同源型凝血活酶试剂检测重组人野生型和突变型凝血因子Ⅶ

遗传性凝血因子Ⅶ（FVⅦ）缺乏症患者血浆中FⅦ凝血活性降低，出现不同程度的出血倾向。早先我们报道了遗传性FⅦ缺乏症2个家系患者的FⅦ基因存在Cys329Gly错义突变。为了研究该突变对FⅦ的功能影响，我们将野生型FⅦ和Cys329Gly突变型真核表达载体转染BHK-21细胞进行体外表达，并用自制同源型凝血酶原试剂[0]对表达产物进行凝血活性的检测。     

凝血因子Ⅶ C329G突变导致遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症

目的探讨遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症发病的分子机制。方法将野生型和C329G突变型的FⅦ真核表达载体转染BHK-21细胞进行体外表达,并对表达产物进行免疫学和凝血活性检测。结果FⅦC329G突变后,其蛋白的合成和分泌不受影响,突变型与野生型FⅦ的表达量相近,但突变型FⅦ无凝血活性。结论FⅦ第329位的半胱氨酸对其凝血活性功能起关键作用。当它被甘氨酸替换后,即丧失其凝血活性,此为FⅦC329G突变导致遗传性凝血因子Ⅶ缺乏症发病的分子机制。     

重组人凝血因子Ⅶ的纯化与鉴定

目的建立重组人凝血因子Ⅶ(rhFⅦ)的纯化方法。方法首先将制备并纯化的单克隆抗体与CNBr-Sepharose 6B Fast Flow介质偶联,制备单克隆抗体亲和层析柱,并用rhFⅦ标准品验证层析柱的层析效果;采用DE-AE-Sephadex A-50吸附细胞表达的上清,对吸附产物用Sephadex G-25脱盐柱做脱盐处理;然后用单克隆抗体亲和层析柱做亲和层析;通过SDS-PAGE、Western Blot等试验测定纯化产物的纯度;通过凝血酶原时间(PT)测定纯化产物的促凝活性。结果制备出rhFⅦ单克隆抗体亲和层析介质;细胞表达产物经DEAE-Sephadex A-50、Sephadex G-25脱盐和亲和层析纯化后,经SDS-PAGE鉴定获得了分子量为50kD的单一蛋白洗脱峰;纯化所获得的重组蛋白具有促凝活性,促凝时间(DT)为52s。结论建立了纯化rhⅦ的亲和层析方法 ,为rhFⅦ的研制奠定了基础。     

转染鼠脂肪干细胞用于血友病A基因治疗的可能性实验

目的:探索表达载体含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒能够成功转染脂肪干细胞作为血友病A基因治疗靶细胞的可能性。方法:实验于2004-01/06在武汉大学医学院病理生理学实验室完成。先将重组质粒表达载体含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒扩增、纯化和鉴定。取大鼠的腹腔和肾后脂肪组织,分离出脂肪干细胞。当培养细胞生长至80%融合时,将重组质粒表达载体和阳离子脂质体Lipofectamine转染试剂以0.5∶1,1∶1,1.5∶13种不同的质量比混合后转染大鼠的脂肪干细胞。培养36h后分别采用比色法和半定量多聚酶链式反应方法检测培养细胞上清中人凝血因子Ⅷ的凝血活性和脂肪干细胞的外源基因转化效率。结果:①转化效率结果:质量比为1.5∶1时转染效率比质量比为0.5∶1时约高5%,质量比为1∶1时转染效率最高,约比质量比为0.5∶1时高50%。②转化36h后检测脂肪干细胞上清中的人凝血因子Ⅷ活性的结果显示:表达载体与阳离子脂质体质量比为0.5∶1时,人凝血因子Ⅷ活性为0.2%;表达载体与阳离子脂质体质量比为1∶1时,人凝血因子Ⅷ活性为1.6%;表达载体与阳离子脂质体质量比为1.5∶1时,人凝血因子Ⅷ活性为0.4%。没有表达载体转染的脂肪干细胞上清中人凝血因子Ⅷ活性为0;正常人凝血因子Ⅷ活性为50%～180%。结论:外源基因含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒能成功转染鼠脂肪干细胞,而且转化后的细胞能够表达人凝血因子Ⅷ,但表达的人凝血因子Ⅷ活性不高,这可能与本次实验中质粒的纯度不高、转染效率不高和其他原因有关。     

