siRNA干扰MTH1基因对肝癌HepG2细胞凋亡和迁移的影响

目的 应用siRNA干扰技术抑制人肝细胞癌系HepG2细胞MTH1基因表达,并研究MTH1基因干扰后对HepG2细胞凋亡和迁移能力的影响。方法 设计并化学合成3对特异性MTH1-siRNA,采用阳离子脂质体法瞬间转染肝癌HepG2细胞,离体培养肝癌HepG2细胞,并设正常对照组、阴性对照组及MTH1-siRNA1、MTH1-siRNA2、MTH1-siRNA3转染组。采用蛋白印迹（Western blot）法检测转染MTH1-siRNA后HepG2细胞MTH1蛋白水平表达的变化,并筛选干扰效果最佳序列。运用流式细胞技术和划痕实验检测转染siRNA-MTH1后HepG2细胞凋亡、体外迁移能力的变化。结果 MTH1-siRNA3转染组干扰效果与正常组和阴性对照组相比效果具有统计学意义（P=0.002, P=0.005）。MTH1-siRNA3转染组细胞凋亡率高于正常组及阴性对照组,差异有统计学意义（P=0.012, P=0.013）;MTH1-siRNA3转染组细胞的划痕24、36 h愈合率均低于正常组和阴性对照组,差异有统计学意义（P=0.001, P=0.000）。结论 MTH1在肝癌细胞的凋亡及迁移中起重要作用,干扰MTH1的表达能促进肝癌细胞凋亡并降低肝癌细胞的迁移能力。     

雌二醇对子宫内膜癌Ishikawa细胞MAPK通路的激活及对增殖的影响

目的 探讨雌激素是否能激活MAPK信号转导通路,以及对子宫内膜癌细胞增殖能力的影响。方法 培养子宫内膜癌Ishikawa细胞,按药物干预分为3组：雌二醇（E₂）组、U0126（MAPK激酶抑制剂）+E₂组、对照组。采用荧光定量PCR技术检测各组MEK1/2、ERK1/2 mRNA表达的变化;Western blot法检测各组p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白的活化程度;流式细胞仪检测各组的细胞周期比例;细胞集落形成实验检测各组细胞的增殖能力;体外穿膜实验比较各组细胞的迁移能力。结果 E2组MEK1/2、ERK1/2 mRNA表达增加（P=0.025, P=0.002）,U0126+E2组中,U0126能阻断E2诱导MEK1/2、ERK1/2 mRNA的表达上调（P=0.000, P=0.000）。E2组p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白活化水平升高（P=0.049, P=0.028);U0126+E2组中,U0126能阻断E2诱导的p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白活化（P=0.018, P=0.003）。E2组G₁期细胞比例显著低于对照组及U0126+E₂组（P=0.017）,集落形成率显著高于对照组及U0126+E₂组（P=0.009）,穿过微孔的细胞数显著多于对照组及U0126+E₂组（P=0.000）。结论 雌二醇通过激活MAPK通路,促进子宫内膜癌的发展,MEK抑制剂能阻断并抑制这一作用。     

HIF-1α基因表达沉默对鼻咽癌组织VEGF和CXCR4表达影响的研究

目的：探讨在乏氧条件下，HIF-1α、VEGF及CXCR4在鼻咽癌细胞中的表达，并探讨HIF-1α与VEGF和CXCR4的关系。方法：利用荧光定量PCR方法检测不同乏氧时相HIF-1α、VEGF及CXCR4mRNA表达。利用Westernbolt检测HIF-1α蛋白表达。构建特异性的HIF-1α慢病毒干扰载体，利用慢病毒感染鼻咽癌细胞，杀稻瘟菌素进行药物筛选，利用荧光定量PCR和Westernblot检测干扰效果。利用荧光定量PCR检测HIF-1α表达沉默后，鼻咽癌细胞VEGF和CXCR4的表达变化。结果：在乏氧条件下，鼻咽癌细胞CNE2HIF-1αmRNA表达稳定，蛋白表达增强，VEGF及CXCR4的mRNA表达均明显增强。利用特异性的HIF-1α慢病毒干扰鼻咽癌细胞CNE2，CNE2细胞中HIF-1α表达降低了81％，说明HIF-1α载体构建成功。HIF-1α表达沉默后，VEGF及CXCR4的表达水平也明显降低。结论：乏氧可以诱导鼻咽癌细胞HIF-1α、VEGF和CXCR4的表达，且VEGF和CXCR4的表达受HIF-1α的表达调控。     

