HBV核心蛋白拮抗α干扰素抗病毒活性的初步研究

目的 探讨HBV核心蛋白（HBc）对α干扰素（IFN-α）抗病毒活性可能存在的拮抗机制。 方法 以表达抗黏液病毒A蛋白(MxA)的重组质粒pcDNA3.1-Flag-MxA （野生型）转染肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞,用ELISA和real-time PCR法分别检测转染后HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg和细胞外HBV DNA。HBc核心蛋白表达质粒（pHBc-EGFP）转染HepG2细胞后,RT-PCR法分析IFN-α抗病毒蛋白MxA、双链RNA激活的蛋白激酶（PKR）和2′,5′-寡腺苷酸合成酶（2′,5′-OAS）等mRNA水平。结果 转染MxA重组质粒的HepG2.2.15细胞能够表达MxA,转染48 h时HBsAg、HBeAg比空白对照组显著减少（P＜0.05）,HBV DNA无显著性差异。转染pHBc-EGFP的HepG2细胞,经1 000 IU/ml IFN-α处理后,抗病毒蛋白PKR和2′,5′-OAS mRNA水平未见明显改变,而MxA-mRNA水平显著降低（P＜0.05）。 结论 HBV核心蛋白可能通过抑制抗病毒蛋白MxA的表达,而发挥对IFN-α的拮抗作用。     

核激素受体等对乙型肝炎病毒转录与复制的影响

目的建立乙型肝炎病毒(HBV)在非肝源细胞复制体系,观察核激素受体等对HBV基因转录和复制的调控作用。方法用复制型HBV重组质粒pHBV4.1与核激素受体HNF4、和RXRa/PPARa以及HNF3的表达质粒,分别共转染非肝源细胞株NIH3T3;用Northern吸印杂交检测HBV 3.5 kb、2.4/2.1 kb、0.7 kb mRNA的转录情况,Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平。结果复制型HBV重组质粒pHBV4.1在肝癌细胞中,能检测到3.5 kb HBV RNA转录产物和HBV DNA复制中间体;用pHBV4.1转染NIH3T3细胞后,在没有核激素受体表达质粒共转染时未能检出3.5 kb HBV RNA等转录产物,也无HBV DNA复制中间体;当用核激素受体HNF4和RXRa/PPARa共转染时,能够激活3.5 kb HBV RNA转录和HBV DNA复制,而HNF3未能激活HBV复制,但在核激素受体HNF4或RXRα/PPARα介导的病毒复制体系中,同时共转染HNF3时,均可见3.5 kb HBV mRNA的转录和HBV DNA复制水平下降。结论利用核激素受体等成功地建立HBV在非肝源细胞中的转录与复制,且显示HNF4和RXRa/PPARa可支持HBV在非肝源细胞中转录与复制;HNF3抑制HBV肝特异性基因转录与复制。     

FH535抑制人肝癌细胞HepG2增殖及cyclin D表达

目的 探讨β-catenin抑制剂FH535对人肝癌细胞系HepG2增殖的影响及可能机制.方法 HepG2细胞分为对照组和FH535用药组,使用改良3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐比色法(MTS)检测FH535对HepG2细胞增殖的影响,以Western blot法检测HepG2细胞β-catenin以及cyclin D蛋白表达水平,用实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测HepG2细胞cyclin D mRNA水平.结果 FH535能够显著抑制HepG2细胞的增殖,呈时间和剂量依赖性.与对照组相比,FH535给药组HepG2细胞内β-catenin蛋白表达无差异.FH535给药组细胞wnt/β-catenin信号通路的靶基因cyclin D的mRNA和蛋白的表达显著下降,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.0001).结论 FH535通过抑制cyclin D mRNA及cyclin D蛋白表达而抑制HepG2细胞增殖.     