DKK1真核表达质粒的构建及表达产物鉴定

目的构建人DKK1基因的真核表达质粒,表达、纯化、鉴定其表达产物。方法自宫颈癌组织提取癌细胞,抽提mRNA,RT-PCR获得人DKK1基因片断,构建重组质粒pCMV-HA2/DKK1,EcoRⅠ酶切、测序鉴定重组质粒;借助脂质体将载体瞬时转染入Free-Style293-F细胞(无血清培养)蛋白印迹法检测DKK1蛋白。结果 RT-PCR获得片断与预期结果相符,酶切鉴定、测序鉴定证实pCMV-HA2/DKK1重组质粒构建成功;DKK1蛋白分泌表达在Free-Style293-F细胞培养液中,WesternBlot鉴定表达产物为DKK1蛋白。结论成功构建了人DKK1的真核表达质粒,并对该基因的真核表达产物进行鉴定,为下一步的DKK1蛋白对肿瘤发生中的生物学活性研究奠定基础。     

从Cohn氏法组分Ⅲ沉淀纯化人凝血因子Ⅶ

目的探索从Cohn氏法组分Ⅲ(组分Ⅲ)沉淀中纯化人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的方法并对纯化产物进行鉴定。方法将组分Ⅲ沉淀溶解,经柠檬酸钡吸附、洗脱、硫酸铵沉淀、2次DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤纯化人FⅦ。结果从400g组分Ⅲ沉淀中最终得到10.1mg纯化的FⅦ,活性为1775.8U/mg,FⅦ被浓缩了近6000倍,总活性回收率为17.6%,SDS-PAGE电泳鉴定只有1条主条带。结论组分Ⅲ沉淀中有很高FⅧ活性;建立了从组分Ⅲ沉淀中纯化人FⅦ的方法。     

人穿孔素C端肽段的放射诱导表达

目的 观察克隆的人穿孔素(perforin,PFN)羧基端肽段在肺癌细胞SPC-A1中的放射诱导表达及其对该细胞的杀伤活性.方法 用PCR方法获取hPFN-C基因片段,将该基因片段克隆到含放射诱导启动子的真核表达载体pcDNA3.1( )/Egr-1,脂质体介导转染SPC-A1细胞.放射诱导表达后,RT-PCR、免疫细胞化学方法检测该基因片段在SPC-A1中的表达.MTT法检测该基因片段的表达产物对SPC-A1细胞的杀伤活性.结果 成功获取hPFN-C基因片段,构建了放射诱导表达的真核表达载体,转染SPC-A1细胞后,免疫细胞化学法证实目的蛋白出现在细胞质中,而未照射的细胞则没有hPFN-C基因表达. MTT法检测显示,与对照组相比,有hPFN-C 表达的SPC-A1细胞存活率仅为0.657.结论 成功构建hPFN-C基因片段的放射诱导表达载体,它在SPC-A1细胞中获得可控性表达,其表达产物对该细胞具有较强的杀伤活性.     