CD133、CD68和PD-L1在不同病理级别脑胶质瘤组织中的表达及相关性

目的 探讨人脑胶质瘤组织中胶质瘤干细胞（glioma stem cells,GSCs）标志物CD133、肿瘤相关巨噬细胞（tumor- associated macrophages,TAMs）标志物CD68和负性共刺激分子PD-L1在不同病理级别人脑胶质瘤组织中的表达及其相关性。方法 采用免疫荧光双染法检测不同病理级别脑胶质瘤组织中CD68和PD-L1蛋白的共表达情况;采用实时荧光定量PCR（quantitative real- time fluorescent PCR,qRT-PCR）技术检测30例低级别脑胶质瘤（Ⅰ级和Ⅱ级）组织和30例高级别脑胶质瘤（Ⅲ级和Ⅳ级）组织中CD133、CD68和PD-L1 mRNA的表达,并分析其与临床病理级别之间的相关性。结果 脑胶质瘤组织中PD-L1和CD68共表达在肿瘤相关巨噬细胞上,即大部分PD-L1阳性细胞为肿瘤相关巨噬细胞,高级别组CD68和PD-L1蛋白的共表达明显高于低级别组。在脑胶质瘤组织中,CD133、CD68和PD-L1 mRNA的表达水平均与病理分级呈正相关（r=0.647,P<0.001;r=0.499,P<0.001;r=0.445,P=0.001）;三者在高级别脑胶质瘤组织中的表达均高于低级别脑胶质瘤组织（P＜0.05）; 脑胶质瘤组织中CD133与CD68 mRNA的表达呈正相关（r=0.525,P<0.001）,低级别组和高级别组中两者表达亦呈正相关（r=0.518,P=0.005;r=0.500,P=0.007）;脑胶质瘤组织中CD133与PD-L1 mRNA表达呈正相关（r=0.431,P<0.001）,低级别组和高级别组两者表达亦呈正相关（r=0.398,P=0.036;r=0.417,P=0.027）。结论 脑胶质瘤组织中PD-L1主要由肿瘤微环境中的TAMs表达;CD133、CD68和PD-L1表达与脑胶质瘤的恶性程度密切相关。     

RNA干扰沉默乏氧诱导因子-1a对紫杉醇诱导食管鳞癌EC9706细胞凋亡的影响

目的:探讨食管癌乏氧耐药机制,观察乏氧诱导因子-1α(HIF-1α)对紫杉醇诱导的人食管鳞癌EC9706细胞凋亡的影响。方法:用CoCl2化学乏氧法建立乏氧模型;应用Western blot测定RNA干扰前后,乏氧条件下HIF-1α蛋白表达的变化;应用原位末端标记TUNEL法及AnnexinⅤ/PI双标记法检测RNA干扰前后紫杉醇对乏氧培养细胞EC9706细胞凋亡的影响。结果:EC9706细胞经75μmol/L的CoCl2作用4 h后,即可诱导HIF-1α蛋白表达。RNA干扰技术能明显抑制乏氧诱导的HIF-1α蛋白表达。相同的乏氧条件下,转染HIF-1α-siRNA组细胞的凋亡率与未转染组或转染control-siRNA组相比较差异有统计学意义(P<0.05)。结论:乏氧条件下HIF-1α蛋白对紫杉醇诱导的EC9706细胞凋亡具有抑制作用。以HIF-1α为新的靶点可望提高食管癌的治疗水平。     

