细茎石斛多糖的提取分离纯化和性能分析

 目的提取分离细茎石斛水溶性多糖，并研究其结构性质。方法经提取、离心、沉淀、脱蛋白后的粗多糖，进一步用DEAE-纤维素，Sephacryl S-400HR,Sephacryl S-200HR凝胶渗透柱色谱分离纯化，对分离到的主要多糖应用高碘酸氧化、高效凝胶渗透色谱(HPGPC),TLC,GC,GC-MS，IR等方法进行组成结构分析。结果从细茎石斛水溶性多糖提取物中分离到8种均一多糖，DMP1a-1,DMP1a-2,DMP2a-1,DMP3a-1,DMP4a-1,DMP5a-1,DMP6a-1和DMP7a 1,其中DMP1a-1的相对分子质量(Mr)为28 000，葡萄糖、甘露糖组成摩尔比为1：4.798，分子中1→3、1→4(或1→2)、1→6连接的糖苷键数比为8.75∶23.59∶1，红外光谱数据显示为β-D-吡喃甘露聚糖。结论8种均一多糖首次从细茎石斛中分离得到，其中DMP1a-1为β-D-吡喃型葡萄甘露聚糖。     

细茎石斛多糖DMP2a-1的结构分析

 目的研究从细茎石斛[Dendrobium moniliforme(L)Sw]中分离纯化得到的一种相对分子质量为60×10³的多糖DMP2a1的化学结构。方法应用紫外、红外、高碘酸氧化、甲基化分析、质谱及¹H,¹³CNMR等化学和光谱方法研究该多糖的结构特征。结果多糖DMP2a-1主链由1,4连接的α-D-吡喃葡萄糖基组成,β-D-甘露糖以端基糖的形式位于1,4α-D-吡喃葡萄糖基的O6位上,每6个1,4连接的葡萄糖残基上有1个O6位发生了取代。结论细茎石斛多糖DMP2a-1是一新结构多糖,为首次从该植物中分离得到。     

细脚拟青霉多糖PTPS-1的结构特征和抗肿瘤活性的初步研究

目的分析鉴定细脚拟青霉多糖PTPS-1的理化性质和结构特征,并观察其抗肿瘤活性。方法采用DEAE-纤维素及Sephadex G-100柱色谱分离纯化得到PTPS-1;利用HPLC、GC、IR、部分酸水解及NMR分析PTPS-1的相对分子质量、组成和结构特征;采用CCK-8检测观察PTPS-1对小鼠脾细胞和PTPS-1刺激培养的小鼠腹腔巨噬细胞上清对Sp2/0细胞的增殖活性。结果PTPS-1的纯度为98.977%,平均相对分子质量为1.84×104,由甘露糖和半乳糖组成,二者摩尔比为1.3∶1,糖链结构中主链含有α-(1→6)、α-(1→2)和β-(1→3)连接的糖苷键,支链含有Gal-(1→3)连接。PTPS-1可明显促进小鼠脾细胞的增殖(P<0.01),PTPS-1刺激培养的小鼠腹腔巨噬细胞上清能抑制Sp2/0细胞的增殖(P<0.01)。结论PTPS-1是从细脚拟青霉中分离出的具有免疫调节和抗肿瘤活性的中性杂多糖。     

桑枝多糖的分离纯化及结构初步分析

目的:从桑枝中分离纯化出桑枝多糖,并研究其组成及初步结构。方法:桑枝经水提醇沉,脱蛋白、DEAE-纤维素柱和SephadexG-100柱层析,得RMPS1和RMPS2二个多糖组分,采用TLC、GC、HPLC、IR和Smith降解等方法分析其组成和初步结构。结果:RMPS1和RMPS2的平均分子量分别为:5.8×105,6.5×105,RMPS1有鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖组成,其摩尔比为:1.08∶1∶1.40∶1.57;RMPS2有鼠李糖、葡萄糖和半乳糖组成,其摩尔比为:11.38∶1∶1.35;通过高碘酸氧化和Smith降解初步分析,RMPS1、RMPS2中连接方式主要为1→2、1→4糖苷键,此外包括1→3糖苷键,红外光谱显示,均具有糖的特征吸收峰。结论:首次测定桑枝多糖RMPS1和RMPS2的初步结构,为桑枝多糖的进一步研究提供依据。     

