紫外交联实验筛选HCV RNA结合蛋白的应用

目的 选择一种用于筛选与丙型肝炎病毒（HCV）RNA核心区结合的细胞蛋白质分子较佳方法。方法 用体外转录的方法制备地高辛标记（DIG）-HCV RNA；从HepG2细胞中提取细胞蛋白质分子。分别用紫外交联实验（UV）和凝胶迁移实验（EMSA）筛选HepG2细胞中可与HCV RNA结合的蛋白质分子。结果 2种实验方法均可检测到细胞蛋白质分子与HCV RNA结合。但凝胶迁移实验结果所见DIG—RNA信号比较弥散，而紫外交联实验的结果可见比较清晰的RNA-结合蛋白条带。结论 紫外交联实验是用于筛选HCV—RNA结合蛋白的首选方案。     

非甲非乙型肝炎中丙型肝炎病毒核酸序列的测定

丙型肝炎病毒(HCV)cDNA克隆在酵母中的表达,已建立了检测抗-HCV的方法,但还没有敏感的试验用于临床检测HCVRNA。本文根据HCV cDNA克隆36和37b的核苷酸序列建立了一种敏感的,半定量性的cDNA/聚台酶链反应(cPCR)法,可用于检测肝脏、血浆或血清中的HCV RNA。下面报告几例病人和黑猩猩临床标本的HCV RNA和抗-C100-3的检测结果。     

PCR系统制备地高辛标记的探针检测脊髓灰质炎病毒核酸

笔者应用聚合酶链反应（PCR）合成系统，以逆转录的SabinⅠ、Ⅱ、Ⅲ型病毒cDNA为模板，在反应液中加入标记的Dig-dUTP，经扩增制备了地高辛配基标记的脊髓灰质炎病毒cDNA探针、该法比PCR扩增产物后，电泳，片段回收到标记、提纯，常需3天。结果比较PCR技术直接制备地高辛标记cDNA探针方便，快速，标记率高，用于型别鉴定比中和试验快，敏感，特异性强等优点。     

硫化镍与苯并芘转化人支气管上皮细胞基因差异表达谱的研究

目的用cDNA微阵列技术探讨经硫化镍(NiS)与二羟环氧苯并芘(dihydroxyepoxy benzo pyrene,BPDE)转化后的人支气管上皮细胞(16HBE)基因的差异表达;以了解不同种类和性质的化合物在转化细胞及致癌分子机制方面的异同;为预防人类生存环境不同外来化合物对人类健康的危害和影响提供科学依据.方法取16HBE分为NiS处理组,BPDE处理组和16HBE(对照组)三组同步培养,传代至第35代;提取三种细胞的总RNA,逆转录合成cDNA并以Cy3-dCTP和Cy5-dCTP荧光素分别标记制作探针.探针混合后与含4000个人类基因的芯片杂交.以ScanArray 4000扫描仪扫描芯片,以GenPix Pro3.0软件分析荧光信号,对三组差异表达的基因进行生物学信息分析.结果 NiS转化的16HBE细胞与BPDE转化的16HBE细胞经分析比较,呈现差异表达的基因有22个,其中11个(50%)下调,另11个(50%)上调.结论 NiS与BPDE对16HBE细胞株的转化作用在抑癌基因,细胞周期蛋白相关基因,细胞凋亡和应激反应基因相关基因,DNA合成、修复和重组蛋白相关基因,DNA结合、转录和转录因子类基因,细胞受体相关基因,代谢相关基因,蛋白翻译和合成相关基因等多类基因上呈现差异表达.认为基因芯片技术在筛选不同种类和性质的化合物转化细胞相关基因的改变上,具有高通量、高敏感、快速等特点,对化合物在细胞、分子毒作用和致癌机制的研究中意义重大.     

