MicroRNA-146a通过靶向TAK1诱导胃癌SGC-7901细胞凋亡

目的:观察微小RNA-146a(miR-146a)对胃癌SGC-7901细胞凋亡的影响及其可能的分子机制。方法:将miR-146a mimic(上调miR-146a表达)和miR-146a inhibitor(下调miR-146a表达)分别转染至人胃癌SGC-7901细胞中,同时设置miRNA无义序列转染为阴性对照组(NC组)。RT-q PCR检测转染后胃癌细胞miR-146a的表达水平;CCK-8法和流式细胞术检测miR-146a对SGC-7901胃癌细胞生长活力和凋亡的影响;RT-q PCR和Western blot法检测miR-146a上调或下调对转化生长因子β激活激酶1(TAK1)/核因子κB(NF-κB)通路的影响。结果:在SGC-7901细胞中,上调miR-146a表达显著促进细胞凋亡,而下调miR-146a表达则显著抑制细胞凋亡。与NC组相比,miR-146a mimics转染SGC-7901细胞后,TAK1的mRNA和蛋白表达均明显下降,差异均有统计学显著性(P0.05),而miR-146a inhibitors转染组TAK1的mRNA和蛋白质表达则显著增加(P0.05),提示miR-146a负调控TAK1表达。敲低TAK1促进SGC-7901细胞凋亡(P0.01),而TAK1过表达TAKI则抑制SGC-7901细胞凋亡(P0.01)。此外,过表达miR-146a和敲低TAK1均能显著上调NF-κB抑制蛋白α(IκBα)和下调B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)表达。结论:本研究结果表明miR-146a通过靶向TAK1抑制NF-κB途径,从而诱导胃癌细胞凋亡。     

miR-148b 基因对高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖、凋亡及免疫抑制因子的影响研究

目的:探讨miR-148b基因对高糖诱导的肾小球系膜细胞增殖、凋亡及免疫抑制因子TGF-β1表达的影响。方法:小鼠肾小球系膜细胞(MMCs)分三组处理,即低糖+miR-148b scramble组(LG组)、高糖+miR-148b scramble组(HG组)和高糖+miR-148b inhibitor组(HG+miR-148b inhibitor组),其中miR-148b scramble和miR-148b inhibitor的转染参照脂质体LipofectamineTM2000转染说明进行瞬时转染,收集转染48 h的细胞,通过qRT-PCR检测各组细胞中miR-148b的mRNA表达;CCK8及流式细胞仪分别检测细胞活力及凋亡率;Western blot检测免疫抑制因子TGF-β1及NF-κB信号通路p-IκBα及下游相关基因cyclin D1和Bax的蛋白表达。结果:高糖可上调miR-148b的表达,转染miR-148b inhibitor后miR-148b的表达明显降低;与LG组比较,HG组细胞活力显著升高,细胞凋亡率显著升高,TGF-β1、p-IκBα、cyclin D1和Bax的蛋白表达均明显升高,与HG组比较,HG+miR-148b inhibitor组细胞活力显著降低,细胞凋亡率显著降低,TGF-β1、p-IκBα、cyclin D1和Bax的蛋白表达均明显降低(P0. 05)。结论:抑制肾小球系膜细胞miR-148b基因表达可抑制高糖诱导的细胞活力、凋亡率及免疫抑制因子TGF-β1表达的增加,机制可能与下调NF-κB信号通路有关。     

miR-122低表达对糖尿病肾病足细胞损伤和IKK/NF-κB信号通路的抑制作用研究

目的:探究微小RNA-122(miR-122)低表达对糖尿病肾病(DN)足细胞炎性因子水平、增殖、凋亡、迁移和IκB激酶(IKK)/核因子κB(NF-κB)信号通路的影响。方法:体外培养人肾小球足细胞HGPC,取对数生长期细胞，分为正常糖组(5mmol/L D-葡萄糖)、高糖组(30mmol/L D-葡萄糖)、inhibitor NC组(转染inhibitor NC片段至细胞，后加入30mmol/L D-葡萄糖)、miR-122 inhibitor组(转染miR-122 inhibitor片段至细胞，后加入30mmol/L D-葡萄糖),每组设置3个重复。24h后，实时荧光定量PCR(qPCR)测定各组细胞中miR-122表达水平，酶联免疫法(ELISA)测定细胞上清液中白介素(IL)-6、IL-1β及IL-10水平，细胞计数试剂盒8(CCK-8)法、5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(EdU)法、Hoechst 33258染色法及划痕法分别测定细胞活力、增殖率、凋亡率及迁移率，蛋白免疫印迹法(WB)测定细胞中IKKα、IκBα、磷酸化(p-)IκBα、NF-κB p65、p-NF-κB ...     