杨梅素对小鼠脾淋巴细胞和腹腔巨噬细胞增殖的影响

目的:研究杨梅素体外对小鼠脾脏淋巴细胞增殖及腹腔巨噬细胞活化的影响。方法:取健康小鼠,MTT法检测杨梅素对小鼠脾淋巴细胞增殖的作用;中性红法测腹腔巨噬细胞吞噬活性;Griess试剂法测NO释放量;Elisa法测TNF-α、IL-1β和IL-4的含量。结果:杨梅素对未活化及丝裂原(Con A、LPS)活化的淋巴细胞增殖均有明显促进作用;可剂量依赖性地增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力和促进NO释放;促进RAW264.7细胞TNF-α、IL-1β产生,抑制IL-4的释放。结论:杨梅素可能通过促进小鼠脾淋巴细胞增殖和提高巨噬细胞吞噬及分泌功能,提高机体免疫功能。     

铁皮石斛原球茎多糖的研究

 目的 研究铁皮石斛原球茎多糖的理化性质。方法 经过水提醇沉、脱蛋白和透析等步骤获得铁皮石斛粗多糖（CDO）和原球茎粗多糖（CDOP）;CDOP经过纤维素DE-52和葡聚糖凝胶Sephadex G-200柱层析获得6个均一多糖;用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定均一多糖的纯度及相对分子质量;用气相色谱法（GC）分析粗多糖和均一多糖的单糖组成;用高碘酸氧化-Smith降解反应研究均一多糖的一级结构。结果 CDO主要由甘露糖和葡萄糖组成,物质的量比为4.29∶1.00;CDOP主要由半乳糖、阿拉伯糖和葡萄糖组成,物质的量比为2.80∶1.00∶0.61。从CDOP中获得了6个质量均一的多糖,分别为DOPW-1（78×103）、DOPW-2（37×103）、DOPS1-1（287×103）、DOPS1-2（351×103）、DOPS1-3（335×103）和DOPS1-4（171×103）;它们的单糖组成及物质的量比等特点与DOP的相同;各均一多糖分子中的1→3糖苷键均主要由半乳糖组成,还含有阿拉伯糖、葡萄糖和鼠李糖;除DOPS1-4外,各均一多糖的一级结构中均不存在1→4糖苷键。结论 这6个均一多糖为首次从铁皮石斛原球茎中得到。     

酶解等4种方法用于中药废弃物资源化研究初探(Ⅰ)——以脉络宁注射液生产中石斛药渣的多糖资源化研究为例

目的:通过4种不同提取方法用于中药生产中废弃物的多糖资源化的比较研究,优选出脉络宁注射液生产废弃物石斛药渣中提取多糖的方法,实现对中药资源的再循环利用。方法:采用酶解法、湿法超微粉碎法、超声法和加热回流法分别提取石斛药渣中石斛多糖,以苯酚-硫酸法测定其多糖提取率;通过单因素考察和正交试验对提取率最高的提取方法进行工艺优选;考察石斛药渣多糖(DDP)对小鼠脾淋巴细胞的代谢转化和小鼠单核巨噬细胞RAW264.7释放一氧化氮(NO)能力的影响。结果:4种提取方法的多糖提取率分别为0.51%,8.79%,5.34%,3.44%,确定最佳提取方法为酶解;其最佳酶解条件:p H5.3,料液比1∶55,温度50℃,酶活性4 000 U·g-1,提取时间300 min;与对照组比较,质量浓度在62.5~125 mg·L-1,DDP显著促进小鼠脾淋巴细胞增殖,DDP与脂多糖(LPS)协同促进作用显著(P0.05,P0.01),质量浓度为62.5 mg·L-1时,DDP与Con A协同促进作用显著(P0.05),质量浓度在62.5~500 mg·L-1,DDP对小鼠单核巨噬细胞RAW264.7产生NO的促进作用极显著(P0.01)。结论:酶解法提取石斛药渣中多糖的工艺简便、得率稳定,具免疫增强作用,具有推广应用价值。     

