Rac1-siRNA抑制大鼠视网膜VEGF表达的实验研究

目的 观察Rac1-siRNA重组载体对大鼠视网膜血管内皮细胞生长因子(VEGF)表达的抑制作用.方法 将25只成年SD大鼠,采用光动力法诱导双眼视网膜静脉阻塞后,1只眼玻璃体腔转染Rac1-siRNA重组载体作为基因干预组,另1只眼注射空白载体作为空白对照组.25只正常SD大鼠单眼玻璃体腔内转染Rac1-siRNA重组载体作为空白干预组.免疫组织化学法和RT-PCR法检测各组大鼠视网膜VEGF的表达情况.结果 VEGF在基因干预组和空白对照组中与空白干预组相比表达较强,空白对照组最强,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 Rac1-siRNA重组载体能有效抑制视网膜内VEGF的表达.     

Rac1-siRNA抑制大鼠视网膜新生血管生成

目的 观察Rac1-siRNA重组载体对视网膜新生血管生成的抑制作用。方法25只成年Sprague-Dawley（SD）大鼠，采用光动疗力法诱导双眼视网膜静脉阻塞后，1只眼玻璃体腔转染Rac1-siRNA重组载体作为基因干预组，另1只眼注射空白载体作为空白对照组。25只SD大鼠单眼玻璃体腔内转染Rac1-siRNA重组载体作为空白干预组。2周后对3组大鼠进行心内灌注右旋异硫-氰酸荧光素，视网膜铺片，检测视网膜新生血管生成情况。摘除3组大鼠眼球，苏木素-伊红染色后计数突破内界膜的内皮细胞数。结果 视网膜铺片发现，空白对照组视网膜产生大片新生血管，大量荧光素渗漏；基因干预组仅见小片状新生血管网，少量荧光素渗漏；空白干预组呈正常血管形态。基因干预组大鼠视网膜切片中，突破内界膜的血管内皮细胞平均数与空白对照组和空白干预组比较，两两间差异具有统计学意义（统计值=，P=0.000<0.05）。结论 Rac1-siRNA重组载体能有效抑制体内视网膜新生血管的生成。     

白藜芦醇对急性低压缺氧诱导的大鼠视网膜损伤的保护作用

目的　探讨白藜芦醇对急性低压缺氧诱导的大鼠视网膜损伤的保护作用及机制。方法　将72只健康SD大鼠随机分成3组:常氧对照组、低氧模型组、低氧+白藜芦醇（resveratrol,RES）干预组（RES干预组）。常氧对照组大鼠在常氧环境下喂养,低氧模型组及RES干预组大鼠置于低压氧舱内（模拟5000 m的海拔高度）喂养,RES干预组每日并给予腹腔注射30 mg·kg^-1 RES 1次。各组大鼠在不同处理7 d后剥离视网膜,免疫组织化学法观察大鼠视网膜组织中胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）和缺氧诱导因子-1（hypoxia-inducible factor-1,HIF-1）的表达,RT-PCR检测核转录因子-kappaB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）和脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor,BDNF）mRNA的表达。结果　低氧模型组大鼠视网膜GFAP与HIF-1的表达较常氧对照组增加,BDNF mRNA（2.627±0.633）和NF-κB mRNA（1.712±0.198）的相对表达量较常氧对照组（2.000±0.518、1.053±0.483）上调（P= 0.013、0.008）。与低氧模型组对比,RES干预组视网膜受损程度减轻,GFAP与HIF-1的表达减少,BDNF mRNA相对表达量（2.053±0.938）显著下调,差异有统计学意义（P=0.024）,而NF-κB mRNA相对表达量（1.481±0.397）与低氧模型组相比,差异无统计学意义（P=0.455）。结论　RES对高海拔缺氧诱导的视网膜损伤有保护作用,其机制可能与调节GFAP、HIF-1、BDNF以及NF-κB的表达有关。     

Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA干扰活性氧-核因子κB通路抑制小鼠视网膜新生血管生成

目的 观察Ras相关的C3肉毒毒素底物1的小发夹RNA(Racl-shRNA)在小鼠氧致视网膜病变中对视网膜新生血管(RNV)生成的抑制作用及对活性氧(ROS)-核因子κB(NF-κB)通路的影响.方法 将108只7日龄C57BL/6J小鼠随机平均分为3组.其中2组Smith法建立氧致视网膜病变模型;11日龄时玻璃体腔注射Racl-shRNA表达质粒或无意义质粒,分别作为基因干预组和空白对照组.第3组于正常氧环境中饲养,11日龄时玻璃体腔注射Racl-shRNA表达质粒作为空白干预组.15、17日龄时行荧光视网膜铺片,观察视网膜血管发育及新生血管情况.17日龄时计数眼球切片中突破内界膜的血管内皮细胞核数.17日龄时进行原位杂交法和荧光实时定量逆转录-聚合酶链反应法检测小鼠视网膜Racl和NF-κB p65亚单位的mRNA含量;免疫组织化学和蛋白质免疫印记检测Racl和NF-κB p65的蛋白表达.结果 基因干预组视网膜Racl的mRNA水平较空白对照组明显下调(t=4.500,P=0.001).与空白对照组比较,基因干预组视网膜铺片中无灌注区、荧光渗漏和新生血管丛明显减轻,突破内界膜的血管内皮细胞核显著减少(t=6.521,P<0.001);视网膜NF-κB p65的核易位水平明显下降(t=16.008,P<0.001),同时mRNA表达亦明显下调(t=3.354,P=0.006),与Racl mRNA表达呈正相关(r=0.580,P=0.012).结论 小鼠玻璃体腔注射脂质体包裹的Racl-shRNA表达质粒可有效沉默视网膜Racl基因表达,阻断ROSNF-κB通路而参与抑制相对缺氧状态下RNV生成.     

GPR120通过抑制核因子-κB信号通路对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞损伤的保护作用

目的　探讨GPR120对糖尿病大鼠视网膜神经节细胞(RGC)的影响及可能机制。方法　健康雄性SD大鼠按55 mg·kg^-1腹腔一次性注射链脲佐菌素建立糖尿病大鼠模型。模型诱导成功后,将大鼠随机分成三组:糖尿病组、鱼油预处理组(鱼油1 g·kg^-1每天1次灌胃;鱼油的主要成分为omega-3,omega-3为GPR120通路激活剂)、安慰剂组(玉米油1 g·kg^-1每天1次灌胃),每组15只,另取15只正常大鼠作为对照组（对照组和糖尿病组大鼠每天1次灌胃等剂量PBS缓冲液）。12周后,气相色谱法检测各组大鼠视网膜组织中二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA）含量,HE染色检测RGC密度,免疫荧光染色检测视网膜GPR120蛋白表达,Western blot检测视网膜GPR120、核因子-κB（NF-κB）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase-3）蛋白相对表达量。结果　与对照组相比,糖尿病组大鼠视网膜组织中DHA、EPA含量均明显减少（均为P<0.01);与糖尿病组相比,鱼油预处理组大鼠视网膜组织中DHA、EPA含量均明显增加（均为P<0.01)。GPR120主要分布于RGC层。对照组大鼠RGC密度为(437.06±4.72) 个·mm^-2,GPR120、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量分别为(35.65±0.89)%、(12.42±0.58)%、(13.76±0.08)%;糖尿病组大鼠RGC密度为 (329.75±3.51) 个·mm^-2,GPR120、NF-κB、Caspase-3 蛋白相对表达量分别为(24.14±0.46)%、(38.94±0.45)%、(25.14±0.45)%;鱼油预处理组大鼠RGC密度为(412.44±3.62) 个·mm^-2,GPR120、NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量分别为(31.59±0.77)%、(18.11±0.58)%、(20.14±0.61)%。与对照组相比,糖尿病组大鼠视网膜NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量均明显增加,RGC密度、GPR120蛋白相对表达量均明显降低;与糖尿病组相比,鱼油预处理组大鼠视网膜NF-κB、Caspase-3蛋白相对表达量均明显降低,RGC密度、GPR120蛋白相对表达量均明显增加(均为P<0.01)。糖尿病组与安慰剂组相比,各指标差异均无统计学意义(均为P＞0.05)。结论　GPR120激活对糖尿病大鼠RGC损伤具有保护作用,其机制可能与抑制NF-κB通路有关。     

