紫外线致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库

目的筛选紫外线致弱尾蚴中起免疫保护作用的抗原分子,分析其主要表位,为血吸虫病疫苗研究提供新的候选抗原。方法以紫外线照射致弱尾蚴免疫兔血清筛选日本血吸虫童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,并利用软件Antheprot对所筛基因编码的抗原分子进行表位预测。结果经三轮筛选,共获20个阳性克隆,序列同源性分析表明其中有5种已知基因(GST、副肌球蛋白、肌球蛋白、钙离子激活蛋白和3-磷酸甘油醛脱氢酶),6种未知基因,软件分析显示不同抗原分子分别具有多个不同的抗原表位。结论获得的阳性克隆插入基因片段可能为潜在的日本血吸虫病疫苗分子,可能是多抗原、多表位在照射致弱尾蚴中起免疫保护作用。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫cDNA文库

目的　采用自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库并寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。　方法　用感染日本血吸虫后的自愈水牛血清免疫筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,将阳性重组子克隆、测序,对核酸序列进行分析,确定目的基因。　结果　从大陆株日本血吸虫成虫λZAPIIcDNA文库筛到26个阳性克隆,经初步鉴定获3种编码蛋白分子的基因:副肌球蛋白,谷胱甘肽S转移酶,羟基类固醇脱氢酶。　结论　感染日本血吸虫后的自愈水牛血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,可用于寻找日本血吸虫疫苗新候选抗原。     

紫外线致弱童虫免疫家兔血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的　用致弱疫苗免疫血清、感染血清筛选文库获取新的日本血吸虫特异性未知抗原基因。　方法　用紫外线致弱童虫免疫兔血清、感染血清免疫筛选日本血吸虫成虫cD?鄄NA文库 ,对阳性重组子进行克隆、测序 ,利用软件对核酸序列进行分析 ,确定目的基因。　结果　筛选出 6种蛋白分子基因 :3-磷酸甘油醛脱氢酶 (GAPDH) ,丝氨酸蛋白酶抑制剂 (serpin) ,线粒体编码蛋白 ,肌球蛋白 (myosin)部分重链基因以及两个未知新基因。　结论　紫外线致弱疫苗免疫血清筛选cDNA文库为寻找新的抗血吸虫病疫苗提供了又一途径。     

旋毛虫感染鼠血清筛选日本血吸虫成虫cDNA文库

目的 探讨旋毛虫与血吸虫之间交叉免疫的分子机制,并寻找有效的日本血吸虫疫苗侯选分子。方法 以旋毛虫感染鼠血清为探针,筛选日本血吸虫成虫cDNA文库,对获得的阳性克隆插入片段进行PCR扩增。结果 共筛选出11个阳性克隆,其插入的cDNA片段大小在1．4－5．0kb之间,其中1．4kb片段2个,5．0kb片段9个。结论 获得的阳性在隆插入基因片段可能为编码旋毛虫与日本血吸虫共同的抗原基因,其表达产物可能有抗日本血吸虫感染的作用。     

日本血吸虫雄虫免疫血清对成虫cDNA文库的筛选及克隆分析

目的　筛选和分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新基因 ,为血吸虫疫苗研究提供新的候选分子。 方法　以日本血吸虫雄性成虫抗原免疫兔血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对阳性克隆的插入片段进行PCR鉴定及测序分析。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白的结构与功能。结果　筛选获 11个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 7～ 2 3kb之间。对部分阳性克隆进行测序分析 ,获两个Sj新基因 ,即Sj-MA及Sj -Cp8(登录号分别为AF5 1980 8和AF5 2 4 896 ) ,分别编码 2 4 9和 71个氨基酸的核内蛋白和胞浆蛋白。Sj-MA蛋白含有 9个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N -肉豆蔻酸化位点。Sj-Cp8蛋白含一个跨膜区、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、2个N -肉豆蔻酸化位点。结论　筛选Sj成虫cDNA文库所获得两个新基因 ,其编码的蛋白可能为存在于胞浆和胞核内的日本血吸虫的重要信息传递分子 ,有望成为新的血吸虫病疫苗候选分子。     

