ErbB-3 结合蛋白 Ebpl 对 NIH3T3 细胞生长增殖的影响

目的:探讨 erbB-3 结合蛋白 Ebpl 对 NIH3T3 细胞生长增殖的影响.方法:将真核表达质粒 pEGFP-C1 和 Ebpl 基因经双酶切后用 T4 连接酶连接,并经鉴定序列正确后,用脂质体转染剂 Lipofectin Reagent 稳定转染 NIH3T3 细胞,免疫细胞化学显色,在激光共聚焦扫描显微镜下观察 Ebpl 蛋白的表达和定位;通过平板集落形成率观察细胞生长增殖能力的改变.结果:重组质粒鉴定正确,成功构建 Ebpl 稳定表达的 NIH3T3 细胞系,并在显微镜下可见绿色荧光,免疫细胞化学显色可见 Ebpl 蛋白表达;转染目的基因的细胞克隆形成率明显升高.结论:成功构建 Ebpl 稳定表达细胞系,Ebpl 融合蛋白表达于胞质,呈不均匀颗粒状、环状分布;Ebpl 在体外能增强 NIH3T3 细胞生长增殖.     

ErbB-3结合蛋白Ebp1对NIH3T3细胞生长增殖的影响

目的：探讨erbB-3结合蛋白Ebp1对NIH3T3细胞生长增殖的影响。方法：将真核表达质粒pEGFP—C1和Ebpl基因经双酶切后用T4连接酶连接，并经鉴定序列正确后，用脂质体转染剂Lipofectin Reagent稳定转染NIH3T3细胞，免疫细胞化学显色，在激光共聚焦扫描显微镜下观察Ebp1蛋白的表达和定位；通过平板集落形成率观察细胞生长增殖能力的改变。结果：重组质粒鉴定正确，成功构建Ebp1稳定表达的NIH3T3细胞系，并存显微镜下可见绿色荧光，免疫细胞化学显色可见Ebp1蛋白表达；转染目的基因的细胞克隆形成率明显升高。结论：成功构建Ebp1稳定表达细胞系，Ebp1融合蛋白表达于胞质，呈不均匀颗粒状、环状分布；Ebp1在体外能增强NIH3T3细胞生长增殖。     

绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白的表达可促进NIH3T3细胞增殖

目的研究外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜蛋白(ex JSRV Env)对NIH3T3小鼠成纤维细胞增殖的影响。方法构建含完整的外源性绵羊肺腺瘤病毒囊膜基因(ex ISRV-env)的重组质粒pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env,并鉴定其正确性。采用脂质体转染技术pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env瞬时转染NIH3T3细胞,利用反转录PCR和Western blot法检测Env的表达,利用CCK-8法和平板克隆形成实验检测Env表达对NIH3T3细胞增殖的影响。结果成功构建了含ex JSRV-env的重组真核表达质粒pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env;以重组质粒瞬时转染NIH3 T3细胞,检测到JSRV Env蛋白的表达,CCK-8法和平板克隆形成实验结果表明转染pc DNA4/myc-His/ex JSRV-env的细胞增殖速度显著高于对照组(空白及阴性)细胞。结论 NIH3T3细胞表达的JSRV Env蛋白可促进NIH3 T3细胞的增殖。     

PI3K/AKT信号通路的抑制促进B7-H4分子的核转移

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/AKT)信号通路对负性共刺激分子B7-H4细胞定位的调控作用。方法体外培养稳定转染B7-H4/HEK293细胞,采用PI3K/AKT特异性抑制剂LY294002和/或出核转运抑制剂来普霉素B(LMB)处理细胞之后,免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜检测B7-H4蛋白在B7-H4/HEK293细胞中亚细胞定位的变化;Western blot法检测B7-H4蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核表达水平的变化。结果激光共聚焦显微镜观察结果显示,PI3K抑制剂LY294002作用于B7-H4稳定转染的B7-H4/HEK293细胞后,与空白对照组相比,B7-H4发生核转移,加入出核转运抑制剂LMB后,核转移的程度显著增加;Western blot法结果显示,LY294002抑制PI3K/AKT信号通路活性24 h后,B7-H4在细胞膜和细胞质中的定位均显著降低(P0.05),而细胞核中B7-H4的定位显著增加(P0.05)。结论 PI3K/AKT信号通路可抑制B7-H4的核转移。     