板蓝根多糖的结构特征及活性研究

目的:研究和分析板蓝根多糖的化学结构和生物活性.方法:板蓝根水提醇沉后经柱色谱分离纯化,得多糖;采用高效凝胶色谱法(HPGPC)测定各均一多糖的纯度和平均相对分子质量,经UV,IR,NMR,高碘酸氧化和Smith降解法研究各多糖的化学结构,MTT法检测各多糖对巨噬细胞的刺激增殖作用.结果:分离纯化得到板蓝根多糖A,B,C,D,E,各多糖的平均相对分子质量分别为＞2 000 kDa,1 757.1,1 342.7,955.6,11.7 kDa.板蓝根多糖A主要由阿拉伯糖组成,多糖E的单糖组成主要为阿拉伯糖和半乳糖,多糖B,C,D均由葡萄糖组成.多糖A,B,C,D,E主要为α糖苷键.多糖A～E中存在1→2,1 →3,1→4,1→6多种糖苷键的连接方式.板蓝根多糖C,D,E,对巨噬细胞的刺激增殖指数(SI)分别为5.31,4.76,5.17表现出较强的免疫促进作用.结论:板蓝根多糖A～E为首次从该植物中分离得到的分支多糖.     

松木层孔菌(Phellinus pini)胞外多糖结构解析

 目的 研究松木层孔菌胞外多糖（PPE）的结构性质。方法 采用高效液相色谱法鉴定纯度并测定相对分子质量;气相色谱、红外光谱、完全酸水解、高碘酸氧化及Smith降解、甲基化反应及其产物的GC-MS联机分析、¹³C-核磁共振对松木层孔菌胞外多糖进行结构性质研究。结果 松木层孔菌胞外多糖为均一组分,多糖含量为92.84%,相对分子质量为3.9×10⁴,由甘露糖、葡萄糖、半乳糖组成,其摩尔比为38.4∶1.76∶1,由α型糖苷键构成,主链部分由α-(1→2)-Man构成,在O-6处形成分支点,支链部分由α-(1→3)-Man和α-(1→6)-Man构成,Man构成松木层孔菌胞外多糖的末端。结论 首次对松木层孔菌胞外多糖的化学结构进行深入的研究。     

细茎石斛不同部位有效成分及分布规律研究

目的 :探索多糖、生物碱、微量元素等有效成分在细茎石斛不同部位中的含量分布情况以及加工处理工艺对石斛质量的影响。方法 :分析细茎石斛茎的上、中、下部及根部中的多糖、生物碱、必需微量元素含量。应用硫酸 苯酚法测定多糖 ;氯仿 溴甲酚绿法测定总生物碱 ;ICP等离子体发射光谱法测定微量元素。结果 :细茎石斛含有较高的多糖、总生物碱和钾、钙、镁、铁、锰、锶、钛、铜等微量元素 ,不同部位含量存在较为显著差异 ;干燥工艺对细茎石斛多糖含量及不同部位的多糖、生物碱分布有较大影响。结论 :细茎石斛含有较高的多糖、生物碱、微量元素等活性物质 ;石斛干燥加工以高温杀青后 60℃烘干为宜。     

细茎石斛中1种中性多糖的纯化与结构分析

目的研究从细茎石斛Dendrobium moniliforme中得到的中性多糖DMP2-A的化学结构和在水溶液中的构象。方法利用单糖组分分析、甲基化分析、红外光谱(IR)、尺寸排除色谱-激光光散射仪联用等方法分析其结构特征和溶液构象。结果 DMP2-A由阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖组成,其中木糖残基主要以1-链接的末端糖存在;葡萄糖残基链接方式为1,3-链接、1,4-链接和1,3,6-链接;半乳糖残基链接方式为1,3-链接、1,4-链接和1,3,6-链接;阿拉伯糖残基以1,3,5-链接;甘露糖残基以1,3,6-链接。该多糖在0.15 mol/L的Na NO3水溶液中重均相对分子质量为1.07×104,存在少量聚集体,聚集数约为38。结论 DMP2-A为多分枝、结构复杂的多糖,其化学结构及在水溶液中的聚集形态为首次报道。     