日本血吸虫抗原表位编码基因重组质粒的高效构建与鉴定

目的探索用一种新方法—胶内连接法,快速构建日本血吸虫抗原表位编码基因重组表达载体,高效克隆及表达日本血吸虫抗原表位,用于疫苗候选分子的筛选。方法将pUMCV质粒载体用SalI和EcoRI双酶切,酶切产物于低熔点胶中电泳,紫外灯下割取含酶切载体的条带。取一定量割取的低熔点胶,直接将其与合成的单个抗原表位编码基因或者是两个不同抗原表位编码基因进行连接。连接产物转化感受态菌DH5α。挑选阳性克隆进行双酶切、电泳及测序鉴定。结果单个抗原表位或两个不同的表位编码基因被成功地插入真核表达载体。结论采用胶内连接法直接在低熔点胶存在的条件下进行插入基因片段与质粒载体的连接,快速高效地获得了多个单一或组合抗原表位编码基因重组质粒,为进一步筛选日本血吸虫疫苗分子奠定了基础。     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的　从日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因 ,为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。　方法　构建日本血吸虫成虫cDNA文库 ,用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序 ,对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA ,并进行生物信息学分析和登录。　结果　获得了 1个日本血吸虫新基因 ,全长 14 3 9bp ,编码 44 3个氨基酸 ,与肝片形吸虫微管蛋白基因具有 79%的同源性。编码蛋白的理论分子质量为 7.2 198ku ,等电点为 9.12 ;抗原表位可能位于cDNA序列 3 73～ 3 96处。　结论　表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果获得了1个日本血吸虫新基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子质量为7．2198ku，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

日本血吸虫尾蚴抗原免疫血清筛选成虫cDNA文库与新基因分析

目的　筛选与日本血吸虫尾蚴抗原有共同免疫原性的日本血吸虫成虫抗原分子,为血吸虫病诊断和疫苗研究提供新的候选分子。　方法　利用日本血吸虫尾蚴可溶性抗原免疫兔血清筛选日本血吸虫(Schistosomajaponicum,Sj)成虫cDNA文库,对阳性克隆的插入片段进行PCR扩增和序列分析。　结果　共筛选出13个阳性克隆,PCR扩增出特异的插入片段。测序分析获4个新基因SjCAI、SjCA、SjCAI2和SjCAI3(登录号分别为AF495883、AF515834、AY118086和AY129303),分别编码353、161、137和72个氨基酸的蛋白。SjCAI蛋白含6个DNA结合锌指,与原肠胚锌指蛋白XLCGF48.2有一定同源性;SjCA蛋白、SjCAI2蛋白和SjCAI3蛋白含N糖基化和磷酸化位点。　结论　筛选Sj成虫cDNA文库获得了新的基因序列。     

日本血吸虫三个新跨膜蛋白基因的克隆和分析

目的　克隆并分析日本血吸虫 (Schistosomajaponicum ,Sj)新的抗原基因 ,为血吸虫病防治提供有效的疫苗候选分子。方法　以旋毛虫感染鼠血清为探针 ,筛选Sj成虫cDNA文库 ,对获得的阳性克隆进行PCR鉴定及测序。通过互联网对测序获得的核苷酸序列进行同源性分析 ,并预测新基因编码蛋白质的结构与功能。结果　共筛选出 9个阳性克隆 ,其插入SjcDNA片段大小在 0 .6～ 2 .1kb之间。测序分析获 5个新基因 ,其中Sj Ts1,Sj Ts3及Sj Ts5 (登录号为AY0 0 5 816 ,AF2 990 80 ,AY0 2 4 35 2 )分别编码 83,83,2 33个氨基酸组成的跨膜蛋白。Sj Ts1蛋白含 1个潜在的跨膜区 ,2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。Sj Ts3蛋白含两个跨膜区 ,1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点。Sj Ts5蛋白为具有 5个跨膜区的跨膜蛋白 ,含 1个N 糖基化位点、2个cAMP与cGMP依赖的蛋白激酶磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和 1个N 肉豆蔻酸化位点。结论　Sj Ts1、Sj Ts3与Sj Ts5基因编码的蛋白质均为受磷酸化激活控制的跨膜蛋白 ,可能为潜在的血吸虫病疫苗候选分子     

东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫童虫cDNA文库及新基因分析

目的获得日本血吸虫病新的候选疫苗分子。方法用对日本血吸虫具有天然抗性的东方田鼠血清免疫筛选日本血吸虫肝期童虫cDNA文库，阳性克隆转入E．coliBM25．8环化成质粒，抽提质粒DNA，EcoRⅠ和Hind Ⅲ双酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，插入片段进行核苷酸序列测序，并进行生物信息学分析。结果共获得12个不同的基因，插入片段长度为300～1100bp，其中2个具有完整的开放阅读框，为日本血吸虫新基因，命名为sj—sMf1和sj—sMf2，分别编码93个和61个氨基酸。前者含有cAMP磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点各1个，后者含有1个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和2个蛋白激酶c磷酸化位点。结论用东方田鼠血清作为探针筛选到2个日本血吸虫新基因。     

