高端流式分选与免疫磁珠法纯化T细胞的比较

目的 为建立一种高效、高活性的T细胞的分离纯化方法,分别采用流式细胞分选技术(FACS)及免疫磁珠分选技术(MACS)从小鼠脾脏组织分离纯化CD8+T细胞.方法 通过测定分选后细胞的纯度、回收率、细胞活力、实验耗时及细胞学形态等指标,综合全面地比较了上述两种纯化方法分离CD8+T细胞的差异.结果 流式细胞分选仪分选后CD8+T细胞纯度为(99.5±0.00)％,而免疫磁珠法的纯度为(95.6±0.25)％.流式细胞分选仪分选CD8+T细胞的回收率为(74.33±3.28)％,而免疫磁珠法的回收率为(60.00±1.53)％.流式细胞分选法耗时1.5 h,免疫磁珠法则需要2.5 h.流式细胞分选后的细胞活力要比免疫磁珠法收集的要高.经流式分选后得到的细胞在12h时就开始出现集落生长,24 h时生长最佳,而经免疫磁珠分选后的细胞总体生长趋势较流式分选后的细胞缓慢.结论 流式细胞分选法较免疫磁珠法效率更高,能得到更高活性的细胞.     

流产模型孕鼠脾脏调节性T细胞分离纯化方法的初步建立

目的探索流产模型孕鼠CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞快速高效的分选方法。方法采用免疫磁珠两步法分离流产模型孕鼠脾脏中T细胞,分离后的细胞经台盼蓝染色检测细胞存活率,经流式细胞仪检测分离的纯度。结果流产模型孕鼠脾脏细胞经过免疫磁珠细胞分选法2次分选得到CD4+/CD25+调节性T细胞纯度为(93.51.1)%,CD4+/CD25-T细胞纯度为(96.60.6)%。结论采用免疫磁珠细胞分选法能够快速高效的得到高纯度的CD4+CD25+T细胞和CD4+CD25-T细胞。     

WT1特异性 CD8+ T 细胞治疗乳腺癌的实验研究

摘要： 目的 通过检测 Wilms’肿瘤基因 1 （WT1） 特异性 CD8+ T 细胞对乳腺癌细胞的杀伤活性, 探讨正常外周血中提取的 WT1 特异性 CD8+ T 细胞用于治疗乳腺癌的可行性。方法 运用流式细胞仪检测 20 例人白细胞抗原（HLA） -A2 血清阳性健康志愿者外周血中 WT1 特异性 CD8+ T 细胞的浓度, 通过 WT1/主要组织相容性复合体（MHC） 连锁状多聚体磁珠分选 WT1 特异性 CD8+ T 细胞并进行培养, 细胞毒性实验检测 WT1 特异性 CD8+ T 细胞的功能。结果 20 例 HLA-A2 血清阳性健康志愿者外周血中均可检测到 WT1 特异性 CD8+ T 细胞, 12 例健康外周血中 WT1 特异性 CD8+ T 细胞的浓度＞0.5%, 其中 4 例＞1%。WT1/MHC 连锁状多聚体磁珠分选后, 其浓度明显增加至 80%左右。WT1 特异性 CD8+ T 细胞可特异性杀伤 WT1 多肽负载的乳腺癌细胞株。结论 健康志愿者外周血中可检测到 WT1 特异性 CD8+ T 细胞, 该细胞可能对乳腺癌细胞具有特异性杀伤作用, 提示 WT1 特异性 CD8+ T 细胞用于乳腺癌过继性免疫治疗的可能性。     