NIH3T3细胞核内过表达的M-CSF对细胞运动的影响

目的构建M-CSF细胞核内定位表达载体pCMV/M-CSF,探讨核内M-CSF对NIH3T3细胞运动的影响。方法采用PCR的方法扩增人M-CSF活性片段,将其插入核内真核表达载体pCMV/myc/nuc,构建重组体pCMV/M-CSF,经脂质体介导转染NIH3T3细胞,G418筛选后,用免疫细胞化学及Western blot鉴定其在真核细胞中的表达及定位分布,用细胞划痕实验测定M-CSF进入细胞核后对细胞运动能力的影响。结果限制性双酶切及DNA测序分析结果显示插入pCMV/M-CSF的片段为1400bp左右,与预期M-CSF分子大小相当。Western blot结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞能稳定表达M-CSF蛋白;免疫细胞化学结果显示表达的M-CSF定位于NIH3T3细胞核。细胞划痕实验显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞有较强的运动能力。结论成功构建M-CSF核内定位表达载体pCMV/M-CSF,核内M-CSF可加强NIH3T3细胞运动。     

核内M-CSF对NIH3T3细胞内微丝的影响

目的建立M-CSF核内稳定表达的NIH3T3细胞系,探讨核内M-CSF对细胞骨架的影响。方法经脂质体介导核内定位表达重组体pCMV/M-CSF转染NIH3T3细胞,G418筛选后,用Rt-PCR、免疫细胞化学鉴定其在真核细胞中的表达及定位分布,用考马斯亮蓝染色细胞微丝测定M-CSF进入细胞核后对细胞骨架的影响。结果RT-PCR结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞能稳定表达M-CSFmRNA;免疫细胞化学结果显示表达的M-CSF定位于NIH3T3细胞核。考马斯亮蓝染色结果显示转染pCMV/M-CSF的NIH3T3细胞内微丝数量减少,排列紊乱。结论核内M-CSF可引起NIH3T3细胞内微丝数量减少,排列紊乱。     

植烷酸氧化酶真核表达载体的构建及其细胞内定位

目的构建小鼠植烷酸氧化酶（Phyh）真核表达载体,并观察其在NIH3T3细胞中的表达定位情况。方法提取BALB/c小鼠肝脏组织的总RNA,通过RT-PCR扩增得到Phyh编码序列,将其克隆到真核表达载体pcDNA3上;对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,利用脂质体转染方法转染NIH3T3细胞;使用细胞免疫化学技术对重组质粒pcDNA3/HA-Phyh在NIH3T3细胞中的表达及蛋白定位进行分析。结果 PCR、双酶切和测序鉴定表明,pcDNA3/HA-Phyh真核表达质粒构建正确;转染实验发现,该质粒能够在NIH3T3细胞中表达,表达产物主要定位在细胞质中。结论成功构建了带HA标签的小鼠Phyh真核表达载体,该载体能够在哺乳动物细胞NIH3T3中表达,为进一步研究Phyh的细胞内生物学功能提供了一个重要的工具。     

BRAP对LPS诱导的人气道上皮细胞系黏液高分泌的影响

目的探讨蛙皮素受体激活蛋白(BRAP)对脂多糖(LPS)诱导的气道黏液高分泌的影响及相关作用机制。方法体外培养人气道上皮HBE16细胞,转染已构建好的p EGFP-N1-BRAP,以空质粒载体作为对照,给予LPS刺激,同时分别以ERK抑制剂U0126、JNK抑制剂SP600125、P38抑制剂SB203580干预。观察细胞内活性氧(ROS)含量、黏蛋白(MUC)5AC表达和核因子-κB(NF-κB)活性以及细胞活力的变化。结果转染p EGFP-N1-BRAP后ROS明显减少(P0.01);同单纯LPS刺激相比,MUC5AC蛋白含量和mRNA水平在转染p EGFP-N1-BRAP后明显降低(P0.01),NF-κB活性亦呈相同趋势(P0.05);在U0126组,MUC5AC的表达较转染重组质粒组显著降低(P0.01),NF-κB活性也显著下调(P0.05)。结论 BRAP可以通过ROS/ERK/MAPK信号通路阻止胞质内NF-κB的活化,从而下调MUC5AC的生成。     

小鼠NGE基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的：构建小鼠β-NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法：用基因重组技术，将小鼠β-NGF的成熟cDNA序列及其前导序列，克隆到真核表达载体pcDNA3．1 中，用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENET^TM6方法，转染NIH3T3细胞。转染后72h，用G418筛选阳性克隆并培养至20d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Western blot分析并观察该上清中NGF对PCI2细胞突起生长的作用。结果：β-NGF基因在NIH3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论：重组真核表达载体PcDNA3．1 ／NGF构建成功，NGF蛋白在NIH3T3细胞中表达，并具有良好的生物学活性，为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础。     