吡咯烷二硫氨基甲酸酯抑制大鼠视网膜新生血管的实验研究

目的 检测大鼠视网膜新生血管形成中核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）的表达，探讨抗氧化剂吡咯烷二硫氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC) 对视网膜新生血管的抑制作用。 方法 通过相对缺氧的方法建立大鼠视网膜新生血管病变模型，用荧光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography, FFA)的方法观察大鼠视网膜 新生血管；免疫组织化学染色法检测视网膜新生血管大鼠和正常对照组大鼠NF-κB在视网膜的表达；视网膜新生血管大鼠腹腔内注射PDTC，观察对视网膜 NF-κB 表达以及新生血管形成的影响。 结果 相对缺氧组10只大鼠的20只眼中13只眼FFA检查显示视网膜中纬部有毛细血管无灌注区、荧光渗漏、新生血管形成，残存视网膜的大血管均纡曲、扩张；3只眼玻璃体积血，无法检查眼底。免疫组织化学染色显示NF-κB从视网膜内核层、神经纤维层的胶质细胞和内皮细胞的细胞浆向细胞核转移。PDTC干预组10只大鼠的20只眼中2只眼FFA检查显示新生血管形成及荧光渗漏；1只眼玻璃体积血；17只眼未见新生血管形成及荧光渗漏。免疫组织化学染色显示NF-κB主要在细胞浆表达。 结论 视网膜新生血管的生成与NF-κB的活化密切相关。PDTC能有效阻止NF-κB的活化以及从视网膜内核层、神经纤维层的胶质细胞和内皮细胞的细胞浆向细胞核的转移，抑制视网膜新生血管的形成。 （中华眼底病杂志，2003，19：201-268）     

重组腺病毒载体介导色素上皮衍生因子基因抑制视网膜新生血管形成

目的 观察重组腺病毒载体介导色素上皮衍生因子（PEDF）基因对视网膜新生血管（RNV）发生的影响。方法 将20只鼠龄7 d 的Spraque-Dawley大鼠建立模型后随机分为2组，分别于出生后14 d 行玻璃体内注射空白腺病毒载体（AV-Blank组）及编码PEDF基因的重组腺病毒载体（AV-PEDF组），采用RNV内皮细胞计数、运用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫组织化学法检测玻璃体、视网膜中PEDF基因及其蛋白表达的变化。结果 注射药物后AV-PEDF组视网膜的新生血管数较AV-Blank组明显减少（t＝42.009，P＜0.001）；视网膜PEDF蛋白的表达较AV-Blank组明显增加（t=36.638，P＜0.001）；玻璃体组织中的PEDF mRNA表达量也较AV-Blank组明显增加（t=9.128，P＜0.001）。结论 重组腺病毒载体介导的PEDF基因可上调大鼠RNV眼玻璃体及视网膜组织中PEDF的表达；推测PEDF的表达可能与RNV的抑制与消退相关。     

rhEPO对大鼠视网膜缺血再灌注后NF-κB和PCNA表达的影响

目的 探讨核转录因子-κB(NF-κB)和增生细胞核抗原(PCNA)在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达及重组人促红细胞生成素(rhEPO)对其表达的影响.方法 前房加压法制作大鼠视网膜缺血再灌注损伤模型,28只Wistar大鼠随机分为正常组、缺血再灌注组和EPO治疗组,后两组又分为1、6、12、24、48、72 h组.免疫组织化学法和酶联免疫吸附试验检测视网膜组织中NF-κB和PCNA的表达.结果 正常组视网膜无NF-κB和PCNA表达.缺血组两者的表达均24 h达高峰,48 h后下降;治疗组于6、12、24、48、72 h两指标的表达均明显增强(P＜0.05).结论 大鼠视网膜缺血再灌注损伤能诱导NF-κB和PCNA的表达,rhEPO能增强NF-κB和PCNA的表达.     