应用cDNA文库法制备HCV-1诊断芯片探针

目的 探讨利用cDNA文库法制备丙型肝炎(HCV-1)诊断基因芯片探针的可行性。方法 用限制性内切酶Sau3AI消化HCV1a及1b全长cDNA，所得的酶切片段72℃补平加A，AT克隆，PCR初步鉴定，并测序。结果 HCV两个亚型1a、1b的全长cDNA得到57个大小相对一致(200-1000bp)的片段，平均每个亚型约28个，PCR及序列分析表明，所扩增的片段均属于HCV-1的特异基因，可做为HCV-1诊断基因芯片探针。结论 利用cDNA文库法收集片段是一种快速、简便制备芯片探针的实用方法。     

用地高辛配基(Digoxigenin)标记的cDNA探针检测登革热病毒

用随机引物法将地高辛标记克隆于PDW79和PDW75质粒中的登革Ⅱ病毒cDNA,以碱性磷酸酶偶联体系检测地高辛-cDNA及其产物,显色灵敏度近0.1pg,感染的Den·v的细胞抽提液和登革患者血清中病毒RNA液的最高稀释度分别为1/320和1/160—320。本文报告的地高辛-cDNA探针不仅快速检出登革热病毒,而且还可以作型別鉴定,是值得推荐的新方法。     

迁移率改变法检测核转录因子-κB实验参数的建立

目的建立迁移率改变法检测核转录因子-κB实验参数,为准确检测核转录因子-κB奠定基础。方法分子探针标记,细胞的分离、培养和核转录因子的提取,NF-κB聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果实验条件为300V,电泳18分钟后,对分子探针活性没有影响,分子探针与核转录因子结合特异性良好,电泳条带清晰。结论本文建立的方法省时、简便,敏感性高、特异性强。     

对献血者筛查HCV RNA必要性与可行性探讨

目前国内采供血机构以检测抗HCV抗体筛查献血者HCV感染,但因抗HCV抗体检测试剂存在一定漏检率,单纯依靠改进酶标试剂已很难达到要求;此外,HCV感染存在“窗口期”,是安全输血的极大隐患,而HCV RNA是诊断HCV感染最可靠和直接的证据。为此,我们以荧光探针定量聚合酶链反应(FQ—PCR)用于无偿献血者的筛选,结果如下。     

用HCV的标记核苷酸序列检测人血清和血浆中的病毒RNA

为了检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA,作者对在全世界病毒分离物中保存良好的病毒基因组中的核苷酸序列,即一种标记HCV核苷酸序列作了鉴定.作者发现在不同地区获得的标本中,HCV的被称为5'一未转译(SPUT)区的核酸序列有98     

微囊藻毒素-LR特异性RNA配基体外筛选探讨

目的利用大容量寡核苷酸库筛选富集具有分子识别、能与微囊藻毒素LR特异结合的RNA配基。方法将一段中间为40个随机核苷酸排列、两端为恒定区域的DNA库转录成RNA随机库,然后将RNA随机库与共价结合在琼脂糖上的微囊藻毒素LR反应、洗脱、收集能与靶分子特异结合的微量RNA,反转录为cDNA,PCR扩增。如此重复,经13轮筛选富集,再对筛选核酸配基克隆、测序,进一步比较各克隆RNA配基的亲和性。结果能与靶分子特异结合的微量RNA经过每轮筛选逐步增加,到第11～13轮进入平台期;60个克隆产物中有38个成功测定序列和分析,将其分成3组5对,所有克隆序列中未发现组间共有保守序列。选择有代表性的克隆RNA配基,比较其对靶分子的亲和力,克隆RNA配基MC1、MC25、MC17和MC32对靶分子微囊藻毒素LR具有较高的亲和力;他们与不同浓度系列的靶分子反应,经数学模型外推克隆MC1、MC25、MC17和MC32RNA配基以及RNA随机库对微囊藻毒素LR的解离常数值分别为84、46、57、91和>256μmol/L,其中MC25检测微囊藻毒素LR最低下限至少可达05μmol/L。结论从大容量RNA随机库中分离富集到一类能够识别并特异性结合微囊藻毒素LR的配基,为研究与检测环境中藻类毒素提供了一种新的手段。     

