of colorimetric analysis are characterized by better precision and adequacy. However, in case of pregnant women the diagnostic threshold of protein concentration should be shifted from 0.120 to 0.150 g/l.     

超声评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响

目的 探讨超声在评价放疗对颈动脉溃疡斑块形成的影响的价值。方法 回顾性收集经病理学证实为头颈部肿瘤、放疗前后的颈动脉超声资料以及其他基线资料完整的患者93例,比较放疗前后放疗侧颈动脉和非放疗侧颈动脉粥样硬化斑块和溃疡斑块的总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积。结果 放疗前后颈动脉超声检查的平均间隔时间为（6.1±1.9）年;放疗前放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积与非放疗侧比较差异均无统计学意义（P均>0.05）;放疗后放疗侧斑块总数量、平均内膜-中膜厚度、最大斑块面积、溃疡斑块的总数量、最大溃疡斑块的面积、最大溃疡口的面积均较非放疗侧加重,差异有统计学意义（P均<0.05）。结论 放疗可导致头颈部肿瘤患者颈动脉粥样硬化斑块的形成和进展,且斑块具有易损性特点。     

《中国内镜杂志》主编雷光华教授简介

雷光华男,1970年12月生,骨科学博士,一级主任医师,二级教授,博士生/后导师。国家"万人计划"领军人才,教育部"长江学者"特聘教授,科技部"中青年科技创新领军人才",国家卫生计生突出贡献中青年专家,享受国务院政府特殊津贴专家,国家临床重点专科骨科和运动医学学科带头人,全国青年岗位能手,湖南省"芙蓉学者"特聘教授,湖南省科技领军人才和骨科学科领军人才,湖南省普通高校学科带头人,湖南省首届"优秀科技工作者",中南大学"湘雅名医"。     

超声诊断主动脉窦瘤

本文报告31例主动脉窦瘤患者,全部用二维超声(2DE)和多普勒超声检查。其中手术治疗24例,超声符合22例,符合率为92％。误诊2例,误诊率为8％。故超声实际诊断主动脉窦瘤29例中右冠窦瘤18例(62％),无冠窦瘤7例(24％),二叶瓣型主动脉窦瘤4例(14％)。窦瘤破入/膨入右室和右房内的例数分别为16例和13例。本病主要的合并症为主动脉瓣关闭不全和室缺。通过分析我们认为二维加多普勒超声是诊断主动脉窦瘤最有价值的无创技术。