核因子-κB在糖尿病大鼠视网膜中的表达及意义

目的 观察核因子κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)在大鼠糖尿病早期视网膜中的表达及其在糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)发病过程中的作用.方法 清洁级健康成年雄性Wistar大鼠110只,随机分为正常对照组(NC组,24只)和糖尿病造模动物组(DM组,86只).大鼠腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱发糖尿病模型,取成模的72只大鼠随机分为2周、4周、12周和20周组,每组各18只.到上述各时间点后分别取DM组大鼠6只和NC组大鼠2只并处死,免疫印记法观察NF-κB蛋白在不同病程糖尿病大鼠视网膜的表达,采用免疫组织化学法观察NF-κB在不同病程糖尿病大鼠视网膜组织和血管的表达.结果 NC组正常大鼠视网膜中NF-κB p65的蛋白质水平非常低,为17.72±8.57,DM组糖尿病诱导成功后2周NF-κB p65蛋白质表达为38.45±12.37,并随时间的延长其表达增加,4周时的免疫印记反应强度最高为89.41±19.79,各时间点蛋白质表达比NC组明显增强(均为Jp<0.01).DM组大鼠糖尿病诱导成功后2周,视网膜表层血管即散在出现NF-κB阳性染色颗粒,4周时在视网膜内核层及内核层血管均出现NF-κB阳性染色细胞,为胞核染色,并随着病程的延长,12周时在视网膜表面血管、内核层、内核层血管和外丛状层均出现大量阳性染色细胞;NC组大鼠视网膜血管铺片没有NF-κB表达.DM组大鼠糖尿病诱导成功后2周,视网膜血管壁出现散在NF-κB阳性染色颗粒,以后随病程延长,NF-κB阳性细胞逐渐增多,12周时最多,以后保持不变.结论 NF-κB在DR发生发展过程中可能起重要作用.     

MG132对早期糖尿病大鼠视网膜病变过程中NF-κB及IκB表达的影响

目的观察泛素蛋白酶体抑制剂MG132对大鼠早期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)过程中核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)以及其抑制性信号蛋白IκB激酶的降解调控作用,探讨泛素蛋白酶体系统在DR中的作用机制。方法选择健康成年雄性Wistar大鼠40只,随机分为正常对照组、DR安慰剂组、DR+MG132低浓度干预组、DR+MG132高浓度干预组。DR+MG132低浓度干预组按0.05mg.kg-1每天1次腹腔注射MG132DMSO液,DR+MG132高浓度干预组按0.10mg.kg-1每天1次腹腔注射MG132DMSO液。分别于给药后6周和8周检测大鼠体质量、血糖,并制备视网膜石蜡切片,采用免疫组织化学法分析NF-κB以及其抑制性信号蛋白IκB在各组大鼠视网膜中的表达。结果NF-κB p65在DR安慰剂组的表达较正常对照组明显增强,在MG132高浓度干预组的表达强度较DR安慰剂组减弱;IκBα在DR安慰剂组的表达较正常对照组显著减弱,MG132高浓度干预组的表达强度较DR安慰剂组增强,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。相反,MG132低浓度干预组中...     

核转录因子-κB及细胞间粘附分子-1在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达及吡咯醛二硫氨基甲酸酯对两者表达的影响

目的 探讨核转录因子-κB(NF-κB)及细胞间粘附分子(ICAM)-1在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达及吡咯醛二硫氨基甲酸酯（PDTC）对两者表达的影响。 方法 建立大鼠视网膜缺血再灌注模型，60只SD大鼠随机分为缺血再灌注组和缺血再灌注+PDTC治疗组，每组30只大鼠。每只大鼠结扎左侧颈总动脉，右侧未作结扎作为对照。每组按再灌注后不同时间段再分为1、6、12、24、48、72 h组，每组5只大鼠。以原位杂交法检测视网膜中NF-κB和ICAM-1的表达，每只大鼠在1、6、12、24、 48、72 h相应时间段行断颈处死前均行视网膜电图（ERG）检测，并分别计算出左眼或右眼E RG a、b波波幅的比值，得出ERG a、b波的相对恢复率。 结果 缺血再灌注组在再灌注后6 h开始检测到NF-κB和ICAM-1的表达，在24 h表达最强，以后逐渐减弱 。缺血再灌注+PDTC组在再灌注后6 h未检测到NF-κB和ICAM-1的表达，在12 h有NF-κB 和ICAM-1的表达，24 h表达最强，但低于缺血再灌注组。对照组未检测到NF-κB和ICAM-1的表达。缺血再灌注各组ERG a、b波波幅相对恢复率低于缺血再灌注+PDTC组(P＜0.01 )。缺血再灌注与缺血再灌注+PDTC组各时间段ERG a、b波波幅相对恢复率以再灌注后24 h最差（P＜0.01）。 结论 NF-κB及其诱导的ICAM-1在视网膜缺血再灌注损伤中发挥重要作用，PDTC可能通过抑制NF-κB的活性减轻视网膜缺血再灌注损伤。 （中华眼底病杂志，2004，20：175-178）     