TRPM8激活Calcineurin-NFATc3通路调节结肠癌细胞免疫逃逸

目的  探讨TRPM8调节结肠癌细胞免疫逃逸的机制。方法 采用qRT-PCR和Western blot检测结肠癌细胞系SW620和正常人结肠上皮细胞系CCD 841 CoN中TRPM8的表达水平。将干涉和过表达TRPM8载体TRPM8 siRNA和pcDNA3.1-TRPM8转染至SW620细胞，并设置相应对照组（Control siRNA组和pcDNA3.1组），用CCK-8、集落形成实验和流式细胞术检测细胞增殖和凋亡，酶标仪检测Calcineurin活性，Western blot检测Calcineurin-NFATc3信号通路相关蛋白的表达。采用CCK-8检测CD8⁺T细胞与SW620细胞共孵育的细胞活力，Western blot检测Calcineurin特异性抑制剂FK506处理SW620细胞后NFATc3和PD-L1蛋白表达。结果 与CCD 841 CoN细胞相比，TRPM8 mRNA和蛋白在SW620细胞中的表达均增加（P<0.01）。与Control siRNA组比较，干涉 TRPM8表达后SW620细胞活力、细胞增殖能力、Calcineurin活性，以及TRPM8、PD-L1和 NFATc3蛋白表达均降低（P<0.01），而细胞凋亡率和p-NFATc3蛋白表达均升高（P<0.01）；过表达TRPM8可增强细胞活力、细胞增殖能力和Calcineurin活性，上调TRPM8、PD-L1及NFATc3蛋白表达（P<0.01），下调p-NFATc3蛋白表达（P=0.002）。CD8⁺ T细胞与干涉TRPM8表达的SW620细胞共孵育后总细胞活力降低（P=0.002），而与过表达SW620细胞共孵育后总细胞活力增强（P=0.005）。FK506处理可抑制SW620细胞Calcineurin活性，下调NFATc3、PD-L1蛋白表达（P<0.01）。结论 TRPM8过表达可能通过激活Calcineurin-NFATc3信号通路而促进PD-L1表达，从而增强结肠癌细胞免疫逃逸能力，促进结肠癌细胞增殖。     

卵巢上皮癌组织中活性氧与乏氧诱导因子-1α的表达及其相关性

目的 检测卵巢上皮癌组织中乏氧诱导因子-1α（HIF-1α）mRNA、蛋白以及活性氧（ROS）的表达,探讨卵巢上皮癌组织中氧代谢的异常,以及两者在卵巢上皮癌发生发展中的相互作用.方法 应用实时RT-PCR法和免疫组织化学Elivision plus二步法分别测定卵巢上皮癌组织中HIF-1αmRNA及蛋白的表达;应用DCFH-DA法检测组织中ROS的表达.结果 卵巢上皮癌组织HIF-1 αmRNA相对含量（4.466±0.754）明显高于良性卵巢肿瘤（6.073±1.053）（t=-7.701,P=0.000）,良性卵巢肿瘤、早期（5.048±0.645）及晚期卵巢上皮癌（4.146 ±0.632）HIF-1α mRNA表达呈递增趋势（t=5.301,P=0.000）;HIF-1α mRNA表达与组织学分级及淋巴结转移呈正相关（t=3.724、-3.851,均P=0.000）.HIF-1 α蛋白在卵巢上皮癌组织中阳性表达率[63.49％（40/63）1明显高于良性对照[36.36％（8/22）]（U=433,P=0.005）,HIF-1 α蛋白阳性表达率与淋巴结转移及临床分期呈正相关（x2=4.289、12.360,P=0.038、0.000）.卵巢上皮癌组织中ROS表达水平为110.239±18.414,较良性对照（58.366±20.360）明显升高（t=11.068,P=0.000）;ROS表达与卵巢上皮癌组织学分级、淋巴结转移及临床分期呈正相关（t=-2.055、2.816、-4.138,P=0.044、0.007、0.000）.在卵巢上皮癌组织中HIF-1 α蛋白表达与ROS呈中度正相关（r=0.572,P=0.000）;在中低分化组及晚期组中两者呈中度正相关（r=0.540,P=O.002;r=0.572,P=0.000）;在淋巴结转移组中两者呈高度正相关（r=0.703,P=0.001）;HIF-1α mRNA与ROS表达呈低度相关（r=0.376,P=0.002）.结论 乏氧是卵巢上皮癌的基本特征,随着肿瘤进展乏氧程度逐渐加重;HIF-1α的异常表达与卵巢上皮癌潜在的恶性生物学行为密切相关,可能影响卵巢上皮癌预后.在乏氧状态下,ROS与HIF-1 α可能参与肿瘤的发生过程.在卵巢上皮癌侵袭转移过程中,ROS对HIF-1α的正向调节可能发挥重要作用.肿瘤乏氧状态下,ROS对HIF-1 α的调节可以发生在转录和蛋白等水平,主要是蛋白水平的改变.     