人脐带血造血干细胞体外分化为NK细胞的效率及功能检测

目的检测人脐带血造血干细胞(HSCs)体外分化为自然杀伤(NK)细胞的效率及功能。方法从人脐带血中分离CD34+HSCs,接种于含20μg/L FMS样酪氨酸激酶3配体(Flt3L)、干细胞生长因子(SCF)、白细胞介素(IL)-7、IL-15及IL-21的SCGM培养基中,定向诱导CD34+HSCs分化为NK细胞。观察细胞生长状态,在分化的第7、14、21及28天,采用流式细胞术检测各阶段CD56、NKG2D、NKp46、CD3、CD19及CD34等细胞免疫表型的表达变化;分化的第21、28天,以分化得到细胞为效应细胞,K562细胞作为靶细胞,设置8∶1、4∶1、2∶1和1∶1 4组效靶细胞比,分别采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测法和7AAD/CFSE标记法,检测分化得到的细胞杀伤功能。结果脐带血来源的CD34+HSCs在体外适宜的条件下可大量增殖;整个分化进程的不同阶段中,CD3和CD19表达量差异无统计学意义,CD56、NKG2D及NKp46的表达量逐渐增加,最高达(72.57±1.60)%、(32.83±1.29)%和(29.53±2.40)%,CD34的表达量逐渐降低,最低为(12.13±2.01)%。LDH毒性检测法和7AAD/CFSE标记法测得最大杀伤效率可达(49.91±2.76)%和(40.87±1.12)%,8∶1、4∶1、2∶1和1∶1组NK细胞杀伤能力均依次降低(P<0.05),诱导分化28 d的NK细胞杀伤能力与21 d差异无统计学意义。结论人脐带血HSCs在体外适宜的培养条件下,可定向分化为NK细胞,诱导分化得到的NK细胞具有杀伤功能。     

注射用核糖核酸Ⅱ上调p53诱导人白血病细胞凋亡

目的研究注射用核糖核酸Ⅱ诱导人白血病细胞系K562和KG1a细胞凋亡的作用。方法以K562和KG1a细胞为研究对象,采用CCK-8法检测注射用核糖核酸Ⅱ对细胞增殖的影响;流式细胞术检测细胞凋亡率的变化;Hoechst33258染色观察细胞核形态;免疫印迹技术检测p53及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax和cleaved caspase-3的表达。结果以100~300 mg·L~(-1)注射用核糖核酸Ⅱ处理K562和KG1a细胞12、24、48 h后,CCK-8检测结果显示K562和KG1a细胞的增殖降低,抑制率明显增高,并呈时间剂量依赖性;100、150、200mg·L~(-1)注射用核糖核酸Ⅱ处理K562和KG1a细胞24 h后,FCM结果显示细胞凋亡率随药物剂量增加而增高;Hoechst33258染色观察到细胞核出现染色质浓缩聚集、染色加深等凋亡指征;Western blot结果显示,注射用核糖核酸Ⅱ上调p53、Bax和cleaved caspase-3的表达,下调Bcl-2表达。结论注射用核糖核酸Ⅱ通过上调p53,调控Bcl-2/Bax的表达,激活caspase-3诱导人白血病K562和KG1a细胞凋亡。     

莱菔硫烷促进KG1a细胞凋亡及其作用机制

目的：研究莱菔硫烷对急性髓系白血病细胞株KG1a细胞凋亡的影响及作用机制。方法：利用细胞增殖实验CCK-8试剂盒检测SFN对KG1a细胞增殖的抑制作用,利用流式细胞术检测SFN对KG1a细胞早期凋亡率的影响,进一步利用PCR、Western-blot技术研究SFN对KG1a细胞Bax和bcl2 mRNA和蛋白水平表达的影响。结果：（1）SFN可抑制KG1a细胞的增殖,且随SFN浓度增加和作用时间延长抑制率增加;（2）在0,4,8,12 μmol·L^-1SFN作用KG1a细胞后,其早期凋亡率呈浓度依赖性增加,早期凋亡率分别为0,3.12%,13.33%,28.18%;（3）SFN可增加KG1a细胞的Bax的mRNA和蛋白的表达,与对照组（0 μmol·L^-1浓度组）存在统计学差异（P<0.05）。SFN可降低bcl2 mRNA和蛋白表达水平,12 μmol·L^-1SFN浓度组的蛋白表达与对照组相比,差异有统计学意义（P<0.05）。结论：SFN可通过调控Bax和bcl2基因促进KG1a细胞凋亡,抑制KG1a细胞增殖。     