木犀草素对视网膜缺血-再灌注损伤(RIRI)大鼠TLR4/Syk/NF-κB信号通路及视网膜的影响

目的　探讨木犀草素对视网膜缺血-再灌注损伤(RIRI)大鼠Toll样受体4（TLR4）/脾脏酪氨酸激酶（Syk）/核因子-κB（NF-κB）信号通路及视网膜的影响。方法　40只SD大鼠随机分为对照组、模型组、木犀草素低剂量组（5 mg·kg^-1）、木犀草素高剂量组（10 mg·kg^-1）,每组10只,除对照组外,其余各组大鼠制备RIRI模型,造模成功后分别进行腹腔注射不同试剂处理,每天1次,持续 7 d。各组大鼠给药结束后24 h行光学相干断层扫描（OCT）检查,测量视盘周围视网膜厚度;取各组大鼠视网膜行HE染色观察视网膜组织病理形态、行TUNEL染色观察视网膜组织细胞凋亡情况;行酶联免疫吸附试验（ELISA）测定各组大鼠视网膜中超氧化物歧化酶（SOD）活性及丙二醛（MDA）水平,并检测大鼠视网膜中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-6（IL-6）水平;利用Western blot检测各组大鼠视网膜TLR4/Syk/NF-κB信号通路相关蛋白表达水平。结果　与对照组相比,模型组大鼠视网膜出现水肿、空泡变性及凋亡等损伤,视网膜厚度［（156.31±18.76）μm］、视网膜神经节细胞数［（66.25±15.18）个·mm^-1］、SOD活性［（50.33±1.98）U·mg^-1］均显著降低（均为P<0.05）,视网膜细胞凋亡率［（21.36±2.04）%］、视网膜中MDA［（1.82±0.14）μmol·g^-1］、TNF-α［（98.42±11.25）g·L^-1］、IL-6［（87.34±7.62）g·L^-1］含量及TLR4、p-Syk/Syk、p-NF-κB/NF-κB蛋白相对表达水平均显著升高（均为P<0.05）。与模型组相比,木犀草素低剂量组、木犀草素高剂量组大鼠视网膜水肿等损伤程度逐渐减轻,视网膜厚度［（170.62±12.46）μm、（183.54±13.75）μm］、视网膜神经节细胞数［（86.74±16.21）个·mm^-1、（105.44±14.23）个·mm^-1］、SOD活性［（65.26±2.64）U·mg^-1、（73.48±3.13）U·mg^-1］均依次增加（均为P<0.05）,视网膜细胞凋亡率［（16.75±1.55）%、（9.65±1.23）%］、视网膜中MDA［（1.23±0.12）μmol·g^-1、（0.86±0.09）μmol·g^-1］、TNF-α［（61.48±8.37）g·L^-1、（36.83±8.49）g·L^-1］、IL-6［（55.47±6.12）g·L^-1、（38.71±3.85）g·L^-1］含量及TLR4、p-Syk/Syk、p-NF-κB/NF-κB蛋白相对表达水平均依次降低（均为P<0.05）。结论　木犀草素可抑制RIRI大鼠TLR4/Syk/NF-κB信号激活,减轻视网膜组织氧化应激及炎症损伤,进一步减轻视网膜损伤。     

坎地沙坦治疗大鼠糖尿病视网膜病变的作用机制

目的:探讨坎地沙坦(candesartan,Can)对大鼠糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)的作用机制。方法:雄性SD大鼠45只,取8只作为正常对照组,其余大鼠尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型,剔除死亡及未成模大鼠5只,将成模大鼠随机分为4组:糖尿病组、Can治疗组、胰岛素治疗组、Can与胰岛素联合治疗组,每组8只。饲养12wk,放射免疫法检测血浆血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)含量,免疫组织化学方法检测AngⅡ1型受体(AT1R)、核因子-κB(NF-κB)在视网膜组织中的蛋白表达。结果:各组血浆AngⅡ浓度均增高,胰岛素组较糖尿病组明显降低,Can组较糖尿病组显著增高;正常对照组视网膜均有少量AT1R和NF-κB蛋白表达,糖尿病组表达显著增高,各治疗组均可使其表达下降,以Can与胰岛素联合治疗组下降最显著。结论:Can通过抑制视网膜AngⅡ和AT1R结合,减少AT1R和NF-κB的激活,以治疗DR。     