miR-205对体外脓毒症心肌细胞模型细胞凋亡和炎症因子分泌的影响北大核心CSCD

目的:探讨miR-205对体外脓毒症心肌细胞模型细胞凋亡和炎症因子分泌的影响。方法:qRT-PCR方法分析脓毒症大鼠心肌组织中miR-205表达变化,TUNEL法检测细胞凋亡,ELISA法检测TNF-α、IL-6水平。心肌细胞分成Control组、LPS组(LPS诱导)、miR-NC+LPS组(转染mimics control,LPS诱导)、miR-205+LPS组(转染miR-205 mimics,LPS诱导),CCK-8方法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡变化,Western blot检测C-Caspase-3、NF-κBp65蛋白表达,二硝基苯肼法检测LDH水平,硫代巴比妥酸法检测MDA水平,黄嘌呤法检测SOD水平,比色法检测GSH-Px水平,ELISA法检测TNF-α、IL-6水平。用NF-κB信号激活剂处理上调miR-205的心肌细胞,同样检测细胞增殖、凋亡、氧化损伤以及细胞炎症因子分泌水平。结果:脓毒症大鼠心肌组织中miR-205表达水平降低,心肌组织中细胞凋亡指数增加,TNF-α、IL-6水平升高。LPS组心肌细胞中miR-205水平降低,细胞存活率降低,细胞凋亡率升高,细胞中C-Caspase-3蛋白表达增多,培养液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平升高,细胞中MDA水平升高,SOD、GSH-Px水平降低,与Control组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。miR-205+LPS组心肌细胞中miR-205水平升高,细胞存活率升高,细胞凋亡率降低,细胞中C-Caspase-3蛋白表达减少,培养液上清中LDH、TNF-α、IL-6水平降低,细胞中MDA水平降低,SOD、GSH-Px水平升高,与miR-NC+LPS组相比,差异有统计学意义(P<0.05)。NF-κB信号激活剂逆转miR-205对LPS诱导的心肌细胞损伤作用。结论:miR-205抑制体外脓毒症心肌细胞模型细胞凋亡和炎症因子分泌,机制可能与下调NF-κB信号有关。     

p62参与柳氮磺吡啶抑制NF-κB信号途径和诱导人神经胶质瘤U251细胞凋亡机制的研究

<正>目的:以人神经胶质瘤U251细胞为研究对象,从p62参与核转录因子κB(NF-κB)信号途径活化角度,探讨柳氮磺吡啶(SAS)抑制NF-κB信号途径和诱导U251细胞发生凋亡的机制。方法:构建p62 siRNA表达载体,MTT法检测细胞生存率,萤光素酶报告基因分析检测NF-κB转录活性,Western blotting法和间接免疫荧光法检测细胞自噬、凋亡。结果:SAS抑制U251     

MiR-494通过核转录因子-κB通路对脓毒症大鼠肾损伤的作用机制

目的：探讨miR-494 通过核转录因子-κB(NF-κB) 通路对脓毒症大鼠肾损伤的作用机制。方法：大鼠 分为假手术组、脓毒症大鼠模型组（ 模型组）、转染miR-494 inhibitor 脓毒症大鼠模型组（miR-494 inhibitor 组）。Masson 三色法检测大鼠肾组织病变程度,ELISA 法检测炎症因子水平,免疫印迹检测NF-κB 的蛋白表达, TUNEL 检测肾小管细胞凋亡,全自动生化分析仪检测大鼠血清及尿液中血肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）及24 h 尿蛋白定量（UTP）等生物化学指标。结果：与假手术组相比,模型组及miR-494 inhibitor 组大鼠肾组织中miR- 494 表达量均升高,但miR-494 inhibitor 组大鼠miR-494 表达低于模型组;模型组和miR-494 inhibitor 组大鼠血清 中Scr、BUN 和UTP的表达水平均显著升高。与模型组相比,miR-494 inhibitor 组大鼠血清Scr、BUN、UTP水 平显著降低。假手术组肾组织结构完整,miR-494 inhibitor 组肾小球间质增多,肾间质增宽,炎症细胞浸润严重。 与miR-494 inhibitor 组相比,模型组肾小球硬度增加,肾小管周围组织炎症细胞浸润更加严重。假手术组大鼠白 介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和IL-1β 的表达水平最低,模型组大鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 的表达最高; 与模型组比较,miR-494 inhibitor 组大鼠IL-6、TNF-α 和IL-1β 的水平明显降低,肾小管上皮细胞的凋亡率比模型 组低,但高于假手术组。miR-494 inhibitor 组中大鼠NF-κB p65 蛋白表达比模型组低,但高于假手术组。结论： miR-494 低表达可抑制脓毒症大鼠NF-κB p65 的表达,降低炎症因子水平,从而改善肾损伤程度。     