基于ROS/HIF-1通路探讨白花蛇舌草多糖对鼻咽癌裸小鼠肿瘤的抑制作用及机制

目的:基于活性氧（ROS）/缺氧诱导因子-1（HIF-1）通路探讨白花蛇舌草多糖对鼻咽癌裸小鼠肿瘤的抑制作用及其可能作用机制。方法:56只BALB/c裸小鼠于右侧腋下接种CNE-2细胞悬液诱导鼻咽癌成瘤,成瘤后的裸小鼠随机分为:模型组、顺铂组（DDP,5 mg/kg）、白花蛇舌草多糖低剂量组（50 mg/kg）、白花蛇舌草多糖中剂量组（100 mg/kg）、白花蛇舌草多糖高剂量组（200 mg/kg）、阴性对照组（NC-siRNA）、si-HIF-1α组、si-HIF-1α+白花蛇舌草多糖组,每组6只,剩余6只裸小鼠作为空白组。各组按相应剂量分别腹腔注射给药,连续14天。测定裸小鼠瘤重及肿瘤体积［苏木素-伊红（HE）染色观察肿瘤组织病理学变化［流式细胞术检测肿瘤组织Treg细胞数量［免疫组化染色检测肿瘤组织Foxp3表达［荧光TUNEL染色检测肿瘤组织细胞凋亡［酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测肿瘤组织中ROS含量［实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time PCR）和蛋白免疫印迹法（Western blot）分别检测肿瘤组织HIF-1α、GLUT1、HK2 mRNA及蛋白表达。结果:与模型组比较,白花蛇舌草多糖高剂量组可明显降低肿瘤重量,降低Foxp3、HIF-1α、GLUT1、HK2表达,明显缩小瘤体积,降低Treg细胞数量,明显增加细胞凋亡及ROS含量（P＜0.01）。与si-HIF-1α组比较,si-HIF-1α+白花蛇舌草多糖组HIF-1α、GLUT1、HK2表达明显降低（P＜0.05）。与模型组比较,si-HIF-1α+白花蛇舌草多糖组ROS含量明显升高,瘤重及肿瘤体积明显减小（P＜0.05）。结论:白花蛇舌草多糖对鼻咽癌裸小鼠肿瘤具有抑制作用,其作用机制可能与降低HIF-1α、GLUT1、HK2表达有关。     

Caveolin-1在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义

目的　探讨窖蛋白-1（Caveolin-1）在子宫内膜癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法 采用免疫组化法及蛋白质印迹法检测45例子宫内膜癌组织（内膜癌组）、35例子宫内膜良性病变组织（良性组）和35例正常子宫内膜组织（正常组）中Caveolin-1蛋白的表达。实时荧光定量PCR法检测内膜癌组中Caveolin-1 mRNA的表达,并分析其与临床病理特征的关系。结果 Caveolin-1蛋白在内膜癌组、良性组、正常组中的表达呈递减趋势,差异有统计学意义（P<0.05）;在内膜癌组淋巴结转移者Caveolin-1 mRNA表达高于无淋巴结转移者（P=0.001）;TNM分期Ⅱ期、Ⅲ+Ⅳ期者高于Ⅰ期者（P=0.002,P=0.040）;低分化、中分化者显著高于高分化者（P＜0.001,P=0.020）;Caveolin-1在子宫内膜癌组织中的表达与年龄及组织分型无明显相关性（P＞0.05）。结论 Caveolin-1在子宫内膜癌组织中高表达,且与淋巴结转移、分化程度和ＴＮＭ分期有关,有望成为子宫内膜癌早期诊断的指标及治疗靶点。     