大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体的构建及其对大鼠RPE细胞中Slit2基因的下调作用

背景 年龄相关性黄斑变性(AMD)是老年人致盲的首要原因.目前,AMD的治疗方式在取得显著疗效的同时亦有一定的不足,寻找新的有效治疗靶点是当前的研究热点. 目的 构建大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体,筛选有效干扰序列以用于大鼠视网膜色素上皮(RPE)细胞中Slit2基因沉默,为大鼠相关体内实验奠定基础.方法 设计2条大鼠Slit2基因siRNA序列,退火形成DNA,连接形成慢病毒干扰载体并进行测序鉴定.采用三质粒共转染293T细胞法收获慢病毒(Lv-rSlit2-siRNA),用药物筛选法测定病毒悬液滴度.将大鼠RPE细胞分为空白对照组、空病毒组、Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组,根据分组分别用仅有病毒的载体和不同序列的Lv-rSlit2-siRNA载体转染细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和Western blot法测定各组细胞中Slit2 mRNA及蛋白的表达以确定Slit2基因的敲减率,筛选有效干扰序列.采用0、100、200和400μmol/L CoCl2孵育大鼠RPE细胞以制备缺氧细胞模型并转染筛选Lv-rSlit2-siRNA2干扰序列,采用实时荧光定量PCR法和ELISA法测定大鼠RPE细胞中血管内皮生长因子A(VEGFA)表达变化及细胞上清液中VEGFA质量浓度.结果 成功构建2条大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体,病毒滴度分别为5×108 TU/ml和3×108 TU/ml,转染病毒后72 h于荧光显微镜下观察RPE细胞慢病毒转染率均在70％以上.Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2 mRNA相对表达量分别为0.67±0.09和0.23±0.11,明显低于空白对照组的1.03±0.31和空病毒组的0.92 ±0.07;Lv-rSlit2-siRNA1组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中Slit2蛋白相对表达量分别为0.62±0.07和0.49±0.02,明显低于空白对照组的1.00±0.10和空病毒组的0.95±0.11,差异均有统计学意义(均P＜0.01).0、100、200和400 μmol/L CoCl2作用后,空白对照组和Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFA mRNA的相对表达量明显不同,差异均有统计学意义(F浓度=127.998,P＜0.01;F分组=69.663,P＜0.01),不同浓度CoCl2作用后各组大鼠RPE细胞中VEGFA蛋白相对表达量均明显不同,差异均有统计学意义(F浓度=17.059,P＜0.01;F分组=91.791,P＜0.01).100、200和400 μmol/LCoCl2作用后Lv-rSlit2-siRNA2组大鼠RPE细胞中VEGFA mRNA表达量及蛋白质量浓度均明显低于空白对照组,差异均有统计学意义(均P＜0.01).结论 大鼠Slit2基因慢病毒干扰载体构建成功并筛选出有效干扰重组序列,其能有效下调大鼠RPE细胞中Slit2基因的表达,并抑制缺氧环境下VEGFA在大鼠RPE细胞中的表达.     

罗格列酮对糖尿病视网膜病变大鼠视网膜NF-κB表达的影响

目的观察过氧化物酶体增生物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)激动剂罗格列酮对链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)诱导的早期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)大鼠视网膜上核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)表达的影响,进而从分子学水平上阐明PPAR-γ激动剂对DR的保护作用,为预防及早期治疗DR提供一种新思路。方法选择90只健康雄性Wistar大鼠(180～200g)随机分为3组:正常对照组(C组)、DR+罗格列酮组和DR组,每组大鼠各30只。进一步将每组大鼠分为给药后4周、8周和12周3个时间点进行观察,每个时间点各10只大鼠。采用一次性腹腔注射50mg·kg-1STZ的方法建立糖尿病(diabetes mellitus,DM)模型。自DM模型成模后第3天起,DR+罗格列酮组大鼠每天给予罗格列酮3mg·kg-1灌胃,C组和DR组每天给予等体积的生理盐水灌胃。于给药后4周、8周和12周处死各组大鼠,处死前测各组大鼠的血糖和体质量,然后摘除眼球,剔除角膜和晶状体制成眼杯,制作石蜡切片,采用免疫组织化学的方法检测视网膜上NF-κBp65蛋白的表达。结果 DR组和DR+罗格列酮组大鼠血糖水平均明显高于C组(均为P<0.01);DR组和DR+罗格列酮组大鼠的体质量均较C组降低(P<0.01或P<0.05)。C组大鼠视网膜上NF-κBp65无表达或弱表达;DR组大鼠视网膜上NF-κBp65表达的积分光密度(integral optical density,IOD)值分别是35.62±2.99、67.59±2.23和85.62±3.55,明显高于C组(均为P<0.01);DR+罗格列酮组大鼠视网膜上NF-κBp65表达的IOD值分别是33.94±2.40、59.58±1.06和73·74±2·32,亦明显高于C组(均为P<0.01);在给药后8周和12周时,DR+罗格列酮组大鼠视网膜上NF-κBp65的表达均较DR组明显降低(均为P<0.01)。结论外源性PPAR-γ激动剂罗格列酮能够降低视网膜上NF-κB的表达从而延缓DR的发生发展,对早期DR大鼠视网膜具有保护作用,因此有望成为DR新的治疗手段。     