miR-125b对过敏原刺激后支气管上皮细胞凋亡和分泌炎症因子的作用北大核心CSCD

目的:探究miR-125b对过敏原刺激后支气管上皮细胞凋亡和分泌炎症因子的作用和机制。方法:支气管上皮细胞分为Control组、Model组(尘螨抗原提取物处理)、miR-NC组(转染mimics control,尘螨抗原提取物处理)、miR-125b组(转染miR-125b mimics,尘螨抗原提取物处理)、miR-125b+PMA组(转染miR-125b mimics,尘螨抗原提取物和NF-κB信号激活剂PMA处理)。qRT-PCR分析miR-125b表达,流式细胞术分析细胞凋亡,ELISA分析细胞培养液上清中IL-6、IL-29水平,Western blot分析Bax、Bcl-2、p65蛋白表达。结果:与Control组相比,Model组支气管上皮细胞中miR-125b水平降低,细胞凋亡率升高,细胞分泌IL-6、IL-29增多,细胞中Bax、p65蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低。与miR-NC组相比,miR-125b组支气管上皮细胞中miR-125b水平升高,细胞凋亡率降低,细胞分泌IL-6、IL-29减少,细胞中Bax、p65蛋白表达水平降低,Bcl-2蛋白表达水平升高。与miR-125b组相比,miR-125b+PMA组支气管上皮细胞凋亡率升高,细胞分泌IL-6、IL-29增多,细胞中Bax、p65蛋白表达水平升高,Bcl-2蛋白表达水平降低。结论:miR-125b抑制过敏原刺激后支气管上皮细胞凋亡和分泌炎症因子,其机制可能与抑制NF-κB信号通路有关。     

RNA干扰ATF5基因下调NF-κB信号诱导脑胶质瘤细胞凋亡

目的:探讨RNA干扰转录激活因子5(ATF5)基因表达对脑胶质瘤细胞活力、凋亡率及NF-κB信号通路的影响。方法:将设计合成的ATF5特异性siRNA(siATF5组)和阴性对照siRNA(NC组)分别转染人脑胶质瘤U251细胞,采用NF-κB信号通路抑制剂PDTC处理细胞,MTT法、流式细胞术及Western blot法分别检测细胞活力、凋亡率及ATF5、血管内皮生长因子(VEGF)、环氧化酶2(COX-2)、 p-p65、p-IκB和Bax的蛋白水平。结果:转染siATF5的U251细胞中ATF5的蛋白表达显著低于空白对照组(P0.05)。与空白对照组比较,siATF5组细胞活力明显降低,凋亡率明显升高,VEGF、COX-2、 p-p65和p-IκB的蛋白水平明显降低,Bax的蛋白水平明显升高(P0.05)。与siATF5组相比,siATF5和PDTC同时处理的U251细胞活力显著降低,凋亡率显著升高(P0.05)。结论:下调ATF5基因表达可降低脑胶质瘤细胞的活力,诱导细胞凋亡,降低免疫抑制因子VEGF和COX-2表达,其机制可能与下调NF-κB信号通路有关。     

