腺病毒介导p27基因转染对离体血管平滑肌细胞增殖的影响

目的探讨p27基因转染对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响及其机制。方法通过构建携带p27基因的腺病毒并转染培养大鼠VSMC,增强其p27的表达,以免疫细胞化学方法检测p27蛋白在VSMC上的表达;并用3H标记的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入及流式细胞仪等方法检测p27过度表达,对有丝分裂原(血清和大鼠血小板衍化生长因子PDGF-BB)刺激VSMC增殖的影响以及细胞周期依赖性激酶2(CDK2)、细胞增殖核抗原(PCNA)和连接蛋白Cx43表达的变化。结果p27阳性表达率随AdCMV-p27转染VSMC时间延长而不断增加,24h达到峰值(85.81%)。AdCMV-p27转染可显著抑制有丝分裂原刺激引起的G0~G1期细胞减少和3H-TdR掺入量的增加(P<0.05);可抑制PDGF-BB刺激引起的CDK2、PCNA和Cx43蛋白表达阳性率的升高(P<0.05);并使p27蛋白表达阳性率由PDGF-BB刺激后的4.23%上升至33.91%(P<0.01)。结论p27过度表达可抑制有丝分裂原刺激引起的VSMC增殖,其机制与其增强p27表达及抑制CDK2、PCNA和连接蛋白Cx43表达有关。     

gax基因对血管平滑肌细胞中p21基因表达的影响

目的：研究p21基因在gax基因抑制血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中的作用。方法：以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV—gax)常规转染VSMC后，应用免疫细胞化学染色检测gax和p21表达的变化；应用RT—PCR检测p21 mRNA表达的变化；应用^3H标记的胸腺嘧啶核苷(^3H-TdR)掺入试验观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响。结果：①AdCMV—gax转染前，血小板衍化生长因子BB(PDGF—BB)下调gax蛋白的表达，AdCMV—gax转染后，无论有无PDGF—BB刺激，VSMC中gax蛋白的表达均比转染前显著增高。②AdCMV—gax转染使VSMC的p21表达比未转染组显著增高。③AdCMV—gax转染使VSMC的^3H-TdR掺入量均较未转染组显著降低。结论：gax基因抑制VSMC增殖的机制与其增强p21表达有关。     

腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC迁移的变化.方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化,Boyden's小室观察gax基因表达增强对VSMC迁移的影响.结果①AdCMV-gax转染前,PDGF-BB下调Gax蛋白的表达,接近正常生理浓度的PDGF-BB(2 ng/ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由36.42%显著降低至22.83%(P＜0.05),随着PDGF-BB浓度的升高,gax基因表达下降程度更加显著;AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.②AdCMV-gax转染使VSMC表达gax增强后,VSMC迁移数较未转染组显著减少.结论增强gax基因表达,可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC迁移.     

腺病毒介导血管平滑肌细胞转染表达p27基因的研究

目的体外培养大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)并以腺病毒介导转染表达p27。方法取大鼠主动脉血管,以常规组织块贴壁法培养VSMC。用位置特异性重组方法构建带p27基因的复制缺陷型腺病毒载体(AdCMV-p27),经鉴定、扩增,以获取高滴度AdCMV-p27转染液,体外转染VSMC。用RT-PCR方法检测p27 mRNA表达,免疫细胞化学法检测p27蛋白表达,流式细胞仪检测p27细胞表达率。结果构建的AdCMV-p27体外转染培养VSMC表达率为85.81%。以免疫细胞化学、流式细胞仪和RT-PCR检测p27表明,转染后p27表达明显增强,并随表达时间延长而增加,24h达峰值。结论腺病毒载体可较高效率介导p27在体外培养的VSMC转染表达。转染表达p27的VSMC可作为研究有丝分裂原对其增殖、迁移以及凋亡等生物学行为影响的良好细胞模型。     

腺病毒介导gax基因转染抑制血管平滑肌细胞增殖

目的　以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞 (VSMC) ,探讨gax基因表达增强后VSMC增殖的变化。方法　以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型 5型腺病毒载体 (AdCMV gax)常规转染VSMC后 ,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化 ;应用四唑盐 (MTT)比色试验、3H标记的胸腺嘧啶核苷 ( 3H TdR)掺入试验和流式细胞仪检测观察gax基因表达增强对VSMC增殖的影响。结果　①AdCMV gax转染前 ,PDGF BB下调Gax蛋白的表达 ,接近正常生理浓度的PDGF BB( 2ng ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由 3 6.42 %显著降低至 2 2 .83 %(P <0 .0 5 ) ,随着PDGF BB浓度的升高 ,gax基因表达下降程度更加显著 ;AdCMV gax转染后 ,无论有无PDGF BB刺激 ,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高。②AdCMV gax转染使VSMC表达gax增强后 ,VSMC的MTT吸光度值和3H TdR掺入量均较未转染组显著降低 ,G0 G1期的VSMC比例较未转染组显著增高 (P <0 .0 1) ,G2 M期和S期细胞比例显著降低 (P <0 .0 1)。结论　增强gax基因表达可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC增殖     