跨膜接头蛋白PAG1过表达对皮肤鳞癌细胞A431运动能力的影响

目的 研究跨膜接头蛋白PAG1过表达对人皮肤鳞状细胞癌A431运动能力的影响。方法 构建PAG1-EGFP融合蛋白的慢病毒表达载体,采用反转录病毒转染的方法建立PAG1过表达的A431细胞株,实验分为3组：亲本细胞组（未进行基因转染的A431细胞）、对照组（A431细胞转染仅含EGFP阴性对照病毒）、实验组（A431细胞转染PAG1-EGFP病毒）。流式细胞术检测细胞转染率,实时荧光定量PCR及Western blot检测转染后PAG1 mRNA及其蛋白表达,进一步验证细胞转染成功与否;利用划痕修复实验、Transwell迁移实验、侵袭实验三种不同的方法检测PAG1基因的过表达是否会对皮肤鳞癌细胞的生长、迁移和侵袭能力产生影响。 结果 实验组和对照组目的基因病毒的转染表达率分别为（94.97±0.15）%、（94.60±0.35）%;实验组细胞中PAG1基因mRNA的表达量约为亲本细胞组的1.6倍（P=0.000）,转染后实验组中PAG1蛋白的相对表达水平明显增加（P=0.000）,建立了稳定过表达PAG1的A431细胞系;PAG1过表达明显降低A431细胞愈合率（P=0.000）;实验组A431细胞迁移、侵袭能力明显降低（P=0.001, P=0.000）。结论 PAG1的过表达能抑制人皮肤鳞癌细胞运动能力,影响肿瘤的浸润及远处转移。     

共刺激因子B7-H1蛋白在胆囊癌中的表达及与预后的关系

目的 观察B7-H1蛋白在胆囊癌中的表达;探讨其在胆囊癌的发生发展中的作用及其与预后的关系。方法 用免疫组织化学SP法检测B7-H1蛋白在60例胆囊癌组织中的表达;另取癌旁非肿瘤组织20例及胆囊腺瘤性息肉20例作为对照组。结果 胆囊癌组中B7-H1蛋白的表达明显高于癌旁非肿瘤组织组（P=0.003）和胆囊腺瘤性息肉组（P=0.035）;B7-H1蛋白在Nevin（Ⅳ+Ⅴ）期、TNM（Ⅲ+Ⅳ）期、有淋巴结转移组中的表达明显高于Nevin（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）期（P=0.041）、TNM（Ⅰ+Ⅱ）期（P=0.049）、无淋巴结转移组（P=0.000）;与性别、年龄及肿瘤分化程度无关（P>0.05） 。B7-H1蛋白阳性表达组的三年生存期明显短于阴性表达者（P=0.029）。结论 B7-H1蛋白在胆囊癌中高表达导致预后不良,提示B7-H1蛋白在胆囊癌的发生发展和浸润转移中起作用。     

PD-L1表达与结直肠癌预后及临床病理特征关系的Meta分析

目的 探讨PD-L1表达在结直肠癌（CRC）预后及临床病理特征中的意义。方法 系统检索PubMed、Embase、Web of Science、Cochrane Library、CNKI和万方数据库,检索有关PD-L1表达与CRC预后关系的文献。检索时间截止2018年6月。按纳入排除标准筛选文献及提取数据,用Stata SE12.0软件进行Meta分析。结果 纳入18篇文献,共5 724例CRC患者。结果显示：肿瘤组织PD-L1表达与CRC的总生存期（OS）（HR: 1.40, 95%CI: 1.02~1.93, P=0.039）和无复发生存期（RFS）（HR: 1.67, 95%CI: 1.27~2.20, P=0.000）显著下降有关,而与无疾病生存期（DFS）（P=0.933）无显著关联;且PD-L1表达还与肿瘤分化（P=0.016）和淋巴结转移（P=0.028）显著相关,与性别、肿瘤位置、TNM分期、浸润深度、血管侵犯、化疗、MSI状态和KRAS突变无显著相关性。亚组分析中,肿瘤细胞中PD-L1表达与OS（P=0.033）和RFS（P=0.001）显著下降相关,而肿瘤浸润免疫细胞中PD-L1表达与OS（P=0.991）和RFS（P=0.210）的关联比较差异无统计学意义。结论 肿瘤组织PD-L1表达提示结直肠癌预后不良,且肿瘤细胞中PD-L1与肿瘤浸润免疫细胞中PD-L1表达对结直肠癌预后的预测意义可能不一致。     