线粒体通路和死亡受体通路在中华眼镜蛇毒组分诱导KG1a细胞凋亡中的作用

目的研究线粒体通路和死亡受体通路在中华眼镜蛇毒组分(naja naja actra venom component,NNAVC)诱导KG1a细胞凋亡过程中的作用。方法以人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞为研究对象,采用Annexin V-FITC/PI荧光染色法进行凋亡细胞的形态学观察,流式细胞仪检测细胞凋亡率,分光光度法检测Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3的活性,ELISA法检测胞质内细胞色素C的表达水平,流式细胞仪分析TRAIL死亡受体(DR4、DR5)和诱骗受体(DcR1、DcR2)的改变。结果 NNAVC作用后,荧光显微镜下可见明显的凋亡细胞,细胞凋亡率随药物作用浓度的增加而升高;Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3蛋白被激活,胞质内细胞色素C的表达明显增加;流式细胞仪检测结果显示,NNAVC具有降低死亡受体DR4和诱骗受体DcR1的表达率,而提高DR5和DcR2的表达水平的作用。结论线粒体凋亡通路和死亡受体通路均参与NNAVC诱导KG1a细胞凋亡的过程,这可能是NNAVC发挥抗白血病作用的机制之一。     

1-甲基色氨酸作用卵巢癌耐药细胞后对免疫细胞功能的影响

目的应用1-甲基色氨酸(MT-1)干预卵巢癌耐药细胞SKOV3/CBP,探讨其干预耐药癌细胞能否对免疫细胞增殖及功能有影响。方法将MT-1与卵巢癌耐药细胞株即SKOV3/CBP细胞株共培养后加入淋巴细胞,以未加入MT-1的SKOV3/CBP细胞株为对照,四甲基偶氮唑盐(MTT)法监测淋巴细胞的增殖能力,随后分别将耐药SKOV3/CBP及SKOV3/CBP+MT-1与自然杀伤细胞(NK)细胞、CD8+T细胞共培养,乳酸脱氢酶(LDH)检测NK细胞的杀伤能力,酶联免疫斑点检测(ELISPOT)CD8+T细胞的杀伤能力。结果与未加入MT-1组对比,加入MT-1组SKOV3/CBP细胞中的淋巴细胞的增值,NK细胞的杀伤能力及CD8+T细胞的杀伤能力增强且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 MT-1可提高卵巢癌耐药细胞对免疫细胞作用的敏感性,故MT-1可作为卵巢癌耐药治疗的新手段。     

CD133阳性肝癌细胞周期分析

目的:免疫磁珠分选法分选肝癌细胞系SMMC7721中CD133+细胞,并检测CD133+和CD133-细胞周期.方法:采用免疫磁珠分选法分选肝癌细胞系SMMC7721中CD133+和CD133-细胞,乙醇固定,PI染色,流式细胞仪(FCM)检测细胞周期.结果:CD133+细胞在SMMC7721中所占比例为0.9%,FCM检测显示SMMC7721细胞株中CD133.细胞周期处于G0/G1期的比例为85.3%,而CDl33.细胞G0/G1期的比例相对较低,为61.6%,未分选细胞居中,为68.9%.结论:人肝癌细胞系SMMC7721中CD133+亚群,比例约为0.9%,且CD133.细胞多处于静止期,具有一般干细胞的特性.     

CD4＋T淋巴细胞分选方法的效果评价

目的 建立一种准确且对细胞活性影响小的分离人外周血CD4＋T细胞的分选方法.方法 对人外周血依次采用密度梯度离心（density gradient centrifugation,DGC）和免疫磁珠分选（magnetic-activated cell sorting,MACS）进行CD4＋T细胞分选.分选后的细胞用流式细胞仪（flow cytometry,FCM）、倒置显微镜及细胞周期分析进行分选纯度和生长状态检测.结果 Percoll密度梯度离心法收集的单个核细胞中CD4＋T细胞纯度为（38.8±2.7）％,免疫磁珠分选后CD4＋T细胞纯度为（96.2±0.7）％,两者比较差异有统计学意义（P＜0.01）,且分选后细胞形态及功能完好,24 h内活性最高.结论 密度梯度离心和免疫磁珠分选相结合可以有效提高CD4＋T细胞的分选纯度及保持其活性,可继续用于相关功能研究.     