核因子-κB诱骗寡核苷酸抑制大鼠视网膜缺血再灌注损伤

目的:研究核因子-κB诱骗寡核苷酸(nuclear factor-κB decoy oligodeoxynucleotide,NF-κB decoy ODN)对大鼠视网膜缺血再灌注损伤的保护作用.方法:设计、合成NF-κB decoy ODN和错配NF-κB decoy ODN的核苷酸序列.采用升高眼内压的方法建立大鼠视网膜缺血再灌注模型.缺血前10 min,玻璃体内注射NF-κB decoy ODN或错配NF-κB decoy ODN.再灌注24 h后,观察视网膜的组织学变化,测定视网膜的髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活力.检测缺血前10 min和再灌注24 h的闪光视网膜电图(flash electroretinography,F-ERG),计算其b波振幅恢复率.结果:缺血的大鼠视网膜再灌注24 h后,视网膜明显充血、水肿,有许多白细胞浸润,神经节细胞和内核层细胞减少,且视网膜MPO活力增加(P＜0.05)、b波振幅恢复率下降(P＜0.05).玻璃体注射NF-κB decoy ODN的大鼠,视网膜的损伤性组织学改变减轻,MPO活力降低,b波振幅恢复率增加.而玻璃体注射错配NF-κB decoy ODN则无此作用.结论:玻璃体注射NF-κB decoy ODN能有效抑制大鼠视网膜缺血再灌注损伤,保护视网膜功能.     

糖尿病大鼠神经干细胞视网膜下移植后TLR4、NF-κB的表达

目的 观察糖尿病大鼠视网膜下移植大鼠胚胎神经干细胞(NSCs)后转录因子(NF-KB)、Toll样受体4(TLR4)的表达.方法 大鼠糖尿病成模后,A组视网膜下移植大鼠NSCs,B组视网膜下填充DMEM,C组不做手术处理.NSCs移植组术后1、2、4周分别取双眼颞上视网膜做对照检测.Western blot法检测TLR4和NF-κB的蛋白表达.结果 A组糖尿病大鼠TLR4、NF-κB持续表达阳性,B组仅术后3 d、1周TLR4表达阳性,术后1周NF.KB表达阳性,C组TLR4和NF-KB表达为阴性.各组TLR4、NF-KB表达差异有统计学意义(P<0.05).结论 糖尿病大鼠NSCs视网膜下移植后TLR4、NF-KB可持续表达.     