miR-497-5p靶向AKT3对缺血/再灌注损伤诱导的神经细胞氧化应激和炎症反应的影响

目的探究miR-497-5p对缺血再灌注诱导的神经细胞氧化应激和炎症反应的影响以及潜在的作用机制。方法采用小鼠海马神经元细胞构建氧糖剥夺/复氧(OGD/R)损伤模型;氧糖剥夺后复氧6 h、12 h、24 h,检测氧化应激指标的含量,酶联免疫吸附实验检测炎症因子的水平,实时荧光定量PCR检测miR-497-5p的表达水平。检测miR-497-5p mimic和inhibitor的转染效率。双荧光素酶报告实验分析miR-497-5p与AKT3的靶向关系;蛋白质印迹检测miR-497-5p对AKT3表达水平的影响。miR-497-5p inhibitor与AKT3 siRNA单独或共转后OGD/R,检测氧化应激和炎症反应的变化;蛋白质印迹检测叉头转录因子O3(FOXO3)、核因子κB(NF-κB)的表达水平的变化。结果神经细胞经氧糖剥夺复氧后,细胞中ROS和MDA的含量显著升高,SOD的活性显著降低;白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)的含量显著升高,miR-497-5p的含量显著升高。miR-497-5p与AKT3存在靶向抑制关系。miR-497-5p inhibitor转染神经细胞后OGD/R,细胞中氧化应激和炎症反应被抑制,细胞凋亡率显著减低;FOXO3、NF-κB的表达水平显著降低。AKT3 siRNA缓解miR-497-5p inhibitor对OGD/R模型氧化应激、炎症反应、细胞凋亡和FOXO3、NF-κB表达水平的影响。结论 miR-497-5p靶向抑制AKT3的表达,促进OGD/R模型氧化应激和炎症反应。     

NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子转录活性的影响

目的:构建含NADPH氧化酶1(NOX1)近端启动子区的pGL3萤光素酶报告基因载体及缺失NF-κB结合元件的相应载体,分别测定其相应活性,探讨NF-κB结合元件缺失对NOX1启动子区转录活性的影响。方法:采用PCR法克隆NOX1启动子区序列(1 415 bp),将目的片段与pGL3萤光素酶载体分别双酶切、纯化后进行连接(pGL3-NOX1-1415),测序鉴定;应用Alibaba 2.1软件分析NOX1近端启动子区,获取NF-κB结合元件;重叠PCR法将含该元件的启动子区域(88 bp)缺失,并构建相应载体(pGL3-NOX1-1327)。将两载体分别与pRL-TK内参质粒瞬时转染进入A549细胞,采用TNF-α(10μg/L)刺激细胞24 h,萤光酶标仪检测A549细胞的萤光素酶活性。结果:测序鉴定结果提示pGL3-NOX1-1415及NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327载体构建成功;细胞实验显示,TNF-α刺激后,转染pGL3-NOX1-1415的A549细胞萤光素酶活性明显强于对照组(P0.05),而转染NF-κB结合元件缺失的pGL3-NOX1-1327的细胞萤光素酶活性明显低于转染pGL3-NOX1-1415组(P0.05)。结论:TNF-α诱导A549细胞NOX1基因活化与NF-κB密切相关,NF-κB参与了TNF-α诱导的NOX1基因启动子的转录调控。     

MiR-16 modulate temozolomide resistance by regulating BCL-2 in human glioma cells

Temozolomide (TMZ) with radiotherapy is the current standard of care for newly diagnosed glioma. However, glioma patients who are treated with the drug often develop resistance to it and some other drugs. Recently studies have shown that microRNAs (miRNAs) play an important role in drug resistance. In present study, we first examined the sensitivity to temozolomide in six glioma cell lines, and established a resistant variant, U251MG/TR cells from TMZ-sensitive glioma cell line, U251MG. We then performed a comprehensive analysis of miRNA expressions in U251MG/TR and parental cells using cancer microRNA PCR Array. Among the downregulated microRNAs was miR-16, members of miR-15/16 family, whose expression was further validated by qRT-PCR in U251MG/TR and U251MG cells. The selective microRNA, miR-16 mimics or inhibitor was respectively transfected into U251MG/TR cells and AM38 cell. We found that treatment with the mimics of miR-16 greatly decreased the sensitivity of U251MG/TR cells to temozolomide, while sensitivity to these drugs was increased by treatment with the miR-16 inhibitor. In addition, the downregulation of miR-16 in temozolomide-sensitive AM38 cells was concurrent with the upregulation of Bcl-2 protein. Conversely, overexpression of miR-16 in temozolomide-resistant cells inhibited Bcl-2 expression and decreased temozolomide resistance. In conclusion, MiR-16 mediated temozolomide-resistance in glioma cells by modulation of apoptosis via targeting Bcl-2, which suggesting that miR-16 and Bcl-2 would be potential therapeutic targets for glioma therapy.     