570例肺癌患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞的分析研究

目的探讨不同年龄段肺癌患者T淋巴细胞亚群和NK细胞变化及临床意义。方法回顾分析570例肺癌患者淋巴细胞亚群的流式细胞术检测结果。结果肺癌在51-80年龄段内发病率占78．6％：肺癌患者CD4^＋T细胞相对减低、CD8^＋T细胞相对增高、CD4＋／CD8^＋比值明显降低,与正常对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05）;随着肺癌患者年龄降低,NK细胞有明显降低趋势（P〈0．01）,CD3^＋T细胞有明显增加趋势（P〈0．01）。结论肺癌患者CD4^＋T淋巴细胞亚群及NK细胞活性受到抑制,CD4^＋／CD8^＋比值显著降低,细胞免疫功能下降,年龄越年轻其细胞免疫功能越紊乱;流式细胞术检测外周血T淋巴亚群对评价疗效、判断预后具有重要价值。     

氨甲喋呤对映体药物对A549人肺腺癌细胞株增殖抑制作用及诱导凋亡作用

目的探讨氨甲喋呤对映体[（＋）MTX,（-）MTX]对A549细胞的增殖抑制作用及诱导凋亡作用。方法采用培养的A549细胞,应用MTT比色法分析其活性;用光学显微镜和荧光显微镜观察细胞的形态学变化;碘化丙啶（PI）单染流式细胞术检测细胞周期;DNA梯度电泳检测凋亡。结果在0.1～150μmol·L-1范围内,（＋）MTX和（-）MTX作用于A549细胞24,48,72h,均抑制细胞A549增值,但抑制强度为（＋）MTX〉（-）MTX,倒置显微镜和荧光显微镜观察不同浓度（＋）MTX和（-）MTX作用A549细胞不同时间后,出现细胞不同程度的形态学改变;用10μmol·L-1的（＋）MTX和（-）MTX作用A549细胞48h后,PI单染流式细胞术检测A549细胞周期的影响,表明氨甲喋呤对映体干扰A549细胞DNA合成;DNA梯度电泳检测结果发现MTX作用组有凋亡条带出现,其中（＋）MTX最为明显。结论 （＋）MTX和（-）MTX对A549细胞的抗增殖作用具有化学结构的立体选择性,（＋）MTX的抗A549细胞增殖作用明显强于（-）MTX。     

三氧化二砷与甲磺酸伊马替尼对慢性粒细胞白血病原代细胞增殖与凋亡的协同作用研究

目的：探讨三氧化二砷（Arsenic trioxide,ATO）对甲磺酸伊马替尼（STI571）在慢性粒细胞白血病（CML）原代细胞中对细胞增殖及凋亡的影响。方法：采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察STI571单独使用与联用ATO对慢性粒细胞白血病原代细胞增殖抑制的变化情况。流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：无毒剂量的ATO（0.15μmol·L-1）联用STI571（IC500.324±0.011μmol·L-1）较单独使用STI571（0.580±0.007μmol·L-1）时对细胞抑制率显著增大,IC50下降1.79倍（P〈0.05）。细胞经ATO（0.15μmol·L-1）、STI571（0.5μmol·L-1）联合处理24h、48h时,细胞凋亡率增大为15.6%、50.7%,协同作用为增强（＋＋）。结论：ATO能增强STI571对CML原代细胞敏感性,能促进细胞凋亡与STI571具有增强的协同作用。     