反义寡核苷酸对鼻咽癌细胞乏氧条件下放射敏感性的影响

目的:探讨乏氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)在乏氧状态下对鼻咽癌CNE-1细胞放射敏感性的影响.方法:氯化钴处理CNE-1细胞模拟乏氧条件下的培养传代,通过脂质体将不同HIF-1α反义寡核苷酸酸导入CNE-1细胞中,根据转染复合物的不同将CNE-1细胞分为反义联合组、正义联合组、脂质体组和单纯放疗组(放疗对照组).X射线单次照射,照射条件为照射率4 Gy/min,共8Gy,细胞照射后继续乏氧条件下培养24 h.MTT法检测CNE-1细胞的存活率,Western blotting检测CNE-1细胞中HIF-1α和VEGF蛋白的表达.结果:在乏氧条件下,反义联合组的鼻咽癌CNE-1细胞存活率明显大于正义联合组和单纯放疗组.Western blotting结果显示,与正义联合组和单纯放疗组相比,反义联合组CNE-1细胞中HIF-1α蛋白表达显著下降(0.162 ±0.055vs 0.872 ±0.191,0.768±0.217,0.863±0.245,P＜0.05);同时反义联合组CNE-1细胞中VEGF蛋白的表达量较正义联合组和单纯放疗组明显减少(0.364±0.078 vs 1.165±0.346,1.068±0.379,1.087±0.266,P＜0.05).结论:HIF-1α反义寡核苷酸能有效抑制HIF-1α的表达,对乏氧状态下的鼻咽癌CNE-1细胞具有放射增敏作用.     

横纹肌肉瘤组织中JMJD2B和HIF-1α的表达及其对预后的意义

目的 探讨组蛋白去甲基化酶JMJD2B和HIF-1α在横纹肌肉瘤（RMS）组织中的表达及意义。方法 选取78例RMS患者通过随访获取生存时间,采用免疫组织化学染色法检测JMJD2B和HIF-1α在RMS组织中的表达情况并分析其与患者临床病理特征及预后的关系。结果 78例样本中,JMJD2B和HIF-1α表达阳性例数分别为46例（59.0%）和44例（56.4%）。JMJD2B和HIF-1α的表达成正相关（P<0.001, r=0.518）且与肿瘤的危险度、治疗、转移、分期有关（均P<0.05)。生存分析显示危险度的级别、新辅助化疗的有无、HIF-1α和JMJD2B表达的高低与患者预后相关（均P<0.05）。进一步采用多因素Cox回归显示JMJD2B（HR=3.161, P=0.039）和危险度（HR=2.925, P=0.001）可作为RMS患者独立的预后因素。结论 JMJD2B和HIF-1α的表达与横纹肌肉瘤的总体生存密切相关,JMJD2B是横纹肌肉瘤患者的独立预后指标。     

人mcl1不同亚型在结肠癌组织中表达变化的临床意义

目的 探讨人mcl1基因不同亚型在结肠癌组织中差异表达的临床意义。方法 采用RT-PCR和Western blot分别检测正常结肠组织、结肠腺瘤、结肠腺癌组织以及相应的癌旁组织各20例中mcl1基因三种mRNA剪接异构体和三种蛋白亚型的表达水平,进而分析这些亚型表达差异与肿瘤临床病理特征之间的相关性。结果 mcl1基因亚型1在结肠肿瘤组织及相应旁组织中的mRNA和蛋白质水平表达均高于正常组（P=0.009, P=0.022）,且腺癌组中的mRNA和蛋白质水平表达亦高于腺瘤组（P=0.004, P=0.034）。亚型2在结肠肿瘤组织及对应旁组织中的mRNA和蛋白质水平表达均高于正常组（P=0.002, P=0.011）,且腺癌组中的mRNA和蛋白质水平表达亦高于腺瘤组（P<0.001, P=0.007）。亚型3在结肠肿瘤组织及对应旁组织中的mRNA和蛋白质水平表达均高于正常组（P=0.027, P=0.045）,但肿瘤组与相应旁组织之间以及腺癌组与腺瘤组之间的比较差异均无统计学意义。结论 研究表明mcl1亚型1和亚型2对结肠癌肿瘤恶性程度呈正相关,可以作为临床评估结肠癌恶性程度有效的诊断指标之一。而亚型3可以作为肿瘤早期诊断的标志物,但其表达水平与恶性程度无明显相关性。     