miR-21通过靶向FasL基因对脑胶质瘤细胞生长的影响

目的:探讨脑胶质瘤细胞中miR-21对Fas L表达的调控作用以及对细胞生长和凋亡的影响,并研究其分子作用机制。方法:将miR-21模拟物(miR-21 mimics)、miR-21抑制物(miR-21 inhibitor)以及阴性对照(scramble)瞬时转染到U251细胞中,CCK-8法和流式细胞术检测细胞活力和凋亡情况。构建Fas L 3’UTR双萤光素酶报告载体,通过采用双萤光素酶报告实验验证miR-21的靶基因。构建表达载体pc DNA3.1-Fas L,回复实验分析miR-21对细胞凋亡的影响。结果:miR-21过表达可促进U251细胞的活力,抑制细胞凋亡;miR-21表达下调则抑制细胞活力,促进细胞凋亡,和对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。双萤光素酶报告实验和回复实验结果提示miR-21可以通过作用于Fas L的3’UTR区,负向调控其表达,从而抑制细胞的凋亡。结论:miR-21可以通过靶向调控Fas L的表达进而促进U251细胞的生长。     

脑胶质瘤SHG-44细胞MGMT基因甲基化状态及其与细胞对烷化剂药物耐药性关系的研究

目的探讨人脑胶质瘤SHG-44细胞O（6）-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶（MGMT）基因启动子甲基化状态与其蛋白表达以及细胞对烷化剂药物耐药性的相关性。方法取处于对数生长期的人脑胶质瘤SHG-44和U251细胞,分别加入5-氮-2＇脱氧胞苷（5-Aza-CdR）培养6d后收集细胞,同时以未加5-Aza-CdR的正常培养细胞作为对照。提取细胞基因组DNA,采用甲基化特异性PCR（MSP）检测MGMT基因的甲基化状态,并利用蛋白质印迹方法检测MGMT蛋白的表达。将收集的细胞分为3组,分别加入浓度为125、100、75、50、25、15、10μg／ml的尼莫司汀（ACNU）和50、25、15、10、5、2．5、1μg/ml的替莫唑胺（TMZ）以及等量的完全培养液（阴性对照）,采用噻唑蓝（MTT）法分别检测细胞对烷化剂药物的敏感性,以细胞存活50％时所对应的药物浓度（IC50值）作为衡量细胞对药物敏感性的指标,实验重复3次。结果正常培养的SHG-44细胞MGMT基因启动子呈甲基化状态,MGMT蛋白表达缺失,对ACNU和TMZ的IC50值分别为30、11μg／ml,表现为对烷化剂药物敏感;用5-Aza-CdR处理后,SHG-44细胞MGMT基因启动子成功脱甲基化,MGMT蛋白恢复表达,其对ACNU和TMZ的IC50值分别升高了2．5和3．1倍（均P〈0．05）,对烷化剂药物的敏感性发生逆转。而正常培养和5-Aza-CdR处理的U251细胞MGMT基因启动子均呈未甲基化状态,都能表达MGMT蛋白,并且均表现为对ACNU和TMZ烷化剂药物耐药。结论MGMT基因甲基化状态能稳定地反映细胞诱导MGMT蛋白表达的能力,并有可能成为预测肿瘤组织对烷化剂化疗药物敏感性的分子标记。     

Nix和miR-520h对神经胶质瘤发生的影响及相互作用

目的　通过综合分析肿瘤标本中基因和蛋白表达,及体外生物学作用的检测,来评价胶质瘤中Nix蛋白的作用以及Nix蛋白与miR-520h的关系。 方法　选取46例胶质瘤标本,RT-PCR检测miR-520h基因的表达,Western blotting检测Nix 蛋白的表达;培养U251胶质瘤细胞,Western blotting检测Nix蛋白的表达;构建靶向Nix基因的shRNA敲除U251细胞中Nix基因（Nix-kn）, Western blotting检测Nix, IKKα, i-κBα和p-NF-κB/p65 等蛋白的表达水平; has-miR-520h抑制剂转染U251细胞,Western blotting检测Nix, IKKα, i-κBα和p-NF-κB/p65 等蛋白的表达水平。 结果　胶质瘤标本的基因和蛋白检测表明,miR-520h的高表达伴随着Nix蛋白的高表达;体外实验结果表明,与正常培养的U251相比,缺氧培养的U251细胞Nix表达较高;与Nix-kn组相比,Nix-wt组胶质瘤细胞Nix和p-NF-κB/p65表达均明显增高,而NF-κB活性抑制剂蛋白i-κBα表达降低;200 nmol/L的has-miR-520h抑制剂处理细胞后,与正常对照组比较, Nix蛋白表达显著减少,而p-NF-kappaB/p65蛋白表达显著增加。 结论　在神经胶质瘤的发生发展中miR-520h与Nix蛋白的表达相关;miR-520h可能通过促进Nix合成,从而成为一个强大的肿瘤激活剂。     