PDGF-BB和SDZ RAD对血管平滑肌细胞p27基因启动子活性和p27 mRNA表达的影响

目的 探讨重组大鼠血小板衍化生长因子(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)和抗增殖剂SDZ RAD对大鼠血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)p27基因启动子活性和p27 mRNA表达的影响.方法 构建含p27基因启动子序列与氯霉素乙酰基转移酶(chloramphenicol acetyl transferase,CAT)报告基因的重组体pXp27,将这个重组体瞬时转染大鼠VSMC,加入PDGF-BB和SDZ RAD干预,测定CAT活性.用RT-PCR法测定其对p27 mRNA表达的影响.结果 10 ng/ml的PDGF-BB使转染后的重组体CAT活性降低,且使VSMC p27 mRNA表达量显著下降.10 ng/ml的SDZ RAD则使重组体CAT活性增高,并使VSMC p27 mRNA表达量显著增加.结论 PDGF-BB或SDZ RAD分别在基因转录水平或促进p27抑制基因启动子活性,进而减少或增加其mRNA的表达.     

细胞周期蛋白质依赖激酶抑制因子在血管平滑肌细胞增殖与增生中的作用

目的探讨细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子p27、p21和p57在血管平滑肌细胞(VSMC)增殖与增生过程中的调控作用.方法分离SD大鼠主动脉中层平滑肌,贴壁法培养平滑肌细胞,无血清培养基培养静止后,分别加入AngⅡ10-6mol/L,血小板源生长因子(PDGF)20ng/ml和10%FBS,在刺激后6、12、24h分别收集细胞,以无血清培养基培养的VSMC作静止对照,以10%FBS刺激的VSMC作增殖对照.用Westernblot分别检测p27、p57和p21蛋白表达量.结果在AngⅡ刺激的VSMC中,p21,p57和p27蛋白表达水平与静止的VSMC中相近,无明显变化(P>0.05);而在PDGF-BB刺激的VSMC中,p21蛋白表达量随刺激时间延长而逐渐增加,在刺激后12h开始增加,24h达高峰(A值为1.578±0.133,对照组A值为1.000±0.011,P<0.01);p57蛋白表达量在刺激24h增加(A值为1.641±0.342,对照组A值为1.000±0.016,P<0.01);p27蛋白表达量随刺激时间延长而逐渐下降,在24h下降最明显(A值为0.401±0.137,对照组A值为0.985±0.023,P<0.01).结论p21和p57的主要作用在于防止VSMC细胞过度增殖.p27蛋白表达量的变化是决定VSMC增殖的关键,并参与VSMC增生的诱导和维持.     

Effect of silencing connexin 43 gene on release of glutamate from astrocytes in rats

目的 构建能有效抑制大鼠星形胶质细胞(astrocytes,ASTs)连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因表达的siRNA载体,并检测抑制Cx43表达对星形胶质细胞谷氨酸释放的影响.方法 合成针对大鼠Cx43基因的siRNA寡核苷酸,构建pGCsi.U6.neo.GFP质粒载体.质粒通过电转方法转染原代星形胶质细胞后,用免疫荧光染色及Western blot检测转染干扰质粒对大鼠ASTs Cx43蛋白表达的影响.用谷氨酸ELISA定量试剂盒检测释放至培养基中谷氨酸的浓度,并用DAPI染色进行细胞计数.结果 测序结果显示,Cx43基因的目的片段正确插入载体,并保持正确的读码框.干扰质粒转染ASTs 48 h后与对照组相比,Cx43蛋白表达明显下降(P＜0.05),细胞存活未受影响,而谷氨酸释放明显减少(P＜0.05).结论 成功构建了抑制大鼠Cx43基因表达的siRNA载体,抑制Cx43表达可降低ASTs谷氨酸的基础释放.     

Cx43基因干扰对大鼠星形胶质细胞谷氨酸基础释放的影响

目的构建能有效抑制大鼠星形胶质细胞(astrocytes,ASTs)连接蛋白43(connexin 43,Cx43)基因表达的siRNA载体,并检测抑制Cx43表达对星形胶质细胞谷氨酸释放的影响。方法合成针对大鼠Cx43基因的siRNA寡核苷酸,构建pGCsi.U6.neo.GFP质粒载体。质粒通过电转方法转染原代星形胶质细胞后,用免疫荧光染色及Western blot检测转染干扰质粒对大鼠ASTs Cx43蛋白表达的影响。用谷氨酸ELISA定量试剂盒检测释放至培养基中谷氨酸的浓度,并用DAPI染色进行细胞计数。结果测序结果显示,Cx43基因的目的片段正确插入载体,并保持正确的读码框。干扰质粒转染ASTs 48 h后与对照组相比,Cx43蛋白表达明显下降(P<0.05),细胞存活未受影响,而谷氨酸释放明显减少(P<0.05)。结论成功构建了抑制大鼠Cx43基因表达的siRNA载体,抑制Cx43表达可降低ASTs谷氨酸的基础释放。     