人参多糖的分级及其免疫活性初探

目的:采用柱分离对人参多糖进行分级,并考察各级分对脾淋巴细胞增殖的刺激作用,找出活性部位.方法:用快流速Q-琼脂糖凝胶( Q-Sepharose FF)色谱将人参多糖进行分级,先用水和0.4 mol·L - 1 NaCl溶液洗脱,将人参多糖分成中性多糖和酸性多糖,再将酸性糖依次用0 ～0.4 mol·L-1NaCl溶液洗脱,得到不同的级分.取小鼠脾脏制备脾淋巴细胞,调整小鼠脾淋巴细胞密度至3.0×106/mL,加样品混合均匀,孵育48 h,考察每个级分不同浓度(25,50,100,200,400 mg·L -1)对脾淋巴细胞增殖的刺激作用.结果:从GP中分级得到GPN和GPA,GPA分级后得到GPA-1,GPA-2,GPA-3和GPA-4.GP,GPA,GPN,GPA-2,GPA-3和GPA-4对脾淋巴细胞增殖都具有促进作用,其最大刺激指数分别为1.073,1.082,1.119,1.101,1.102和1.296.GPA,GPA-2,GPA-3和GPA-4的刺激作用均随着浓度的增加而增强;GPN随着浓度的增加促进作用减弱,在大于100 mg·L-1时呈现抑制作用,且浓度越大抑制作用越强.GPA-1对脾淋巴细胞的增殖具有抑制作用,且浓度越大抑制作用越强.结论:Q-Sepharose FF色谱可将酸性不同的人参多糖逐级分离.人参多糖各级分对脾淋巴细胞增殖有不同程度的促进作用,以GPA-4的刺激作用最强.     

Effect of liver-protecting Sempervivum tectorum extract on the immune reactivity of spleen cells in hyperlipidaemic rats

The pathobiological role of free radicals was demonstrated in hyperlipidaemia and in steatotic liver as well as in the immune response of lymphocytes and monocytes. Hyperlipidaemia has a suppressive effect on cellular immune responses, inhibits the mitogen induced lymphoblast transformation, diminishes the tumour necrosis factor alpha (TNF-α) production of spleen macrophages and enhances spontaneous interleukin 1 (IL-1) activity. A freeze dried extract of Sempervivum tectorum has antioxidant, free radical scavenger and membrane stabilizing effects. The measured serum parameters were changed favourably after Sempervivum tectorum extract treatment. The beneficial effect of Sempervivum tectorum extract was also observed on the Con A stimulated blast transformation of splenocytes, on the lipopolysaccharide (LPS) triggered TNF-α activity and on the spontaneous IL-1 activity of spleen macrophages of hyperlipidaemic rats. The natural scavenger capacity was increased by treatment, initiating restoration of liver function.     

白毛藤生物碱对小鼠免疫功能及部分细胞因子mRNA表达的影响

 目的探讨白毛藤生物碱对小鼠免疫功能及细胞因子IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-αmRNA表达的影响。方法将BALB/c小鼠随机分成4组:白毛藤生物碱高(H组)、中(M组)、低(L组)3个剂量组和生理盐水对照组(C组),连续腹腔注射7d后,检测其单核巨噬细胞吞噬功能、二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠迟发型变态反应(DTH)、胸腺指数和脾脏指数,并用RT-PCR的方法检测脾脏IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-αmRNA表达水平。结果L组和M组的廓清指数(K)、吞噬指数(α)、DNFB诱导的小鼠迟DTH、胸腺指数和脾脏指数均显著高于C组,H组K和α显著低于C组;白毛藤生物碱3个剂量组均能提高IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-αmRNA表达水平,与C组相比,M组最显著。结论白毛藤生物碱能有效提高机体的免疫功能及IL-2,IL-12,IFN-γ和TNF-αmRNA表达。     