多西环素对碱烧伤大鼠角膜组织中NF-κB和bcl-2表达的影响

目的 研究多西环素作用下碱烧伤大鼠角膜组织中核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)和抗凋亡因子bcl-2表达情况,探索多西环素诱导炎症细胞凋亡的机制. 方法 制备SD大鼠(64只,64眼)一侧眼角膜碱烧伤动物模型,以3g·L-1多西环素眼液滴眼为实验组(32只,32眼),以溶媒滴眼为阴性对照组(32只,32眼).于角膜碱烧伤后第3天、第7天、第14天、第21天分别取下烧伤侧角膜组织行荧光定量RT-PCR,检测角膜组织中bcl-2基因的表达情况,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测角膜组织中NF-κB的表达情况.结果 RT-PCR检测显示:烧伤后第3天、第7天、第14天阴性对照组bcl-2 mRNA的相对表达量分别为0.87±0.15、0.91±0.14、0.99±0.13,第3天、第7天、第14天多西环素组bcl-2 mRNA的相对表达量分别为0.30±0.15、0.22±0.08、0.42±0.06,多西环素组与阴性对照组相比bcl-2 mRNA表达显著下降(均为P＜0.05).ELISA检测显示:角膜碱烧伤后第3天、第7天阴性对照组NF-κB蛋白相对含量分别为(45.87±1.15)ng·L-1、(47.52±2.34)ng·L-1,第3天、第7天多西环素组NF-κB蛋白相对含量分别为(23.30±2.15)ng·L-1、(24.96±7.14)ng·L-1,角膜碱烧伤后第3天、第7天时多西环素组NF-κB与阴性对照组相比表达有显著下降(均为P＜0.05).角膜烧伤后第3天、第7天时NF-κB蛋白表达量与bcl-2 mRNA相对表达量呈明显正相关(r =0.746,P＜0.05;r =0.772,P＜0.05).结论 多西环素作用于碱烧伤大鼠角膜可下调NF-κB、bcl-2基因的表达,这可能是多西环素诱导炎症细胞凋亡、减轻炎症反应的机制之一.     

不同波长人工发光二极管光照对大鼠视网膜的影响

目的　探讨红、绿、蓝、白四种不同波长人工发光二极管(LED)光照对大鼠视网膜的影响。方法　45只3周龄SD大鼠作为实验动物,分为空白对照组,以及1000 lux和2000 lux照度下的红光照射组、绿光照射组、蓝光照射组、白光照射组,每组各5只。空白对照组大鼠自然光线下饲养1个月,不同光照组采用相应波长LED进行光照,每天照射10 min,连续1个月。取各组大鼠左眼视网膜行TUNEL染色观察细胞凋亡情况,取各组大鼠右眼视网膜行Western blot检测视网膜中PARP和GFAP的蛋白相对表达量。结果　照度1000 lux时,红光照射组、绿光照射组、蓝光照射组、白光照射组大鼠视网膜TUNEL染色均未见明显的细胞核阳性染色;Western blot检测结果显示,各组大鼠视网膜中cleved-PARP及GFAP蛋白相对表达量与空白对照组相比,差异均无统计学意义（均为P>0.05）。照度为2000 lux时,除空白对照组和红光照射组外,绿光照射组、蓝光照射组、白光照射组大鼠视网膜TUNEL染色后视网膜感光细胞层均可见细胞核点状阳性着染,提示存在DNA的降解断端;Western blot检测结果显示,蓝光照射组大鼠视网膜中cleved-PARP蛋白表达量（1.414±0.192）较空白对照组（0.624±0.148）增加,差异有统计学意义（P<0.05）,红光照射组（0.660±0.067）、绿光照射组（0.764±0.127）、白光照射组（0.748±0.160）大鼠视网膜cleved-PARP蛋白表达与空白对照组相比,差异均无统计学意义(均为P>0.05);各组大鼠视网膜中GFAP蛋白相对表达量比较,差异均无统计学意义(均为P>0.05)。结论　照度2000 lux、每天10 min光照1个月,蓝光照射的大鼠会出现视网膜光损伤表现。     

核转录因子-κB在大鼠视网膜缺血再灌注损伤中的表达

目的建立大鼠视网膜缺血再灌注(retinal ischemical reperfusion injury,RIRI)模型,观察不同程度损伤的视网膜组织病理改变,检测凋亡的存在,探讨核转录因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)在大鼠RIRI中的表达。方法SD大鼠随机分为角膜损伤组和缺血再灌注组,分别建立角膜损伤模型和建立15kPa、60min高眼压视网膜缺血模型,光镜观察视网膜损伤后的组织病理改变,原位细胞凋亡检测,免疫组织化学检测NF-κB的表达情况。结果角膜损伤组视网膜无改变,缺血再灌注组出现组织病理改变,包括视网膜水肿,空泡变性,核固缩、溶解,结构紊乱等,随再灌注时间的延长,视网膜损害加重。原位细胞凋亡检测中,缺血再灌注组的凋亡细胞阳性表达均分布于神经节细胞层及内核层细胞,24h时表达最强。NF-κB在再灌注6h开始表达,24h表达最强。结论RIRI主要导致神经节细胞层及内核层细胞损伤,NF-κB的表达和凋亡可能是损伤的重要机制,且二者有着密切联系,表现出一致的规律性。