不同麻醉方式对直肠癌根治术患者免疫功能的影响

目的：探讨不同麻醉方式对直肠癌根治术患者免疫功能的影响。方法将82例行直肠癌根治术的患者按照数字表法随机分为两组,各41例,A组采用全凭静脉麻醉;B组采用硬膜外阻滞复合静脉全麻。两组分别于麻醉前30 min（T0）、切皮后2 h（T1）、术后2 h（T2）和术后24 h（T3）采外周静脉血检测CD3＋、CD4＋、CD4＋/CD8＋、CD3＋HLA-DR＋和自然杀伤（ NK）细胞的表达情况。结果 A组T2、T3时VAS评分分别为（3．86±0．46）分和（3．62±0．26）分,明显高于B组的（1．67±0．57）分和（1．94±0．42）分（t＝4．624、4．841,均P＜0．05）。 CD3＋、CD4＋、CD4＋/CD8＋、CD3＋HLA-DR＋与NK细胞指标：A组麻醉后各个时点上述指标均低于麻醉前（均P＜0．05）;B组在T1、T2时上述指标均低于麻醉前（均P＜0．05）;而在T3时与麻醉前差异无统计学意义（ P＞0．05）;A组麻醉后各时点上述指标均低于B组（均P＜0．05）。结论硬膜外复合静脉全麻比全凭静脉麻醉对直肠癌患者细胞免疫抑制更轻。     

地西他滨联合丙戊酸钠对白血病细胞株HL-60促凋亡和分化的影响

目的探讨地西他滨（DCA）和丙戊酸钠（VPA）联用对白血病细胞株HL-60促凋亡和分化诱导的协同作用。方法白血病细胞株HL-60分别与以下药物终浓度组作用48 h:对照组,DCA单药A组(1.0μmol·L^-1),DCA单药B组(4.0μmol·L^-1),VPA单药组(2.0 mmol·L^-1),联合用药A组(IDCA 1.0μmol·L^-1+VPA 2.0 mmol·L^-1),联合用药B组(DCA 4.0μmol·L^-1+VPA2.0 mmol·L^-1)。应用Annexin V-FTTC/PI标记法检测早期凋亡率,流式细胞术检测CD34、CD117平均荧光强度（MFI）以及CD11b、CD14表达率。结果联合用药A、B组的凋亡率高于其各自的单药组,差异具有高度统计学意义（P<0.01）;联合用药A、B组的CD117和CD34 MFI低于其各自的单药组,差异具有高度统计学意义（P<0.01）;联合用药A组的CD11b和CD14表达率以及联合用药B组的CD11b表达率均低于其各自的单药组,差异具有高度统计学意义（P<0.01）。结论白血病细胞株HL-60中VPA能显著增强DCA的促凋亡分化作用。     

CD_(137)对宫颈癌患者CIK细胞功能调节的实验研究

目的探讨CD137mAb对宫颈癌患者CIK细胞的功能调节。方法分离宫颈癌患者外周血单个核细胞(PBMCs),常规CIK培养体系中加入CD137mAb为实验组(CD137-CIK组),同时对照组加入鼠IgG1同型对照(IgG1-CIK组)。动态观察CIK细胞体外增殖;流式检测CIK细胞凋亡率、细胞表型及CD3+CD56+细胞内因子的表达;LDH酶释放法检测CIK细胞杀伤活性。结果两组CIK细胞均有很强的增殖活性,实验组细胞浓度最高达(20.92±3.57)×106/mL,对照组为(14.02±2.68)×106/mL(P<0.05);第21天实验组和对照组CD3+CD56+细胞比例分别达到(35.48±5.46)%和(25.12±4.18)%(P<0.05);CD137-CIK组细胞凋亡坏死率明显低于IgG1-CIK组;实验组CIK细胞体外杀伤宫颈癌HeLa细胞株活性明显高于对照组(P<0.05);流式检测CD137-CIK组中CD3+CD56+细胞内IL-2,IFN-γ表达上调,IL-4,IL-10表达下调。结论 CD137mAb介导的共刺激信号可以显著提高宫颈癌患者CIK细胞的体外增殖活性和抗瘤作用。     