缺氧调控端粒酶活性及抑制鼻咽癌细胞增殖实验研究

目的探讨缺氧及siRNA沉默缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)后对鼻咽癌细胞中端粒酶催化亚单位(telomerase catalytic subunit,hTERT)、细胞周期和化疗耐药的影响。方法采用三气培养箱对鼻咽癌细胞5-8F和CNE2进行缺氧处理(1%O2),蛋白质印迹法检测不同乏氧时相(0~72h)HIF-1α和hTERT蛋白的表达。将HIF-1α基因特异性siRNA分别转染鼻咽癌细胞株5-8F和CNE2,筛选出沉默效率最高的siRNA,实验分为未处理组(常氧)、未处理组(缺氧)、Negative-siRNA(缺氧)和HIF-1α-siRNA(缺氧),荧光定量PCR及蛋白质印迹检测瞬时转染后hTERT及HIF-1α的表达。流式细胞术(flow cytometry,FCM)分析缺氧或沉默HIF-1α后对细胞周期的影响。MTT法检测缺氧或沉默HIF-1α后,鼻咽癌细胞对顺铂(DDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的化疗敏感性。结果缺氧处理0~72h后鼻咽癌5-8F细胞HIF-1α(F=37.147,P<0.001)和hTERT(F=70.069,P<0.001)蛋白的表达上调,差异有统计学意义。HIF-1α-siRNA对5-8F细胞瞬时转染率>98%。HIF-1α-siRNA组hTERT mRNA表达量为0.37±0.05,显著低于未处理组(缺氧)的1.00±0.00和Negative-siRNA(缺氧)的0.95±0.01,F=360.339,P<0.001;hTERT蛋白表达量为(0.27±0.05),显著低于未处理组(缺氧)0.54±0.00和Negative-siRNA组(缺氧)0.53±0.01,F=24.010,P<0.001。未处理组(缺氧)G0/G1期细胞比例明显增加(45.63±2.01)%,显著高于未处理组(常氧)的(26.75±1.28)%,P<0.001。5-8F细胞未处理组(常氧)对5-FU的IC50分别为(17.30±3.31)μg/mL,未处理组(缺氧)为(32.04±12.75)μg/mL,Negative-siRNA组为(33.90±0.87)μg/mL,HIF-1α-siRNA组为(13.72±2.36)μg/mL,F=3.704,P<0.001。5-8F细胞缺氧组对DDP的化疗敏感性也降低,沉默HIF-1α后,5-8F细胞对DDP的化疗敏感性明显提高。除细胞周期外,CNE2与5-8F的结果均一致。结论缺氧促使鼻咽癌细胞发生G1/S阻滞及化疗耐药,可能与上调hTERT表达,进而上调端粒酶活性有关;沉默HIF-1α显著逆转缺氧诱导的肿瘤耐药并下调端粒酶活性。     

RNA干扰HIF-1α增强人肺腺癌SPCA-1细胞放射敏感性的研究

目的探讨RNA干扰乏氧诱导因子1（HIF-1）增强人肺腺癌SPCA-1细胞的放射敏感性。方法构建干扰HIF-1α质粒pSUPER-HIF-1α，采用荧光定量RT-PCR、Western blot方法观察有氧与乏氧状态下RNA干扰HIF-1α的变化，用成克隆实验观察乏氧时RNA干扰HIF-1α对放射的增敏作用。结果在常氧和乏氧的状态下，RNA干扰HIF-1α引起mRNA的表达水平分别下降64％和76％；在乏氧的状态下，蛋白的表达下降。转染pSUPER-HIF-1α后的细胞存活曲线的D0值为2．5Gy，转染空白质粒细胞和空白对照细胞的D0值分别为5、0Gy和5、1Gy，增敏比为2．1。结论RNA干扰HIF-1α可以增加SPCA-1细胞对放射的敏感性。     