羟基积雪草苷对LPS诱导小胶质细胞增殖的抑制作用及机制研究

目的:研究羟基积雪草苷对LPS刺激的小胶质细胞增殖的抑制作用及机制。方法:取SD大鼠的新生小鼠,进行小胶质细胞的原代培养,分离纯化小胶质细胞;MTT法筛选LPS刺激小胶质细胞增殖的最佳浓度,观察不同浓度羟基积雪草苷对LPS刺激小胶质细胞后的作用。ELISA检测细胞上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL-1β)的含量,流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡,Western blotting法检测Toll样受体4(TLR4)蛋白的表达,RT-PCR检测NF-κB mRNA的表达。结果:LPS可以明显诱导体外培养小胶质细胞的增殖和炎症因子释放。与LPS组比较,羟基积雪草苷对LPS诱导的小胶质细胞增殖具有显著抑制作用,且具有剂量依赖性,羟基积雪草苷处理小胶质细胞48 h的IC50为10.97 nmol/L。同时羟基积雪草苷使小胶质细胞TNF-α和IL-6的释放显著降低(P0.05);羟基积雪草苷使小胶质细胞的G2期细胞与细胞凋亡率增加,并降低小胶质细胞TLR4和NF-κB的表达。结论:羟基积雪草苷对LPS刺激的小胶质细胞的增殖和炎症因子的生成具有抑制作用,其作用机制可能与抑制TLR-4和NF-κB表达、改变细胞周期并诱导细胞凋亡有关。     

miR-205通过靶向调控TBX18抑制神经胶质瘤细胞的侵袭能力

目的:探讨微小RNA-205(miR-205)在神经胶质瘤组织中的表达模式及其在胶质瘤细胞侵袭中的作用及可能机制。方法:用real-time PCR检测配对神经胶质瘤组织中miR-205的表达,同时用免疫组化方法检测配对组织中TBX18蛋白的表达量;用脂质体将miR-205模拟物(miR-205 mimics)、miR-205抑制物(miR-205 inhibitor)以及相应对照(control)导入U251胶质瘤细胞后,Transwell实验检测细胞的侵袭能力变化;生物信息学分析结合萤光素酶报告基因实验观察miR-205对TBX18的靶向调控作用;采用RNA干扰技术下调U251细胞中TBX18的表达,用Transwell实验检测细胞侵袭能力变化。结果:miR-205在82.6%所检测的神经胶质瘤组织中表达下调,而TBX18在神经胶质瘤组织中表达上调,两者表达呈负相关;过表达miR-205使U251细胞的侵袭细胞数下降(P0.01),抑制miR-205表达后U251侵袭细胞数增加(P0.01);miR-205在U251胶质瘤细胞中能直接靶向抑制TBX18的表达,干扰TBX18的表达亦使U251细胞的侵袭细胞数下降(P0.01)。结论:miR-205在神经胶质瘤中表达下调,miR-205可能通过靶向调控TBX18影响胶质瘤细胞的侵袭能力,这将为完善胶质瘤侵袭的分子机制及开发新治疗策略以提高胶质瘤治疗效果提供有力的理论依据。     

Participation of tumor suppressors long non-coding RNA MEG3, microRNA-377 and PTEN in glioma cell invasion and migration