转染鼠脂肪干细胞用于血友病A基因治疗的可能性实验

目的：探索表达载体含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒能够成功转染脂肪干细胞作为血友病A基因治疗靶细胞的可能性。方法：实验于2004—01／06在武汉大学医学院病理生理学实验室完成。先将重组质粒表达载体含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒扩增、纯化和鉴定。取大鼠的腹腔和肾后脂肪组织。分离出脂肪干细胞。当培养细胞生长至80％融合时，将重组质粒表达载体和阳离子脂质体Lipofectamine转染试剂以0．5：1，1：1，1．5：13种不同的质量比混合后转染大鼠的脂肪干细胞。培养36h后分别采用比色法和半定量多聚酶链式反应方法检测培养细胞上清中人凝血因子Ⅷ的凝血活性和脂肪干细胞的外源基因转化效率。结果：①转化效率结果：质量比为1．5：1时转染效率比质量比为0．5：1时约高5％，质量比为1：1时转染效率最高，约比质量比为0．5：1时高50％。②转化36h后检测脂肪干细胞上清中的人凝血因子Ⅷ活性的结果显示：表达载体与阳离子脂质体质量比为0．5：1时，人凝血因子Ⅷ活性为0．2％；表达载体与阳离子脂质体质量比为1：1时。人凝血因子Ⅷ活性为1．6％；表达载体与阳离子脂质体质量比为1，5：1时，人凝血因子Ⅷ活性为0．4％。没有表达载体转染的脂肪干细胞上清中人凝血因子Ⅷ活性为0；正常人凝血因子Ⅷ活性为50％，180％。结论：外源基因含有B结构域缺失的人凝血因子ⅧcDNA的重组质粒能成功转染鼠脂肪干细胞，而且转化后的细胞能够表达人凝血因子Ⅷ，但表达的人凝血因子Ⅷ活性不高，这可能与本次实验中质粒的纯度不高、转染效率不高和其他原因有关。     

大鼠凝血因子Ⅶ EGFP-EGF1融合蛋白的表达及其结合功能初步研究

本研究通过融合蛋白EGFP-EGF1的表达,探讨大鼠凝血因子Ⅶ上EGF1片段与组织因子（TF）的结合功能。用RT-PCR方法自大鼠肝脏组织获得EGF1编码区基因并将其插入EGFP原核表达载体中,构建pET28a-EGFP-EGF1融合蛋白表达载体;将该重组质粒转化大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达EGFP-EGF1融合蛋白;采用亲和层析方法Ni柱纯化融合蛋白,将融合蛋白作用于经脂多糖刺激表达TF的大鼠血管内皮细胞;通过荧光显微镜及流式细胞术观察和检测融合蛋白与细胞结合情况。结果表明：EGFP-EGF1在转化的大肠杆菌中获得高效表达并成功纯化,SDS-PAGE证实分子量约为36kD。荧光显微镜及流式细胞术检测显示该融合蛋白能与内皮细胞膜上的TF结合。结论：大鼠凝血因子Ⅶ上EGF1区可介导FⅦ与TF特异性结合,从而可能为分子靶向抗栓治疗研究提供部分基础。     

B区缺失型人FⅧ在酵母中的表达尝试

目的　尝试B区缺失型FⅧ在毕赤酵母 (P .pastoris)中的表达 ,探索rFⅧ在酵母中的表达情况和可能性。方法　将B区缺失型FⅧcDNA与质粒载体 pPICZaA酶切、连接 ,构建了酵母表达载体 pPICZα FⅧ ,电击转染GS115酵母细胞 ,甲醇诱导表达 ,一步法对表达产物进行活性检测并进行Dot Blot及Western Blot分析。结果　随着发酵时间的延长 ,表达产物的凝血时间越来越长 ,而蛋白表达量越来越高。结论　rFⅧ在酵母中的表达产物不稳定 ,表达水平较低 ,表达方法须改进     

通用表达型T载体的构建与真核基因的快速克隆表达

目的:为简化PCR产物真核表达载体构建步骤,构建真核表达型T载体,并对其特性及表达效率进行分析.方法:限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体pcDNA3,回收线性化质粒片段与dTTP 70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化.将增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)和中国旱獭a干扰素基因(cwIFNA5)分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭a干扰素的生物学活性.结果:外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72 h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80%以上,荧光强度高:病毒保护试验表明cwIFNA5转染细胞培养上清干扰素效价高达1∶600.结论:本研究构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达作蛋白质功能分析.     