对套式多聚酶链反应检测丙型肝炎病毒核酸效果的评价

用套式多聚酶链反应和普通ＰＣＲ法检测丙型肝炎病毒核酸比较。ＮＰＣＲ溴化乙锭染色法结果与＾Ｐ标记探针核实结果完全一致，无漏检，也无假阳性，可不用＾Ｐ标记探针核实。ＮＰＣＲ法的敏感性为普通ＰＣＲ溴化乙锭染色法的２倍，为普通ＰＣＲ加探针法的１．１７倍。     

丙型肝炎病毒3''非编码区终止密码子变异

目的 探讨中国大陆1b型丙型肝炎病毒（HCV）3’非编码区（3’UTR）一级结构的变异规律，为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制、开发新的抗HCV药物奠定基础。方法 利用逆转录套式聚合酶链反应（RT—PCR）限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）初步筛选出1b型HCV感染者，采用半套式RT—PCR法扩增出约400bp的cDNA片段，克隆测序。结果 获得了全长1b型HCV3’端序列，发现终止密码子存在两种突变，由TGA突变为TAA或TGG，从而丧失了终止密码子功能，可导致Ns5B的翻译不能及时终止。结论 中国大陆1b型丙型肝炎病毒终止密码子存在多种突变，其中TGG突变可导致NS5B区延长，3’UTR缩短；该发现对了解HCV的复制和翻译机制可能有一定的理论和实践意义。     

丙型肝炎病毒3′非编码区终止密码子变异

目的探讨中国大陆1b型丙型肝炎病毒(HCV)3'非编码区(3'UTR)一级结构的变异规律,为进一步研究其在HCV复制、翻译中的调控机制、开发新的抗HCV药物奠定基础。方法利用逆转录套式聚合酶链反应(RT-PCR)限制性内切酶长度多态性分析(RFLP)初步筛选出1b型HCV感染者,采用半套式RT-PCR法扩增出约400 bp的cDNA片段,克隆测序。结果获得了全长1b型HCV 3'端序列,发现终止密码子存在两种突变,由TGA突变为TAA或TGG,从而丧失了终止密码子功能,可导致NS5B的翻译不能及时终止。结论中国大陆1b型丙型肝炎病毒终止密码子存在多种突变,其中TGG突变可导致NS5B区延长,3'UTR缩短;该发现对了解HCV的复制和翻译机制可能有一定的理论和实践意义。     

丙型肝炎病毒逆向点杂交基因分型方法的建立及初步应用

目的 利用逆向点杂交技术建立丙型肝炎病毒(HCV)基因分型新方法。方法在HCV5’端非编码区(5’UTR)设计引物与分型探针，将活性氨基标记的分型探针依次固定在尼龙膜上，制成HCV基因分型逆向点杂交检测膜条。分离纯化血清中的HCV RNA，经逆转录反应和生物素标记引物聚合酶链反应(PCR)巢式扩增后，将扩增产物与检测膜条杂交，过氧化物酶和四甲基联苯胺显色，判断基因分型结果。最后，通过与基因测序结果比较确定新方法的有效性。从佛山地区丙型肝炎患者中随机抽取60份经荧光定量PCR方法对HCV RNA进行过定量分析的血清，用新建方法进行HCV基因分型检测。结果新建HCV逆向点杂交基因分型方法可对所有60份HCV RNA拷贝数在10。～10。／ml之间的抽检血清进行基因分型，发现1b型50例，占83．3％；1a型2例，占3．3％；2a型2例，占3．3％；1a、1b混合型5例，占8．0％；1b、2a混合型1例，占1．7％；未发现2b、3a和3b型。新方法基因分型结果与测序分型结果一致。结论PCR一逆向点杂交技术可以准确有效和简便经济地进行HCV基因分型．适用于临床检测与流行病学研究。在佛山地区人群中感染的HCV以1b型为主。     

