核基质结合区修饰的附着体载体介导的EGFP基因体外表达

目的建立一个非病毒介导外源基因高效转移和稳定表达体系。方法采用EB病毒(EBV)来源的附着体质粒载体,并结合顺式作用元件IFN-MAR构建重组质粒pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR。采用荧光显微镜观察并摄片,FACS及逆转录-聚合酶链反应检测EGFP表达阳性的COS-7细胞比例、荧光表达强度及EGFP基因的转录。通过Southern印迹和质粒还原实验分析质粒DNA在细胞中存在的形式。结果本实验构建的重组质粒载体pcDNA3-EGFP-EBVR和pcDNA3-EGFP-EBNA1-MAR在转染进入COS-7细胞后以染色体外附着体的形式存在。由于EBVR的存在,可以在体外获得EGFP较长时间的稳定表达。IFN-MAR替代O riP后,仍可在体外获得EGFP的稳定表达。结论MAR修饰的EBV附着体载体可以在体外获得外源基因高效稳定的表达。     

L型电压门控钙通道α1C亚基羧基末端肽段真核表达载体的构建和表达

目的 构建增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)标记的L型电压门控钙通道(L-type voltage-gated calcium channels,L-VGCCs)α1C亚基羧基末端肽段(CT,1587-2169)的真核表达载体,并在COS-7细胞中表达.方法 采用RT-PCR方法扩增CT的cDNA,克隆至真核表达载体pcDNA3.1;采用PCR方法扩增标签蛋白EGFP的cDNA,克隆至重组体pcDNA3.1-CT,EGFP位于CT的羧基末端;采用脂质体转染法将重组体pcDNA3.1-CT-EGFP转染COS-7细胞,通过荧光显微镜和免疫印迹等方法检测重组体的表达.结果 扩增了CT和EGFP的cDNA;构建的pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析证实了其序列的正确性;荧光显微镜下转染重组质粒的COS-7细胞中观察到绿色荧光,免疫印迹分析显示pcDNA3.1-CT-EGFP转染组有明显条带.结论 成功构建pcDNA3.1-CT-EGFP真核表达载体,并且在COS-7细胞中得到表达.     

人源化BPVL1-GFP融合基因的构建以及在哺乳动物细胞中的瞬时表达

目的：构建牛乳头瘤病毒晚期基因L1-GFP融合基因真核表达质粒，自细胞水平探讨优化密码对晚期基因L1蛋白瞬时表达的影响。方法：用PCR方法扩增获得优化密码人源化BPVL1(hL1)基因。TA克隆后，酶切释放hL1基因，定向插入质粒pET30a／NM-GFP的BamHⅠ、SacⅡ位点，获得正确框架的hL1-GFP融合基因。再用BamHⅠ、NotⅠ酶切释放hL1-GFP融合基因，与pcDNA3载体定向重组构建真核表达质粒pcDNA3／hL1-GFP。同法克隆获得含野生型BPVL1-GFP融合基因的表达质粒pcDNA3／wL1-GFP。用质粒DNA分别在体外转染哺乳动物细胞COS-1细胞和Wish细胞，荧光显微镜下观察L1-GFP融合蛋白的瞬时表达情况。结果：酶切鉴定表明成功构建了含wL1-GFP、hL1-GFP的真核表达栽体，与pcDNA3／wL1-GFP相比，pcDNA3／kL1-GFP在COS-1细胞、WISH细胞中获得有效表达。结论：优化密码能提高乳头瘤病毒L1基因在哺乳动物细胞内的蛋白表达。     