人WAF1基因的克隆及其生物调控作用

目的 克隆人WAF1基因,构建成WAF1－pcDNA3真核表达质粒,探索WAF1基因的生物调控功能。方法 采用RT－PCR和DNA直接测序方法从Hela细胞中扩增人WAF1基因,通过克隆到pcDNA3真核克隆载体上,用脂质体法转染Hct-8细胞;经免疫荧光和免疫组化方法鉴定WAF1外源基因的表达活性和对Rb基因,cyclinD1基因的调控作用。结果 从Hela细胞扩增的从WAF1基因克隆至真核克隆表达载体pcDNA3中,获得了人WAF1－pcDNA3重组质粒和高效表达P21WAF1／CIP1的Hcl-8细胞株;证实了WAF1具有促进Rb,抑制cyclinD1蛋白表达的调控作用。结论 成功地构建了人WAF1表达质粒WAF1－pcDNA3,外源基因WAF1的表达对下游基因具有生物调控效应。     

B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因在293T细胞表达

本研究目的是构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体,观察其在293T细胞中的表达情况。用限制性内切酶法获得B区缺失的人凝血因子Ⅷ基因(BDDhFⅧcDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208,构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ;用限制性内切酶法鉴定载体的连接方向,用磷酸钙共沉淀法将重组质粒pXZ208-BDDhFⅧ分别与包装质粒ΔNRF、包膜蛋白质粒VSV-G共转染293T包装细胞,包装后感染293T细胞,并以pXZ171作为对照。在感染后用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测BDDhFⅧ基因的转录,一期法检测细胞培养上清FⅧ的活性,流式细胞仪(FCM)检测载体的感染效率,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合。结果表明:成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,其基因转导染效率达到了59.57%。RT-PCR法能够检测到BDDhFⅧ转录的mRNA。感染后24、48、72小时检测到细胞上清中FⅧ活性(FⅧ∶C)分别为12%、43%、87%。PCR法扩增出了534bp的特异性片段。结论:成功构建的慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染293T细胞并表达有活性的FⅧ,提示基因治疗可应用于血友病A。     

重组分泌型人类免疫缺陷病毒Tat蛋白在真核细胞中的表达及活性检测

目的 构建人类免疫缺陷病毒病毒 tat基因的重组分泌型真核表达载体并在真核细胞中表达,检测表达的重组蛋白活性。方法 聚合酶链反应（PCR）从重组质粒pcDNA3．1（＋）/Tat中扩增tat基因,利用 HindⅢ和Bam HⅠ酶切位点分别将tat基因正向、反向插入分泌型载体pSecT ag ,获得正向插入克隆（pSecT at ）和反向插入克隆（pSecTat-AS）,经双酶切鉴定连接成功后,利用测序鉴定其序列和插入方向。将构建的重组质粒转染293细胞,利用Western blot法检测Tat蛋白的表达。进而将重组质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞,CAT-酶联免疫吸附试验（ELISA）检测其细胞内CAT表达,从而检测Tat蛋白的活性。最后将转染重组质粒的293细胞与转染LTR-CAT报告质粒的BCBL-1细胞用Transwell培养系统共培养,CAT-ELISA检测分泌型Tat蛋白的旁分泌调控活性。结果 PCR扩增产物在10 g/L琼脂糖凝胶上约300 bp位置出现条带,与预期的324 bp大小相符;经HindⅢ和BamHⅠ分别酶切鉴定,获得2个正向克隆;正向克隆经测序,克隆的 tat基因序列与Gen-Bank中登记的HIV-1 tat基因100％同源。正向克隆质粒转染293细胞后,Western blot法检测观察到约19×10^3蛋白条带。正向克隆质粒与LTR-CAT报告质粒共转染293细胞和BCBL-1细胞CAT 表达量高于反向克隆质粒转染细胞（P＜0．05）。与反向克隆对照相比,与正向克隆转染的293细胞共培养的BCBL-1细胞CAT表达量更高（P＜0．05）。结论 成功构建 HIV-1 tat基因基因分泌型真核表达载体,该载体不但可在真核细胞内表达具有调控活性的T at蛋白,表达的Tat蛋白还可分泌至细胞外并具有调控活性。     