医用臭氧对HepG2.2.15细胞株中HBV复制和表达作用的研究

用感染HBV的肝癌细胞株（HepG2.2.15细胞株）模拟体内肝细胞。分别用15、25、35、50ug/ml臭氧经过滤后分别作用HepG2.2.15细胞,并在作用前、后的0、5、10、20min后进行采样。测定各观察时间点的HBV DNA复制水平及HBeAg/HBsAg表达量,并与作用前相比较。结果与作用前相比,各浓度组在0min观察点无显著差异;而在5、10、20min观察点有显著差异。医用臭氧对HepG2.2.15细胞株中HBV复制和表达有明显抑制作用。     

核激素受体等对乙型肝炎病毒转录与复制的影响

目的 建立乙型肝炎病毒（HBV）在非肝源细胞复制体系,观察核激素受体等对HBV基因转录和复制的调控作用。方法 用复制型FIBV重组质粒pHBV4．1与核激素受体HNF4、和RXRa／PPARa以及HNF3的表达质粒,分别共转染非肝源细胞株NIH3T3;用Northern吸印杂交检测HBV3．5kb、2．4／2．1kb、0．7kbmRNA的转录情况。Southern吸印杂交检测HBV DNA复制中间体水平。结果 复制型FIBV重组质粒pHBV4．1在肝癌细胞中,能检测到3．5kb HBV RNA转录产物和HBV DNA复制中间体;用pHBV4．1转染NIH3T3细胞后,在没有核激素受体表达质粒共转染时未能检出3．5kb HBV RNA等转录产物。也无HBV DNA复制中间体;当用核激素受体HNF4和RXRa／PPARa共转染时,能够激活3．5kb HBV RNA转录和HBV DNA复制,而HNF3未能激活HBV复制,但在核激素受体HNF4或RXRa／PPARa介导的病毒复制体系中,同时共转染FINF3时,均可见3．5kh HBV mRNA的转录和HBV DNA复制水平下降。结论 利用核激素受体等成功地建立HBV在非肝源细胞中的转录与复铡。且显示FINF4和RXRa／YPARa可支持HBV在非肝源细胞中转录与复制;HNF3抑制HBV肝特异性基因转录与复制。     

他克莫司在体外对HepG2.2.15细胞增殖及乙型肝炎病毒复制的影响

背景:肝癌复发与乙肝病毒再感染两者关系尚不明确,有人认为与肝移植后免疫抑制剂应用有关.目的:观察他克莫司在体外对肝癌HepG2.2.15细胞增殖及对细胞内乙肝病毒复制的影响.方法:选择肝癌HepG2.2.15细胞进行体外培养,第3代细胞培养24 h后加他克莫司进行干预,0 g/L他克莫司作为对照组,50 g/L 他克莫司为低浓度组,100,500 g/L他克莫司为中浓度组,1 000,3 000 g/L他克莫司为高浓度组.结果与结论:①中、高浓度的他克莫司对HepG2.2.15细胞有增殖抑制作用,低浓度无抑制作用,且有相关性.②高浓度他克莫司作用时使HepG2.2.15细胞停止在G0/G1期.③他克莫司可以使HepG2.2.15细胞中CyclinA表达降低,且呈浓度依赖性,他克莫司浓度越高,CyclinA表达越少.④他克莫司作用HepG2.2.15细胞,对HBV的复制无影响.结果说明他克莫司在体外对HepG2.2.15增殖有抑制作用,其中CyclinA可能发挥一定的作用,而对乙肝病毒复制没有影响.     