过表达缝隙连接蛋白Cx43与人脑胶质瘤细胞U251侵袭性的研究

目的 通过上调脑胶质瘤细胞U251的Cx43表达水平,检测其对U251侵袭能力的影响,为抑制肿瘤的恶性浸润提供新的治疗途径.方法 通过构建缝隙连接蛋白Cx43真核表达重组质粒,并转染U251细胞,过表达U251细胞缝隙连接蛋白Cx43,RT-PCR及Weston-blot检测Cx43 mRNA及蛋白表达水平变化.用Traswell细胞培养板结合MTT法测定U251细胞侵袭能力的改变.结果 (1)成功构建pCMV-Cx43 cDNA重组质粒.(2)成功转染U251细胞并筛选稳定转染过表达Cx43细胞株.(3)Traswell细胞培养板结合MTT法,检测到过表达Cx43后U251细胞侵袭能力较正常组下降.结论 过表达缝隙连接蛋白Cx43能抑制人脑胶质瘤细胞U251侵袭能力.     

腺病毒介导的rHSG-1基因转染对自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:应用腺病毒介导的转基因方式转染大鼠增殖抑制基因(rHSG-1),以观察rHSG-1对自发性高血压大鼠(SHR)主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的影响.方法:体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞并转染含有rHSG-1基因的重组复制缺陷型腺病毒载体(Ad5rHSG-1),采用细胞计数、MTT和3H-thymidine参入法,观察rHSG-1对细胞增殖的影响;采用流式细胞仪分析rHSG-1对细胞周期的影响;应用Western Blot方法检测rHSG-1对细胞周期调控蛋白p27Kip1、p21Cip1和增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear angitin,PCNA)的作用.结果:Ad5rHSG-1转染培养的SHR VSMCs后,能明显抑制细胞增殖,与对照组相比抑制率为40%(P<0.01);细胞周期阻滞于G0/G1期,周期调控蛋白p27Kip1、p21Cip1表达升高,PCNA表达降低.结论:rHSG-1基因过表达可以抑制培养的自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖,并可能是通过参与细胞周期调节发挥作用.     

siRNA沉默平滑肌细胞Cx43的表达及对细胞增殖的影响

目的通过siRNA介导的RNA干扰技术沉默平滑肌细胞缝隙连接蛋白Cx43的表达，观察其对平滑肌细胞增殖的影响。方法应用阳离子脂质体转染的方法，将化学合成的特异性378siRNA转染平滑肌细胞设为特异性siRNA组，并以转染非特异性siRNA和空白作为对照，半定量RT-PCR法分析转染不同时间（24、48、72、96h）细胞Cx43mRNA表达水平的变化；同时噻唑蓝（MTT）比色法检测平滑肌细胞增殖，观察转染不同浓度（50、100、150、200 nmol／L）378siRNA对细胞增殖的影响。结果半定量RT-PCR结果显示与非特异性siRNA组及空白对照组相比，转染特异性378siRNA后Cx43mRNA表达水平显著地下调并呈时间依赖性特点。MTT结果显示与空白对照组相比，转染低浓度（50nmol／L）378siRNA早期（24、48h）OD值开始降低，但差异无统计学意义（P〉0．05），随着特异性siRNA浓度的升高，0D值显著降低（P〈0．05）。200nmol／L378 siRNA转染72、96h对细胞的增殖抑制率分别为32．51％、42，67％（P〈0．01），并呈浓度依赖性特点；而作为阴性对照的siRNA转染后则无上述作用。结论转染特异性378siRNA可有效沉默平滑肌细胞缝隙连接Cx43mRNA的表达并抑制平滑肌细胞的增殖。     