LanCL1融合蛋白表达纯化及其多克隆抗体制备鉴定

目的:获得LanCL1原核和真核表达融合蛋白,制备兔抗LanCL1的多克隆抗体以用于LanCL1基因功能研究。方法:PCR扩增LanCL1 CDS编码区序列,分别亚克隆至原核和真核表达载体上。将真核表达重组质粒用脂质体转染HEK293细胞成功获得了pRK5-LanCL1真核表达融合蛋白。同时将原核表达重组质粒化学转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-LanCL1原核表达融合蛋白,谷胱甘肽琼脂糖珠亲和纯化,透析浓缩获得高纯度GST-LanCL1融合蛋白。将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,并用Western Blot检测抗体。结果:获得了LanCL1真核和原核表达重组融合蛋白。经亲和纯化后的GST-LanCL1融合蛋白纯度达到90%,BCA蛋白定量浓度约0.44mg/mL。获得了高效价的特异性兔抗LanCL1多克隆抗体。结论:成功进行了LanCL1融合蛋白的原核和真核表达,并获得抗LanCL1的高灵敏度的多克隆抗体,为LanCL1进一步功能研究奠定了基础。     

人血浆凝血因子Ⅶ单克隆抗体的制备与应用初探

目的制备能稳定分泌人凝血因子Ⅶ(FⅦ)单克隆抗体的杂交瘤细胞株,纯化人FⅦ单克隆抗体并初步应用。方法 1)以纯化的人血浆FⅦ为抗原免疫BALB/c小鼠,用杂交瘤技术筛选出能分泌人FⅦ单克隆抗体的细胞株,用体内诱生法制备小鼠腹水,经硫酸铵沉淀、DEAE-affi-gel-blue凝胶层析纯化单克隆抗体;鉴定抗体的纯度和亚类、抗体与FⅡ、FⅨ、FⅩ的交叉反应性、二价金属离子对抗原抗体结合的影响等特性。2)将人FⅦ单克隆抗体连接到GoldMag-@磁微粒表面,检测连接效率;将磁微粒连接的抗体与FVⅡ反应,并用含有二价金属离子的缓冲液进行洗脱,探索用磁微粒-单克隆抗体免疫亲和吸附法纯化FⅦ的方法和可行性。结果 1)成功制备出22株分泌人FⅦ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为HFⅦ001～022;所选取的HFⅦ002、0040、050、130、140、21等6株细胞制备的纯化的抗体,其重链的亚类均为IgG1,除与FⅦ反应外,均不与FⅡ、FⅨ、FⅩ发生交叉反应,其中HFⅦ005可以抑制血浆FⅦ的凝血活性,HFⅦ0020、040、05与FⅦ的结合明显受Zn2+的抑制。2)上述6株细胞抗体与磁微粒的连接率为24.0%～94.7%,HFⅦ0020、050、13等3株细胞抗体连接磁微粒后可以结合FⅦ,对其中1株磁微粒连接抗体(HFⅦ005)进行试验显示:其结合的FⅦ在有Zn2+存在时能解离下来。结论制备出能分泌人血浆FⅦ单克隆抗体的杂交瘤细胞株并纯化出单克隆抗体;应用磁微粒-单克隆抗体免疫亲和吸附法,可以分离纯化人FⅦ。     

Mfn2基因克隆及pEGFPmfn2真核表达质粒的构建

目的利用基因工程技术克隆线粒体融合蛋白2(mitofusin-2,mfn2)基因并构建一种无细胞毒性、不激活原癌基因的真核表达的pEGFPmfn2质粒载体。方法采用高效Trizol试剂快速提取大鼠血管平滑肌细胞株A7r5总RNA,经RT-PCR获得mfn2cDNA,扩增、纯化、回收mfn2基因片段并将质粒pEGFP-N1和mfn2基因片段分别双酶切,前者纯化回收大片段,后者纯化回收2.2 kb片段,再将回收的pEGFP-N1大片段与mfn2基因片段(2.2 kb)重组。对重组pEGFPmfn2质粒进行PCR和双酶切鉴定并测序。结果成功地从A7r5中克隆了mfn2基因,并构建了以pEGFP-N1为载体的真核表达质粒。结论含mfn2基因新型表达质粒构建的成功将为研究mfn2功能、进一步研究该基因异常表达与心血管疾病发生的关系奠定基础。     