登革2型病毒NGC株E基因在NIH3T3细胞中的表达及初步鉴定

目的　构建登革 2型病毒E基因的真核表达载体 ,实现登革病毒E蛋白的真核表达。方法　采用逆转录 多聚酶链反应 (RT PCR)扩增登革 2型病毒 (NGC株 )包膜糖蛋白E基因全长片段 ,克隆入真核表达载体pcDNA3的Pcmv启动子下游 ,构建重组真核表达质粒pcDNA3 E ,用脂质体转染法转染NIH3T3细胞 ,表达产物以免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹进行分析检测。结果　成功构建了重组真核表达质粒pcDNA3 E ,通过脂质体转染法导入NIH3T3细胞 ,免疫荧光、SDS PAGE和蛋白质印迹分析检测表明 ,E基因在NIH3T3细胞实现了真核表达 ,产物相对分子质量 (Mr)为 6 0× 10 3。结论登革病毒E基因真核表达载体的构建及E基因的真核表达为研究登革病毒E蛋白的结构与功能、研制登革病毒诊断试剂及核酸疫苗奠定了基础     

小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对NIH3T3细胞增殖的影响

目的:研究新发现的小鼠肿瘤/睾丸抗原Biot2对小鼠NIH3T3细胞生物学行为的影响,探讨基因的生物学功能。方法:构建真核表达质粒pcDNA3.1( )-Biot2,由脂质体包裹稳定转染NIH3T3细胞,用Realtime RT-PCR、Western blot等方法筛选和鉴定Biot2表达阳性细胞克隆,研究其与细胞增殖相关的生物学特征的变化。结果:成功构建真核表达重组质粒pcDNA3.1( )-Biot2,并稳定转染于NIH3T3细胞。与对照组相比,转染了Biot2cDNA的NIH3T3细胞生长速率明显增快。结论:成功地建立稳定转染小鼠新基因Biot2的NIH3T3细胞克隆;Biot2基因能影响细胞增殖的调节,促进NIH3T3细胞的增殖,为进一步研究基因生物学功能奠定了基础。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS3对端粒酶活性的影响

目的研究丙型肝炎病毒非结构区3(HCV NS3)蛋白对端粒酶活性的影响,以探讨HCV NS3蛋白在HCV致癌中的作用,并观察端粒酶活性原位检测法的应用价值.方法利用HCV NS3真核细胞表达质粒pRcHCNS3-5′(表达HCV NS3 N端多肽),pRcHCNS3-3′(表达HCV NS3C端多肽)和空白质粒pRcCMV转染NIH3T3细胞,分别获得11、11和8个阳性克隆;采用链霉素抗生物素-过氧化物酶法(SP)免疫组织化学方法检测转染的NIH3T3细胞中HCV NS3蛋白表达,并通过端粒酶活性原位检测法和端粒酶聚合酶链反应(PCR)酶联免疫吸附反应(ELISA)技术分别检测转染前后NIH3T3细胞端粒酶活性的定位和定量变化.结果 HCV NS3表达质粒pRcHCNS3-5′或pRcHCNS3-3′转染的NIH3T3细胞均表达HCV NS3蛋白,HCV NS3蛋白阳性信号均位于细胞质中,并以前者表达的阳性信号为强(χ2=6.667,P<0.05),各组细胞端粒酶活性存在显著差异(F=143.083,P<0.01),其中质粒pRcHCNS3-5′转染的NIH3T3细胞端粒酶活性最强,11个克隆均呈阳性,质粒pRcHCNS3-3′转染的细胞次之(P<0.05),空白质粒pRcCMV转染细胞和未转染NIH3T3细胞最弱;HCV NS3蛋白的表达水平和端粒酶活性强度之间具有显著相关性(rs=0.808 4,P<0.01);采用端粒酶活性原位检测方法和端粒酶PCR ELISA技术检测结果具有较好的一致性(rs=0.501 96,P<0.01).结论 (1) HCV NS3蛋白可能是通过内源性机制激活细胞端粒酶导致宿主细胞恶性转化;(2) HCV NS3蛋白 N端多肽对宿主细胞端粒酶的激活作用强于C端多肽;(3) 进一步证实端粒酶活性原位检测法是一种适合于病理形态与功能研究的技术.     