粘着斑激酶和丝裂原活化蛋白激酶对纤粘连蛋白诱导平滑肌细胞迁移和增殖的影响

目的　研究粘着斑激酶和丝裂原活化蛋白激酶在细胞外基质成分诱导血管平滑肌细胞迁移和增殖中的作用。方法　通过纤粘连蛋白 (FN)诱导培养的平滑肌细胞迁移和增殖 ,以免疫沉淀和Western印迹法检测粘着斑激酶 (FAK)和丝裂原活化蛋白激酶 (p4 2 / 4 4MAPK)及其磷酸化的表达量。将FAK反义寡核苷酸 (ODN)经脂质体转染细胞 ,观察其对FAK和p4 2 / 4 4MAPK磷酸化、细胞迁移以及增殖的影响。结果　不同浓度FN(5、10、2 0、4 0、6 0 μg/ml)在有效诱导平滑肌细胞迁移和增殖时FAK和p4 2 / 4 4MAPK也呈明显表达 ,2 0 μg/mlFN可使其磷酸化处于较高的表达量。脂质体可有效地介导ODN转染 ,转染效率为 86 7%± 4 5 %。转染后FAK以及p4 2 / 4 4MAPK磷酸化表达量明显减少 ,10、2 0、4 0和 6 0 μg/mlFN组迁移细胞数也分别显著减少 (2 3 2 6 %、2 1 6 3%、19 31%、17 88% ,P <0 0 5 ) ,5～ 6 0 μg/ml不同浓度的FN组 ,细胞增殖减少 2 7 6 7%～ 4 6 6 7% (P <0 0 5 )。 结论　活化的FAK和p4 2 / 4 4MAPK是细胞外基质诱导平滑肌细胞迁移和增殖的重要信号分子 ,二者之间存在着密切的联系 ,由其介导的信号转导促进了这一过程 ,反义FAKODN可有效地对此进行抑制     

血管紧张素Ⅱ和血小板源生长因子对血管平滑肌和心肌细胞细胞周 …

目的 观察血管紧张素Ⅱ（ＡｎｇⅡ）和血小板源生长因子ＢＢ（ＰＤＧＦ－ＢＢ）对血管平滑肌细胞和心肌细胞中细胞周期素和Ｐ２７蛋白表达量的不同影响,方法 培养的血管平滑肌细胞或乳鼠心肌细胞,加入ＡｎｇⅡ１０＾－６ｍｏｌ／Ｌ,ＰＤＧＦ－ＢＢ２０ｎｇ／ｍｌ后２４小时收集细胞,用碘化丙啶（ＰＩ）标记细胞ＤＮＡ,以确定细胞所处的周期,用细胞周期素（ＣｙｃｌｉｎＤ,ＣｙｃｌｉｎＥ,ＣｙｃｌｉｎＡ）或Ｐ２７蛋白的单     

瑞舒伐他汀抑制血管平滑肌细胞表型转化的机制研究

摘要：目的  研究瑞舒伐他汀是否可以抑制大鼠主动脉血管平滑肌细胞（VSMCs）表型转化及其机制。方法  SD大鼠主动脉VSMCs原代细胞培养鉴定,取4～7代细胞用于实验。用不同浓度的瑞舒伐他汀干预VSMCs,Western blot检测各组标本中骨骼肌肌动蛋白（SM-actin）、平滑肌22α（SM-22α）、滑肌肌球蛋白重链（SM- MHC）、骨桥蛋白（OPN）的表达,噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖情况,划痕试验观察细胞迁移情况。通过免疫组织化学法（ICC）检测SM-actin的表达从而观察VSMC的形态。转染过表达KLF-4或空白对照质粒至离体培养的VSMCs中,用瑞舒伐他汀干预,并采用上述实验方法检测VSMCs表型转化情况。结果  MTT结果显示,与对照组比较,瑞舒伐他汀组VSMCs增殖能力降低,差异有统计学意义（P <0.05）。划痕试验结果显示,与对照组比较,他汀组VSMCs迁移减少,差异有统计学意义（P <0.05）。Western blot检测显示,与对照组比较,他汀组VSMCs中SM-22α、SM-MHC、OPN表达增多,差异有统计学意义（P <0.05）。ICC结果显示,与对照组VSMCs的细胞形态比较,他汀组VSMCs形态变细、变长。转染KLF-4过表达质粒后,与对照组比较,转染KLF-4过表达质粒可以增加VSMCs的增殖和迁移,差异有统计学意义（P <0.05）,逆转他汀对VSMCs表型转化有抑制作用。结论  瑞舒伐他汀通过下调KLF-4,抑制大鼠主动脉VSMCs表型转化。

     

间隙连接蛋白connexin43基因在真核细胞中的表达

目的：构建携带间隙连接蛋白connexin43 cDNA的真核表达载体,建立connexin43蛋白高表达细胞株。方法：connexin43 cDNA在大肠杆菌中扩增后连入真核表达载体pEN4,转染中国仓鼠卵巢（CHO）细胞,用甲氨喋呤（MTX）筛选得到connexin43基因高表达细胞。结果：酶切电泳结果显示载体pED4-Cx43按设计构建。经MTX筛选得到不同抗性的CHO细胞,免疫组织化学方法显示有connexin43蛋白的表达,但表达量有限。细胞间染料传递实验证实不同MTX抗性的CHO细胞间传递小相对分子质量物质的能力有差异。结论：利用载体pED4可以使connexin43基因在真核细胞内表达。