人凝血因子Ⅷ体外高效表达体系的建立

目的 构建含有人凝血因子Ⅷ(FⅧ)基因的慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,观察其在体外培养细胞中的表达情况.方法 用限制性内切酶酶切法获得B区缺失的人FⅧ基因(BDDhFⅧ cDNA)片段,将其克隆至慢病毒载体pXZ208的多克隆位点,构建慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,限制性内切酶酶切法鉴定载体的连接方向.采用三质粒共转染293T细胞制备病毒颗粒,包装后感染人肺、肾HLF细胞、张氏肝(Chang-Liver)细胞和成人骨髓基质细胞(MSC),并以pXZ171作为对照.流式细胞术(FCM)检测载体的感染效率,一期法检测细胞培养上清中FⅧ的活性,PCR检测BDDhFⅧ基因的整合.结果 成功构建了慢病毒载体pXZ208-BDDhFⅧ,包装后能有效感染多种靶细胞,感染效率分别为:HLF细胞(74.52±7.57)%、MSC(42.34±5.84)%和Chang-Live细胞(27.24±6.53)%.感染后48 h检测到HLF细胞、Chang-Liver细胞和MSC培养上清中有FⅧ的表达,FⅧ活性分别为(54.1±5.6)%、(22.5±2.9)%和(12.5±2.7)%.PCR检测到目的 基因的整合.结论 成功构建了慢病毒表达载体pXZ208-BDDhFⅧ,在体外可以有效感染多种靶细胞并表达有活性的FⅧ.     

凝血因子Ⅶ基因Arg353Gln多态性、活性和冠状动脉病变的关系

目的:探讨不同严重程度的冠状动脉病变与凝血因子Ⅶ(FⅦ)活性及其Arg353Gln多态性的关系。方法:运用聚合酶链反应(PCR)、变性梯度胶电泳(DGGE)方法筛查123例冠心病患者和120例正常对照者FⅦ基因Arg353Gln多态性,以一期法检测研究对象FⅦ活性,分析冠状动脉病变、FⅦ基因Arg353Gln多态性和FⅦ活性之间的关系。结果:发现F基因8号外显子Arg353Gln多态性(等位基因M1/M2)与FⅦ活性显著相关(P<0.05),等位基因M2与低FⅦ活性有关。冠脉多支病变患者FⅦ活性显著高于正常对照者(P<0.05)。结论:FⅦ基因Arg353Gln多态性可能是影响FⅦ活性的重要遗传标志,FⅦ活性增高可能是引起冠状动脉严重病变的原因之一。     

高效表达型T克隆载体的构建及其特性

目的研制高效表达型T载体用于基因的表达及蛋白功能分析。方法限制性内切酶EcoR V酶切真核表达载体peDNA3,回收线性化质粒片段与三磷酸胸腺嘧啶脱氧核苷酸（driP）70℃退火,构成T克隆载体并回收纯化。将增强绿色荧光蛋白基因（EGFP）和中国旱獭α干扰素基因（cwIFNA5）分别扩增后直接克隆到新构建的表达型T载体,转化感受态细菌,挑选阳性菌并制备质粒瞬时转染真核细胞,荧光显微镜观察EGFP的表达,病毒保护试验检测中国旱獭α干扰素的生物学活性。结果成功构建了表达型T载体,外源基因EGFP和cwIFNA5克隆进该载体后可以进行高效表达,基因转染72h后,荧光显微镜观察到EGFP基因转染细胞荧光阳性率在80％以上,荧光强度高;病毒保护试验表明cwIFINA5基因转染细胞培养上清干扰素效价达1：640。结论新构建的表达型T载体可用于基因的克隆之外,还可以直接用于基因的高效表达及蛋白质功能分析。