PurposeGlioma is a common and fatal intracranial tumor. Both miR-377 and lncRNA MEG3 are tumor suppressors. This study was performed to investigate the association between miR-377 and lncRNA MEG3 in glioma cells.MethodsU118 and U251 cell lines were incubated in Dulbecco's modified Eagle's medium supplemented with miR-377 mimics, MEG3 siRNA (si-MEG3) and/or MEG3 overexpression plasmids (pc-MEG3) for 48 h. Cell migration, invasion, apoptosis, cell cycle distribution and the expression of E26 tansformation-specific-1 (ETS-1), phosphatase and tensin homologue (PTEN), E-cadherin, N-cadherin and β-catenin were detected.ResultsMiR-377 mimics increased MEG3 expression and decreased the number of migrated and invaded U118 and U251 cells, without influence on apoptosis in both cell lines. Si-MEG3 transfection increased U118 cell migration and invasion and rescued miR-377 mimics-induced inhibitory in cell migration and invasion. Si-MEG3 decreased U118 cell apoptosis and induced G0/G1 cell cycle arrest, and pc-MEG3 increased U251 cell apoptosis via arresting cell cycle at G2/M phage. MiR-377 mimics and si-MEG3 increased the relative expression level of N-cadherin mRNA, and both si-MEG3 and pc-MEG3 increased E-cadherin in glioma cells. MiR-377 mimics increased ETS-1 mRNA in U118 cells, but decreased it in U251 cells. PTEN was increased by miR-377 mimics and si-MEG3 and decreased by pc-MEG3 in glioma cells.ConclusionsThese results suggested the link interaction of MEG3 with miR-377 and PTEN, but not functioning as the competing endogenous RNA. MiR-377 mimics and MEG3 were tumor suppressors in glioma cells through regulating PTEN expression.     

Micro-RNA29b enhances the sensitivity of glioblastoma multiforme cells to temozolomide by promoting autophagy

To explore whether or not aberrant expression of miR-29b in glioblastoma multiforme (GBM) cells was associated with temozolomide (TMZ) resistance and to elucidate potential underlying mechanisms. Upregulation of miR-29 in GBM cells was achieved by transfecting miR-29b mimics. Changes in cell viability were measured by using CCK-8 assays. Flow cytometry and TUNEL assays were used to quantify the number of apoptotic cells. The expression levels of apoptosis-related proteins as well as autophagy-associated proteins, and the expression levels of both apoptotic and autophagic genes were determined by Western blotting. Autophagy flux was monitored by transfecting mRFP-GFP-LC3 adenovirus. We halted autophagy by introducing Atg 5-specific siRNA or the autophagy inhibitor Bafilomycin A1 (Baf-A1). We also employed a GBM xenograft mice model to confirm the role of miR-29b in vivo. miR-29b overexpression induced inhibition of cell viability, and also induced apoptosis and autophagy in U251 and U87MG cells. Furthermore, upregulation of miR-29b was able to potentiate the level of antitumor activity of TMZ against tested cells. We also found that autophagy induced by miR-29b, at least partially, contributed to the increase of TMZ sensitivity in GBM cells. As was evidenced by blockade of autophagy, the application of Atg 5 siRNA or Baf-A1 was able to significantly reverse these effects. Consistent with observations in vitro, findings of in vivo assessment also confirmed that overexpression of miR-29b was able to effectively halt tumor growth and enhance the antitumor activity of TMZ. miR-29b potentiates TMZ sensitivity against GBM cells by inducing autophagy and the combined use of miR-29 mimic and TMZ might represent a potential therapeutic strategy for GBM patients.     

慢病毒介导的RWDD3沉默对人胶质瘤U251细胞增殖和侵袭的影响

目的:探讨沉默RWDD3表达对人胶质瘤U251细胞生物学特征的影响。方法:构建靶向RWDD3的shRNA重组慢病毒并转染U251细胞,通过real-time PCR和Western blot在mRNA及蛋白水平鉴定转染结果。MTT法检测转染后细胞的细胞活力;平板克隆实验检测克隆形成能力;Brd U实验检测细胞增殖能力;Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力的变化;流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡的改变。结果:real-time PCR和Western blot结果均表明成功建立稳定沉默RWDD3的U251细胞株。与空白对照组及阴性对照组比较,转染RWDD3-shRNA组的细胞活力和克隆形成能力降低;侵袭及迁移能力均下降,穿膜细胞数明显减少;细胞周期进展被抑制,阻滞于G0/G1期,细胞凋亡率增高(P0.05)。结论:RWDD3在胶质瘤细胞增殖和侵袭过程中发挥重要作用,提示RWDD3有望成为人脑胶质瘤基因治疗的候选靶点。