携带EGFP与rtTA双基因的逆转录病毒载体的构建及其在PA317细胞中的表达

目的 构建表达增强型绿色荧光蛋白(EGFP)、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP-rtTA,并在PA317细胞中表达.方法 以质粒pEGFP-C1为模板进行PCR反应获得EGFP基因片段,定向插入逆转录病毒载体pLXSN,筛选出正确的重组逆转录病毒载体pLXSN-EGFP.PCR方法从pTet-on质粒中扩增出rtTA基因,酶切纯化后克隆于逆转 录病毒载体pLXSN-EGFP中,限制性内切酶酶切分析及PCR鉴定筛选出正确的重组载体pLXSN-EGFP-rtTA,脂质体介导转染PA317细胞,PCR方法检测PA317细胞内EGFP、rtTA基因,RT-PCR方法检测PA317细胞内rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜观察EGFP基因的表达情况.以NIH3T3细胞为靶细胞测定重组逆转录病毒滴度.结果 成功构建了表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,转染PA317细胞后,RT-PCR方法可检测到rtTA基因的mRNA表达,荧光显微镜下可观察到EGFP基因表达所产生的绿色荧光,说明连接有EGFP和rtTA双基因的逆转录病毒载体在PA317细胞中可正常表达,转染pLXSN-EGFP-rtTA载体的PA317细胞可产生4.8x 104 CFU/ml病毒滴度的重组病毒.结论 成功构建表达EGFP、rtTA双基因的重组逆转录病毒载体,该载体可在PA317细胞内正常表达,获得较高滴度的病毒上清.     

针对增强型绿色荧光蛋白RNA干扰表达载体的构建和鉴定

目的：构建针对增强型(EGFP)的pSUPER siRNA(small interferencing RNA)表达载体,并在哺乳动物细胞COS-7细胞中观察其干扰效果．方法：设计针对EGFP编码区的寡核苷酸链,体外退火后克隆入经Bgl Ⅱ和HindⅢ双酶切线性化的干扰载体pSUPER中,对重组质粒进行酶切分析和DNA序列测定．通过脂质体介导,将重组干扰质粒与pIRESE2-EG-FP瞬时共转染COS-7细胞,48h后荧光显微镜下观察干扰效果．结果：经酶切鉴定及DNA序列测定证实,重组质粒中已插入了目的基因片段．瞬时共转染后荧光显微镜观察结果显示：只转染pIRES2-EGFP及共转染pIRES2-EGFP和空载体pSUPER的COS-7细胞中有大量的EGFP表达．而共转染pIRES2-EGFP和pSUPER-R237、pSUPER—R304、pSUPER-R447的COS-7细胞中发出荧光的细胞数量明显减少,荧光强度也明显降低．结论：成功构建了针对EGFP的RNA干扰表达载体pSUPER—R237,pSUPER—R304和pSUPER—R447,并与pIR—ESE2一EGFP瞬时共转染COS-7细胞,有效地抑制了EGFP在哺乳动物细胞中的表达。     

重组CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达

目的研究构建于重组真核表达载体pcDNA3-CD200上的CD200基因在COS-7细胞中的瞬时表达。方法体外扩增并酶切鉴定pcDNA3-CD200质粒；常规方法培养COS-7细胞；用电转染基因法将pcDNA3-CD200质粒转入COS-7细胞中，用流式细胞术（FCM）检测转染细胞CD200表达。结果转染COS-7细胞后72h，CD200基因表达阳性的细胞计数率为44．5％。结论成功的利用电转染基因法将重组真核表达载体pcDNA3-CD200转染到COS-7细胞中，并实现了在COS-7细胞中的瞬时表达，为进一步研究CD200的生物学活性以及信号传导奠定了基础。     