乏氧条件下HIF-1α介导Hela宫颈癌细胞的放射敏感性

目的:探讨乏氧条件下,乏氧诱导因子HIF-1α对Hela宫颈癌细胞放射敏感性的影响以及初步作用机制.方法:MTT法分析不同组别宫颈癌细胞存活分数,流式细胞法(FCM)检测各组细胞的凋亡变化,RT-PCR和Western blot分别检验各组宫颈癌细胞的HIF-1α、VEGF和p53的mRNA和蛋白表达情况,siRNA干扰HIF-1α对宫颈癌放射敏感性的影响,以及对VEGF、p53表达的影响.结果:乏氧条件下通过诱导肿瘤细胞HIF-1α的高表达途径,提高VEGF表达,抑制p53表达来降低Hela宫颈癌细胞的放射敏感性.HIF-1α的siRNA转染联合照射后,在乏氧条件下MTT法显示细胞存活率较非转染组明显下降,流式细胞仪法显示细胞凋亡率明显上升.同时干扰HIF-1 α后明显抑制VEGF的表达,提高p53的表达.结论:抑制HIF-1 α可能通过减少VEGF及增加p53来提高Hela宫颈癌细胞的放射敏感性.     

下调UHRF1的表达在抑制肝癌进展中的作用

目的 探讨UHRF1的异常表达在肝癌（hepatocellular carcinoma, HCC）进展中的作用机制。方法 采用RT-PCR和Western blot法检测UHRF1在20例HCC标本中的mRNA和蛋白表达水平, Western blot法检测不同转移潜能的肝癌细胞HepG2、SMMC7721、MHCC97L和HCCLM3中的UHRF1 的表达水平;siRNA技术干扰HCCLM3细胞中UHRF1表达后,MTT法检测细胞增殖,Western blot 法检测BAX和BCL-2表达水平的改变,流式细胞术检测HCCLM3细胞周期和细胞凋亡的变化。结 果 UHRF1在肺癌组织中的表达水平较癌旁组织显著上调（P<0.05）,随着肝癌细胞转移潜能升高而UHRF1表达水平也依次升高（P<0.01）;siRNA技术干扰HCCLM3细胞中UHRF1表达后,HCCLM3细胞生长速度明显下降（P＜0.05）,HCCLM3细胞的促凋亡蛋白BAX表达水平明显上升,而抑凋亡蛋白BCL-2表达水平明显下降;UHRF1-siRNA干扰HCCLM3细胞48 h时,细胞周期分布无明显影响（P＞0.05）;但UHRF1表达下调有促凋亡作用,与对照组相比,干扰组的细胞凋亡率显著升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 UHRF1基因在肝癌组织中表达上调,下调UHRF1的表达能够抑制肝癌进展,可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡来实现的。     

IL-6诱导小鼠骨髓中性粒细胞中MMP-9的生成与释放的实验

目的 探讨IL-6诱导小鼠骨髓中性粒细胞（PMN）生成和释放基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的作用及激活途径。方法 分离小鼠骨髓PMN,将其分为空白对照组、IL-6刺激组、IL-6+DMSO组、IL-6+STAT3抑制剂Ⅷ组。实时荧光定量聚合酶链式反应检测细胞内MMP-9 mRNA表达,明胶酶谱检测PMN释放的MMP-9活性,Western blot检测PMN中STAT3蛋白磷酸化改变。结果 IL-6刺激后,PMN中MMP-9 mRNA水平明显升高（P=0.0050）,明胶酶谱检测的释放到胞外MMP-9活性明显高于对照组（P=0.0087）,IL-6刺激后PMN中STAT3磷酸化水平明显升高（P=0.0089）。在IL-6作用时加入特异性STAT3抑制剂Ⅷ后,MMP-9 mRNA水平、培养上清液中MMP-9活性以及PMN中磷酸化STAT3蛋白水平与IL-6刺激组相比均明显下降（P=0.0067, 0.048和0.0098）。结论 IL-6刺激骨髓PMN中MMP-9的生成和释放,该作用可能是通过诱导STAT3信号通路磷酸化实现的。