免疫毒素基因DT390真核表达载体的构建及功能研究

目的：构建一种新型免疫毒素DT390-mIP10（白喉杆菌毒素390-小鼠γ干扰素诱导性蛋白10）基因的真核表达质粒,并对其功能进行初步研究.方法：通过RT-PCR扩增mIP10基因,并插入到含有DT390基因片段的真核质粒SRα中,构建重组质粒.以PolyFect脂质体转染NIH3T3细胞,用免疫荧光检测重组质粒的表达;用MTT比色法测定重组免疫毒素质粒的生物学活性.结果：构建了DT390-mIP10的真核表达载体SRα-DT390-mIP10,并在NIH3T3细胞中获得表达.表达的DT390-mIP10在体外能有效地杀伤活化的T细胞.结论：免疫毒素基因重组真核表达载体DT390-mIP10的构建成功并在真核细胞中表达,为其在肿瘤及自身免疫性疾病治疗方面的进一步应用研究奠定了基础.     

人衰变加速因子DAF基因真核表达系统的构建

目的：构建含人补体调节蛋白衰变加速因子DAF分子的cDNA编码区的真核重组表达载体pcDNA3-DAF,转染NIH3T3细胞,建立稳定表达人DAF的NIH3T3细胞模型。方法：将人DAF分子的cDNA编码区克隆到真核表达载体pcDNA3,经酶切和测序鉴定后用磷酸钙沉淀法转染NIH3T3细胞,通过G418筛选,建立稳定转染的NIH3T3细胞株。用PCR检测人DAF基因在NIH3T3细胞基因组中的整合;用RT-PCR、Westernblot实验和间接免疫荧光技术分别从RNA水平和蛋白质水平检测人补体调节蛋白分子DAF在细胞株中的表达。结果：成功构建了pcDNA3-DAF重组真核表达载体,并建立了稳定转染的NIH3T3细胞株,成功地表达了目的基因。PCR检测连续传代30次的NIH3T3pcDNA3-DAF细胞,结果显示人DAF基因仍稳定整合在异源细胞的染色体上,并未随着传代而丢失,为稳定的转染细胞株。结论：真核表达载体构建和稳定转染NIH3T3细胞株的建立为进一步研究人DAF功能和多种补体调节蛋白的协同作用奠定基础。     

杜氏利什曼原虫amastin基因重组真核表达质粒的构建与表达

目的：构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白（alllastin）编码基因的真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin，并研究其在NIH3T3细胞中的表达。方法：提取杜氏利什曼原虫基因组DNA进行PCR扩增。将扩增的无鞭毛体蛋白基因片段导入质粒pcDNA3．1（＋）中，构建真核表达重组质粒pcDNA3．1-amastin。以pcDNA3．1-amastin转染NIH3T3细胞，采用免疫荧光染色法和RT-PCR分别鉴定pcDNA3．1-amastin的瞬时表达和稳定表达。结果：在细胞膜和细胞内均观察到较强的绿色荧光，表明pcDNA3．1-amastin成功地转入NIH3T3细胞，并在细胞膜和细胞内获得短暂表达。稳定转染的NIH3T3细胞的总RNA经反转录后，用PCR扩增出无鞭毛体蛋白基因，表明获得了稳定表达。结论：成功地构建杜氏利什曼原虫无鞭毛体蛋白基因的真核表达重组质粒，并且该基因在NIH3T3细胞中获得了稳定表达。     

真核表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建及其在NIH 3T3细胞株中的表达

目的: 构建pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的重组真核表达载体，并在NIH 3T3细胞株中表达。方法: 采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/IgGFc/CD80的真核表达载体pLNCX质粒上，转染NIH 3T3细胞株，经G418筛选细胞，用RT-PCR、流式细胞术检测目的基因表达情况。结果: 经菌落PCR、酶切及一次测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的成功构建；经RT-PCR法，能够从转染的NIH 3T3细胞中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段，流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白。结论: 重组表达载体pLNCX/anti-CD20scFv/IgGFc/CD80/CD28/ζ的构建，并在NIH 3T3细胞株中的成功表达，为该重组质粒转染原代T淋巴细胞从而制备CD20靶向性嵌合锚定T细胞奠定了基础。     