拉米夫定单独和与α干扰素序贯处理的人肝胚瘤细胞株HepG2.2.15HBV差异复制的研究

目的 研究LAM单独和与IFN-序贯处理对人肝胚瘤细胞株HepG2.2.15细胞的HBV复制的影响,探讨LAM与IFN-α在体外抑制HBV复制的差异.方法 以未处理的HepG2.2.15细胞作为对照组;以1 000 IU/ml浓度IFN-α连续处理HepG2.2.15细胞10 d为单独IFN-α处理组;以0.2、1、5、20、100 μmol/L的LAM处理HepG2.2.15细胞为单独LAM处理组;序贯处理组则以浓度为0.04、0.2、5、25、125、200μmoL/L的LAM连续处理HepG2.2.15细胞7 d,再补充1 000 IU/ml IFN-α与LAM联合处理3 d,然后停止LAM处理,再单独以1 000 IU/ml IFN-α连续处理细胞10 d;分别用ELISA法、点杂交和Southern杂交分析不同处理时期、不同处理组HepG2.2.15细胞分泌的HBV抗原、细胞外HBV DNA、细胞内HBV复制中间体DNA以判断HepG2.2.15细胞内HBV复制情况.结果 LAM连续处理至10 d时,单独LAM处理组HepG2.2.15细胞分泌的HBsAg分别是1.77±0.22、1.65±0.25、1.95±0.19、1.34±0.11、1.07±0.05,分泌的HBeAg是1.41±0.13、1.37±0.09、1.63±0.07、1.26±0.12、1.05 ±0.09,对照组分泌的HBsAg和HBeAg分别是3.34±0.15和3.33±0.05,单独LAM处理组与对照组相比分泌的HBsAg和HBeAg下降,差异有统计学意义(HBsAg的t值为10.21、10.04、9.94、18.62、24.86,HBeAg的t值为23.87、32.97、34.22、27.57和38.35,P均＜0.05).点杂交、Southern杂交分析显示LAM连续处理10 d后,单独LAM处理组的细胞外HBV DNA和细胞内HBV复制中间体DNA不能被检测到.停止LAM处理并代之以1 000 IU/ml IFN-α序贯处理10 d,序贯处理组均有细胞内HBV复制中间体DNA的出现,且细胞外HBV抗原和HBV DNA恢复表达;即HBV颗粒在HepG2.2.15细胞内又重新恢复复制状态并分泌至细胞外.结论 LAM与IFN-α在体外细胞模型中具有不同的抗病毒效应,导致HepG2.2.15细胞内HBV复制的差异性.

Abstract：

Objective To investigate the characteristics of HBV replication in HepG2.2. 15 cells treated with LAM alone or sequentially treated with LAM and IFN-α, and to further explore the different suppressive effect on HBV replication by LAM and IFN-α in vitro. Methods Untreated HepG2. 2. 15 cells were used as control group, HepG2. 2. 15 cells treated with 1 000 IU/ml of IFN-α alone for 10 d were served as IFN-α group. The HepG2.2. 15 cells treated with 0.2,1,5,20,100 μmol/L of LAM were used as LAM groups. HepG2. 2. 15 cells treated with 0. 04,0. 2,5,25,125,200 μmol/L of LAM for 7 d, then combined with 1 000 IU/ml of IFN-α for another 3 d. Afterwards, the cells were treated with 1 000 IU/ml of IFN-α only for another 10 d. These cells were served as LAM/IFN-α sequential treatment group. The ELISA was used for analyzing the secreted HBV antigens, while the Dot blot, Southern blot were applied for analyzing the extracellular HBV DNA and intracellular HBV replicative intermediate DNA in HepG2. 2. 15 cells of different treatment groups. Results The secreted HBsAg in the LAM group were 1. 77 ± 0. 22, 1.65 ±0.25, 1.95 ±0. 19, 1.34 ±0. 11, 1.07 ±0.05, respectively, and the secretion of HBeAg were 1.41 ±0. 13, 1.37 ± 0. 09, 1.63 ± 0. 07, 1.26 ± 0. 12, 1.05 ± 0. 09. The secreted HBsAg and HBeAg in control group were 3. 34 ± 0. 15 and 3.33 ± 0. 05. Statistical analysis showed that HBsAg and HBeAg secretion in the LAM group were significantly reduced by treatment with LAM. The t values of HBsAg were 10. 21,10.04, 9.94, 18.62, 24.86, and the t values of HBeAg were 23.87, 32.97, 34.22, 27.57, 38.35,respectively, all P values were ＜ 0.05. Dot blot, Northern blot hybridization analysis indicated that the extracellular HBV DNA and intracellular HBV replicative intermediate DNA could not be detected in the LAM group after cells treated by LAM for 10 days. When LAM was replaced with treatment of 1 000 IU/ml of IFN-α alone, it could not suppress the HBV replication effectively. Moreover, the intracellular HBV replicative intermediate DNA still existed in almost all groups, accompanied with the recovered expression of HBV antigens as well as extracellular HBV DNA, which suggested that the HBV particles restored replication again and secreted extracellular in HepG2. 2. 15 cells, although the sequential treatment lasted for 10 days.Conclusion The effect of viral suppression by LAM and IFN-α in vitro were different, which attributed to the different HBV replicative characteristcs in HepG2. 2. 15 cells.     