Mago nashi:一个日本血吸虫性别决定基因的发现与鉴定

目的　运用免疫学方法筛选日本血吸虫 (中国大陆株 )童虫cDNA文库 ,寻找血吸虫新基因 ,并克隆和鉴定一个日本血吸虫决定性别的Magonashi样蛋白基因。方法　用混合的血吸虫感染者血清免疫学筛选日本血吸虫童虫cDNA文库 ,随机挑取阳性重组克隆进行测序 ,以获得血吸虫基因 ,并通过BLAST程序进行比较及同源性分析 ,根据分析结果设计合成引物 ,用PCR法扩增出日本血吸虫Magonashi样蛋白基因 (SiM)编码序列 ,将其克隆入pGEM T载体和 pBKCMV载体 ,用双酶切、以质粒为模板进行PCR扩增和测序进行鉴定。结果　本研究共挑取 7个阳性克隆 ,通过测序获得了 5个有表达序列标签(ExpressedSequenceTag .EST)价值的序列 ,并进行了同源性分析 ;用PCR法扩增出大小为 4 4 1bpSjM开放阅读框 ,重组质粒pGEM SjM和 pBKCMV SjM经双酶切均可获得一条为PCR产物一致的DNA片段。 结论　本实验获得了 5个有EST价值的序列 ,并成功地克隆了其中SjM编码基因。     

噬菌体表达的短肽模拟蚯蚓与日本血吸虫共同表位研究

目的采用噬菌体呈现技术,获得蚯蚓与血吸虫的共同表位。方法依次以日本血吸虫病患者血清(SjIg)、蚯蚓免疫兔血清(LtIg)和LtIg、SjIg作为靶分子,以噬菌体12肽库的第三轮扩增肽库为源肽库,进行2轮吸附-洗脱-扩增免疫筛选。每轮随机挑取蓝色噬菌斑各21个,用ELISA方法检测其抗原性,并对其反应性较好的阳性克隆进行测序。结果获得4个阳性克隆可与SjIg、LtIg较好的结合。得到3个阳性克隆的氨基酸序列,它们有蚯蚓与血吸虫共同的线性表位。结论结果说明,从12肽库筛选蚯蚓与寄生蠕虫抗原共同表位是可行的,同时也为获得寄生蠕虫共同抗原提供了一条新的途径。     

Protective immunity induced by phage displayed mitochondrial related peptides of Schistosoma japonicum

New antigens and strategies are necessary for vaccine development against schistosomiasis japonica. Using a pool of 43 high titred anti-SWA sera from individuals residing in an Schistosoma japonicum endemic area of China, we have cloned a S. japonicum gene by cDNA library screening. The recombinant Sj338 protein has 44-46% identity to a mitochondrial precursor receptor protein of humans and rats. Immunization of mice with the recombinant Sj338 conferred 27-32% (p<0.01) reduction in worm burdens following cercarial challenge. In an effort to identify protective epitopes in Sj338 and increase the level of protection, we screened a random 12-mer peptide library constructed in M13 using a polyspecific anti-Sj338 rabbit serum. After five rounds of biopanning, we identified 30 reactive clones consisting of 11 distinct peptide sequences. These clones shared limited primary sequence homology with the recombinant Sj338 protein. Anti-sera raised against these phage clones recognized recombinant Sj338 and SWAP by Western blot. In murine vaccination experiments using whole recombinant phage without adjuvant, four of these clones demonstrated worm reductions of 11.6-25.1% (p=ns - 0.05) compared to M13 vaccinated animals. Animals vaccinated with all four of these phage demonstrated 34.2% (p<0.01) worm reduction compared to controls vaccinated with M13 clone. These data suggest that mimotope peptides are potential vaccine candidates for S. japonicum.     

日本血吸虫辐照尾蚴模拟表位的筛选和初步鉴定

目的从噬菌体表面显示随机肽库中筛选日本血吸虫辐照尾蚴抗原模拟表位。方法用Sepharose4B亲和层析法,从日本血吸虫辐照尾蚴免疫鼠血清中纯化抗体,经正常血吸虫尾蚴抗原吸收后,用于12肽噬菌体随机肽库的免疫筛选。经三轮筛选,随机挑取20个噬菌体克隆,经DNA序列分析后,对各独立表位进行免疫学鉴定。结果DNA序列分析,获得4个有序列重复的噬菌体克隆;Dot-ELISA分析显示,4个克隆均能被辐照尾蚴免疫血清中IgM型抗体识别,反应强度有一定差别;P1和P2克隆还能被IgG型抗体识别。结论从噬菌体随机肽库中成功筛选到日本血吸虫辐照尾蚴抗原模拟表位。     

利用噬菌体展示技术筛选日本血吸虫模拟抗原表位

目的　从噬菌体肽库筛选日本血吸虫抗原模拟抗原表位。方法　制备亲和纯化的日本血吸虫病人血清抗体 Ig G,用此 Ig G包被酶标板对 12肽库进行反复淘选 ,对获得的目的噬菌体进行鉴定及免疫原性分析。结果　获得一批阳性噬菌体克隆 ,其中一部分与血吸虫病人血清反应产生较高的吸光值 ,Western blotting分析表明这些噬菌体能被血吸虫病人血清所识别 ,具有类似于血吸虫抗原的免疫原性。结论　获得一批具有模拟日本血吸虫抗原表位的噬菌体克隆 ,为今后进一步研究它们在血吸虫病诊断及疫苗研究中的作用奠定了基础。