组织因子途径抑制因子/绿色荧光蛋白双顺反子真核表达载体构建及其在NIH 3T3细胞中表达

目的构建含人组织因子途径抑制因子(TFPI)和绿色荧光蛋白(GFP)基因的双顺反子真核表达载体,并验证其在NIH 3T3细胞中的表达,为血管再狭窄的防治提供一个具有示踪和治疗双重作用的有效载体。方法以含有全长cDNA的pIRES-TFPI为模板,多聚酶链反应(PCR)扩增TFPI全长cDNA,经酶切后插入到pIRES2-AcGFP1-Nuc载体中,构建成双顺反子真核表达载体,重组质粒经酶切图谱分析、PCR扩增及测序鉴定后命名为pIRES2-AcGFP1-Nuc-TFPI。将其转染NIH3T3细胞,采用荧光显微镜观察GFP在细胞中的表达,以RT-PCR检测TFPI在细胞内的表达。结果经酶切图谱分析、PCR扩增及DNA测序证实双顺反子真核表达载体构建正确;荧光显微镜可观察到细胞内GFP的表达;RT-PCR证实经TFPI基因转染的细胞内TFPI mRNA表达增高。结论成功构建了包括TFPI和GFP的真核双表达载体,并使其在NIH3T3细胞中顺利表达。     

PRRSV M 蛋白细胞系的培育及其在细胞毒性T淋巴细胞检测方法中的应用

目的 探讨PRRSV M基因在哺乳动物细胞NIH/3T3细胞中的表达,建立一种非放射性、简便易行的检测特异性细胞毒T淋巴细胞的方法.方法 应用RT-PCR扩增得到M基因并克隆入真核表达载体pcDNA3,构建成重组表达载体pcDNA3-M;将重组质粒转染至NIH/3T3细胞,G418筛选克隆;IFA检测M蛋白在转基因NIH/3T3细胞中的表达.用表达M蛋白的重组腺病毒rAd-M免疫小鼠,用表达M蛋白的NIH/3T3细胞和乳酸脱氢酶法检测PRRSV特异性细胞毒T淋巴细胞的杀伤效应. 结果 获得有G418抗性的NIH/3T3/M细胞克隆;IFA检测到有PRRSV M蛋白表达.重组腺病毒rAd-M免疫组可以诱发CTL应答,并明显高于wtAd和PBS对照组. 结论 培育成功一株能表达PRRSV M蛋白的细胞株NIH/3T3/M,可作为PRRSV CTL检测方法中的靶细胞,证明PRRSV M基因能够诱发特异性的细胞免疫.     

小鼠NGF基因真核表达载体的构建及其在NIH3T3细胞中的表达

目的 :构建小鼠 β NGF基因真核表达载体并观察其稳定转染的NIH 3T3细胞系中NGF的表达情况。方法 :用基因重组技术 ,将小鼠 β NGF的成熟cDNA序列及其前导序列 ,克隆到真核表达载体 pcDNA3.1+中 ,用限制性内切酶酶切鉴定重组体。利用脂质体FuGENETM6方法 ,转染NIH 3T3细胞。转染后 72h ,用G4 18筛选阳性克隆并培养至 2 0d。对阳性克隆培养上清中NGF的表达用Westernblot分析并观察该上清中NGF对PC12细胞突起生长的作用。结果 :β NGF基因在NIH 3T3细胞中获得表达。阳性克隆培养上清能促进PC12细胞突起生长。结论 :重组真核表达载体 pcDNA3.1+/NGF构建成功 ,NGF蛋白在NIH 3T3细胞中表达 ,并具有良好的生物学活性 ,为进一步开展NGF基因治疗神经系统疾病奠定了基础     

hCAP基因真核表达载体的构建及蛋白的表达和定位

目的:构建hCAP真核表达载体并检测融合蛋白在细胞内的表达及定位。方法:提取工具细胞CV-1的mRNA,反转录为cDNA。PCR扩增hCAP基因的cDNA全长,并将其克隆至pEGFP-C1表达载体中。进一步将构建的重组载体进行酶切和测序鉴定,并转染到工具细胞COS-7中,提取细胞蛋白进行Western blot。最后利用激光共聚焦显微镜观察pEGFP-hCAP在NIH3T3成纤维细胞内的定位。结果:hCAP基因cDNA全长克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为3 879 bp,测序证实成功。Western blot检测GFP-hCAP融合蛋白表达,相对分子质量(Mr)约为169 000。pEG-FP-hCAP在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。结论:成功构建了真核表达载体pEGFP-hCAP,融合蛋白在NIH3T3细胞中主要定位于细胞周边。