乙型肝炎病毒感染HepG2细胞模型的构建

目的:构建乙型肝炎病毒(HBV)感染的细胞模型.方法:将携带1.2拷贝HBV基因的重组腺病毒感染HEK293细胞进行包装、扩增并分离纯化.将扩增得到的HBV感染HepG2细胞,用ELISA法检测感染后第4天培养上清中的HBsAg,Real-time RT-PCR检测HBV mRNA.结果:ELISA检测结果显示,HepG2细胞感染HBV后上清液中HBsAg呈阳性.Real-time RT-PCR可以检测到HBV mRNA.结论:HBV能在HepG2细胞中表达复制和表达.HBV感染的HepG2细胞模型构建成功.     

HBV感染与IL 29表达的相关性

摘要：目的：检测乙型肝炎患者血清中Ⅲ型干扰素IL-29的表达水平,探讨HBV感染是否会上调IL-29的表达。 方法：收集健康人、乙肝患者的血清,用ELISA试剂盒检测IL-29的表达,并从新鲜全血分离外周血单个核细胞（PBMC）,提取总RNA,半定量PCR方法检测IL-29 mRNA表达水平。构建带萤光素酶（luciferase）报告系统的IL-29启动子质粒,分别转染到能稳定表达HBV病毒颗粒的HepG2.2.15 细胞与对照的HepG2细胞,测萤光素酶活性,并分析HBV对IL-29启动子活性的影响。 结果: 乙肝患者血清中IL-29与IL-29 mRNA的表达水平显著高于健康人,HBeAg阳性患者血清中IL-29及IL-29 mRNA的表达水平均高于HBeAg阴性患者。转染至HepG2.2.15 细胞中的IL-29启动子报告质粒的活性显著高于转染至对照HepG2细胞者。 结论：HBV感染后,激活机体Ⅲ型干扰素IL-29的启动子活性,从而使IL-29的表达水平显著上调。     

转化生长因子 β1 作用下绒毛膜癌JEG - 3 细胞 c - myc mRNA 表达简

目的 观察在转化生长因子β1（TGF-β1）、-β1受体Ⅰ抑制剂（LY364947）和p38MAPK抑制剂（SB203580）作用下,绒毛膜癌JEG- 3细胞中c-myc mRNA的表达变化.方法 用5 ng/ml的TGF-β1以及1 μM 、3 μM TGF受体Ⅰ抑制剂（LY364947）和1 μM 、3 μM p38MAPK抑制剂（SB203580）作用JEG- 3细胞,用qRT-PCR技术检测各组细胞中c-myc mRNA的表达差异.结果 与正常对照组比较,5 ng/ml TGF-β1组细胞中c-myc mRNA的表达水平升高（P〈0.05）;p38 MAPK抑制剂（SB203580）和TGF-β受体Ⅰ抑制剂（LY364947）均抑制了c-myc mRNA的表达,且抑制作用与应用浓度呈正相关（P〈0.05）.结论 c-myc作为TGFβ1/Smads通路的下游靶基因,其调控有赖于TGFβ1与受体Ⅰ的结合,同时,在绒毛膜癌JEG-3细胞中,TGF-β1介导的Smad途径与 p38 MAPK信号转导存在交互作用.