Macrophages, rather than T and B cells are principal immunostimulatory target cells of Lycium barbarum L. polysaccharide LBPF4-OL

Aim of the study

Lycium barbarum L. is a renowned Yin strengthening agent in traditional Chinese medicine. Lycium barbarum L. polysaccharide-protein complex is well-known for its immunoregulatory and antitumor effects. LBPF4-OL is the glycan part of Lycium barbarum L. polysaccharide-protein complex fraction 4 (LBPF4). LBPF4-OL's active contribution in LBPF4 is still blank. In the study, we enrich the polysaccharide part of Lycium barbarum L. polysaccharide-protein complex, and investigate its immunostimulatory effects on mouse spleen cells, T cells, B cells and macrophages.

Materials and methods

Balb/C mice were used in vitro and in vivo studies. In in vitro study, lymphocyte proliferations were analyzed with ³H-TdR incorporation method. Miltenyi MicroBeads were used in the purification of lymphocytes. Activation of T and B cells was analyzed by flow cytometry. In order to obtain the peritoneal macrophages, mice were injected i.p. with 1 mL of sodium thioglycollate 3 days prior to killing. Spleen cells were stimulated with LBPF4-OL and cytokine concentrations in the supernatants were determined by multiplex bead analysis. In in vivo study, mice were injected i.p. with 1 mL of normal saline or 100 μg/mL LBPF4-OL daily for 6 days. Peritoneal macrophage functions were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay and flow cytometry assay.

Results

Spleen cells and lymphocyte proliferation assay indicated that LBPF4-OL markedly induced the spleen cell proliferation, but could not induce proliferation of purified T and B lymphocytes. Further research revealed that B cell proliferation took place in the presence of activated macrophages or LPS. Multiplex bead analysis showed that LBPF4-OL can obviously induce IL-6, IL-8, IL-10 and TNF-α production of the spleen cells in a concentration-dependent manner. Flow cytometric analysis showed that LBPF4-OL (i.p.) prompts CD86 and MHC-II molecules expression on macrophages. ELISA assay showed that LBPF4-OL can greatly strengthen macrophage releasing of TNF-α and IL-1β.

Conclusion

These results suggested that glycan LBPF4-OL plays an important role in the immunopharmacological activity of Lycium barbarum L. polysaccharide-protein complex, and primary mouse macrophages, rather than T and B cells, are the principal target cells of it.     

库拉索芦荟多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的体外激活作用

 目的　研究库拉索芦荟多糖对小鼠腹腔巨噬细胞的激活作用。方法　用25,50,100,200,400μg·mL^-1的库拉索芦荟多糖体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞48h ,测定细胞内乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶、精氨酸酶活性及释放的TNF-α和IL-1含量。结果　库拉索芦荟多糖能上调腹腔巨噬细胞内乳酸脱氢酶、酸性磷酸酶和精氨酸酶活性,并能显著诱导腹腔巨噬细胞表达TNF-α和IL-1,增强吞噬中性红能力。结论　库拉索芦荟多糖对小鼠腹腔巨噬细胞具有激活作用。     

灵芝孢子粉水溶性多糖SGL-Ⅲ的结构研究

 目的对从灵芝孢子粉中提取出来的纯多糖SGL-Ⅲ进行结构分析。方法多糖SGL-Ⅲ经比旋光、高效液相色谱法、苯酚-硫酸法确定物理性状后,再经部分酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化分析及IR,GC,GC-MS和¹³C-NMR等方法确定其结构。结果SGL-Ⅲ相对分子质量为1.41×10⁴,由葡萄糖(Glc)和半乳糖(Gal)组成,摩尔比为4.46∶1,为少分支结构,其基本结构中主链由(1→3)Glc和(1→6)Gal构成,分支点分别在6-O,2-O及4-O处,(1→4)Gal或(1→6)Glc位于侧链,分支末端残基为Glc。结论多糖SGL-Ⅲ具有天然活性多糖的特征,可以对其进行药理活性的研究开发。