携带人bcl-2基因的慢病毒表达载体的构建及其在人原代卵巢颗粒细胞中的表达

目的 构建及鉴定bcl-2基因慢病毒表达载体,并观察在体外人卵巢原代颗粒细胞中的表达.方法 采用PCR技术从含有人bcl-2基因的质粒克隆模板pCMV-SPORT6钓取bcl-2基因,并将基因克隆到慢病毒载体表达质粒pGC-FU(含EGFP基因)中,构建慢病毒载体表达质粒pGC-FU-bcl-2,通过酶切、测序验证bcl-2基因后,将pGC-FU-bcl-2质粒和包装质粒pHelper1.0、pHelp-er2.0共同转染人胚胎肾上皮细胞系293T细胞.获得携带bcl-2基因和EGFP基因的重组慢病毒GC-FU-bcl-2,并转染靶细胞人卵巢原代颗粒细胞.通过检测标志蛋白增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和目的 蛋白bcl-2进一步验证pGC-FU-bcl-2在靶细胞中的表达.结果 (1)pGC-FU-bcl-2中携有正确的bcl-2基因,并能在人类细胞中表达;pGC-FU-bcl-2共转染包装细胞293T能产生重组病毒GC-FU-bcl-2;(2)目的 基因bcl-2能被重组慢病毒高效地转导入靶细胞人卵巢原代颗粒细胞,并达到稳定的表达,荧光显微镜下能直接观察到GFP,Western blotting能检测到bcl-2蛋白在靶细胞中的表达.结论 成功构建了携带bcl-2基因的重组慢病毒载体,转染人卵巢原代颗粒细胞后能够稳定表达bcl-2基因,为进一步研究bcl-2的功能和细胞凋亡相关疾病的治疗奠定基础.     

βhCG-CTP/pcDNA3重组真核表达载体的构建及表达

目的克隆并表达βhCG-CTP基因片端,探讨采用βhCG-CTP基因片段免疫小鼠进行免疫避孕的可能性.方法采用化学合成法得到含有βhCG-CTP基因片段,亚克隆至真核表达载体pcDNA3中,然后转化大肠杆菌DH5α,利用脂质体介导将pcDNA3/βhCG-CTP重组质粒表达载体转染到COS-7细胞,免疫组化法检测βhCG-CTP基因在哺乳动物细胞中的表达情况.结果重组质粒经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切和测序证实插入序列与预期设计完全一致;利用脂质体介导将pcDNA3/βhCG-CTP重组质粒表达载体导入COS-7细胞,获得了βhCG-CTP的瞬时表达.结论成功构建了βhCG-CTP真核表达载体pcDNA3/βhCG-CTP,该载体能在哺乳动物细胞中正确表达,表达产物βhCG-CTP能够被抗βhCG抗体所识别.     

小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建小鼠Sema3A基因过表达慢病毒载体。方法通过体外合成小鼠全长Sema3A c DNA,采用Gateway技术将其基因插入到p Down-m Sema3A-IRES/EGFP质粒中,再交换重组获得重组质粒p LV/EXPNZ-puro-m Sema3A-IRES/EGFP,经过测序鉴定后,包装与浓缩慢病毒载体p LV(Exp)-Puro-CMV-m Sema3A-IRES/EGFP,最后重组慢病毒载体转染293T细胞获得病毒液。结果重组慢病毒载体11 538 bp,测序结果证实Sema3A基因共2 319 bp正确插入带有EGFP的载体中,成功构建小鼠Sema3A基因过表达载体。结论成功构建小鼠慢病毒载体p LV(Exp)-Puro-CMV-m Sema3A-IRES/EGFP,为该基因在特定细胞内过表达株的筛选奠定基础。     

Delta1-IRES-EGFP双顺反子逆转录病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建并鉴定人Delta1和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因双顺反子逆转录病毒表达载体.方法利用基因重组技术将人Delta1基因构建到含IRES-EGFP逆转录病毒载体中;电穿孔法将重组质粒pDelta1-IRES-EGFP分别转入单、双嗜性包装细胞GP E86和PA317,嘌呤霉素(puromycin)筛选获得阳性表达克隆;"乒乓球"法提高病毒滴度;重组病毒感染NIH3T3细胞,流式细胞仪(FACS)及RT-PCR法分别检测细胞荧光和Delta1 mRNA表达变化;C2C12共培养实验检测蛋白的功能.结果酶切、PCR鉴定及DNA测序证实逆转录病毒表达载体pDelta1-IRES-EGFP构建正确;经体外包装,获得最高滴度9.7×105 CFU/ml的重组病毒液;重组病毒液感染NIH3T3细胞,FACS检测部分细胞荧光强度显著提高;RT-PCR证实细胞内有外源基因Delta1表达;C2C12共培养实验证实外源蛋白Delta1可抑制C2C12细胞的分化.结论逆转录病毒基因转移系统安全,效率较高,可获得外源基因长期、稳定的表达.