人白血病抑制因子在果蝇细胞S2中的表达

目的 克隆人白血病抑制因子基因并将其在果蝇细胞中表达.方法 以人6w胚胎绒毛的总RNA为模板,利用RT-PCR方法扩增人白血病抑制因子cDNA,测序后将其克隆到真核表达载体C,经电穿孔法将构建的重组人白血病抑制因子质粒转染果蝇细胞S2,48h后用免疫斑点法检测人白血病抑制因子的瞬时表达情况.结果 从人早孕胚胎组织获得了长度为543bp的白血病抑制因子cDNA片段,新构建的人白血病抑制因子真核表达载体中,有人白血病抑制因子cDNA的正确插入,转染人白血病抑制因子cDNA的S2细胞培养上清中含有人白血病抑制因子蛋白.结论 成功地构建了人白血病抑制因子真核表达载体,人白血病抑制因子可在果蝇细胞中呈分泌性表达.     

维持性血透患者丙型肝炎病毒感染的调查及危险因素探讨

目的对本院４８例维持性血透（ＨＤ）患者丙型肝炎病毒感染状况进行调查,并对其危险因素进行分析。方法采用第二代抗体检测试剂检测４８例ＨＤ患者ＨＣＶ抗体,另外采用ＲＴ－ＰＣＲ法检测患者血清中ＨＣＶＲＮＡ。同时测定肝酶ＡＬＴ。结果ＨＣＶ抗体阳性率为３５％,所有ＨＣＶ抗体阳性患者的血清中均检出ＨＣＶＲＮＡ,而ＨＣＶ抗体阴性患者的血清中有７例检出ＨＣＶＲＮＡ。血清ＡＬＴ水平的升高与ＨＣＶＲＮＡ的存在并不总是相关,１７例ＨＣＶ抗体阳性且ＨＣＶＲＮＡ阳性的患者中仅１０例血清ＡＬＴ水平轻度升高。具有输血史的患者在ＨＣＶ抗体阳性组中所占的比例明显大于在ＨＣＶ阴性组中所占的比例。结论输血仍是引起ＨＤ患者ＨＣＶ感染的重要原因,ＨＣＶ抗体阳性率与ＨＤ患者透析时间有关,提示血液透析单位可能存在ＨＣＶ的医院感染     

不同混合方式检测丙型肝炎病毒核酸的研究

目的　研究不同混合方式检测丙型肝炎病毒核酸含量 (HCVcDNA)的方法。方法　以未混合标本为对照 ,使用荧光定量PCR(FQ PCR)技术研究提取阶段混合 ,反转录阶段混合以及提取和反转录阶段均混合等不同实验条件下的HCVcDNA含量。结果　提取阶段混合组的HCVcDNA含量与对照组相比未见显著性差异 (P >0 0 5 ) ;反转录阶段混合组以及提取和反转录阶段均混合组的HCVcDNA含量低于对照组 (P <0 0 5 ) ,且在低浓度时出现假阴性结果。阴性标本在提取阶段混合未见假阳性。结论　在对混合血清进行HCVcDNA测定时 ,应将混合安排在提取阶段 ,不宜为增大混合标本数而在提取和反转录阶段均混合。     

丙型肝炎病毒基因分型及核心区序列同源性分析

目的 研究不同地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）基因型构成及基因变异。方法 ＨＣＶ感染血清６４份分别采自中国河南省（２５份）和河北省（１８份）,以及瑞典（１１份）和德国（１０份）,分别进行ＨＣＶ ＲＮＡ和基因型检测,对１１株ＨＣＶ分离株核心区基因序列进行测定,并用软件分析各地域ＨＣＶ核心区基因序列的同源性。结果 从中国两省和欧洲两国分离的ＨＣＶ基因型构成不同,在我国血清标本中发现１ｂ和２ａ亚型,在瑞典和