急性髓性白血病患者外周血淋巴细胞亚群的检测及其临床意义

目的探讨急性髓系白血病(AML)患者外周血T淋巴细胞亚群、DNT细胞、NK细胞的表达水平及其临床意义。方法采用流式细胞术对40例初发AML患者、32例AML完全缓解(CR)患者及20例正常人外周血T淋巴细胞亚群、DNT细胞及NK细胞水平进行检测。结果初发AML组与正常对照组比较,CD4+细胞、CD4+/CD8+比值、DNT细胞及NK细胞明显降低(P<0.05);CD3+细胞、CD8+细胞变化不显著(P>0.05)。复治CR组与对照组比较,NK细胞明显降低(P<0.05),其他各值差异无统计学意义。结论初发AML患者的T淋巴细胞亚群、DNT细胞、NK细胞变化明显,而治疗缓解后淋巴亚群基本恢复正常,说明T淋巴细胞亚群、DNT细胞、NK细胞水平检测在评价AML疗效及判断预后方面具有一定的临床价值。     

儿童慢性特发性血小板减少性紫癜T细胞亚群变化研究

目的：探讨儿童慢性特发性血小板减少性紫癜（idiopathicthrombocytopenicpurpura,ITP）T细胞亚群变化的具体情况及临床意义。方法：采用流式细胞仪分别检测30例儿童慢性ITP患者和15例健康儿童（对照组）的外周血CD4＋/CD8＋比值、天然杀伤细胞（naturalkillercell,NK细胞）计数、调节性T细胞（Treg细胞）计数,比较两组之间的差异。结果：慢性ITP组与对照组比较,CD4＋/CD8＋比值,CD16＋CD56＋NK细胞数,CD4＋CD25＋细胞/CD4＋细胞比值均降低,P均〈0.05。结论：CD4＋、CD8＋T细胞亚群改变,NK细胞减少,Treg细胞减少与儿童慢性ITP的发病有关。     

裙带菜多糖对人外周血淋巴细胞因子分泌的影响

目的分析裙带菜多糖对人外周血淋巴细胞亚群、细胞因子分泌的影响,探讨裙带菜多糖的免疫调节机制。方法用流式细胞术检测淋巴细胞亚群的变化,用酶联免疫方法测定裙带菜多糖作用后淋巴细胞培养上清中细胞因子的浓度。结果不同浓度的裙带菜多糖可使CD+8T细胞比例明显增加(P<0.01);并可使CD+4T细胞比率增加,但与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);裙带菜多糖对B细胞增殖反应无明显影响(P>0.05)。不同浓度的裙带菜多糖作用后,NK细胞比例明显增高(P<0.01),并呈浓度依赖性,可明显刺激外周血淋巴细胞产生白细胞介素-2(IL-2)(P<0.01),但对IL-6及IL-10的产生作用无明显影响(P>0.05)。结论裙带菜多糖可促进CD+8、NK细胞增殖,产生Th1类细胞因子发挥免疫调节作用。     

双黄连冻干粉通过抑制MEK-ERK信号通路诱导急性淋巴细胞白血病Nalm6细胞凋亡

目的 探讨双黄连（SHL）冻干粉诱导急性B 淋巴细胞白血病细胞（Nalm6）凋亡的机制。方法 采用0、 0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 g/L的SHL处理急性白血病细胞株（Nalm6、Jurkat、Molt4、KG1a）,CCK-8法检测细胞增殖 抑制率,并计算半数抑制浓度（IC50）。Nalm6细胞分为空白对照组（含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养基）和SHL 0.1、0.2、0.4 g/L组。流式细胞术检测各组细胞周期分布及凋亡情况,Hoechst 33342染色细胞后观察细胞凋亡形态学 改变。蛋白免疫印迹法检测各组 Nalm6 细胞 MEK-ERK-c-Myc 信号通路蛋白以及凋亡相关蛋白的表达情况。结 果 SHL对Nalm6的IC50最低,为（0.11±0.01）g/L。细胞周期分析显示,0.1~0.4 g/L SHL处理后,Nalm6的细胞周期分 布无明显变化,但随着处理浓度的升高,Nalm6 凋亡细胞数增多,总凋亡率升高,tBid、cleaved Caspase-9、cleaved Caspase-3、cleaved PARP 表达升高,MEK/ERK 通路相关蛋白 p-MEK/MEK、p-ERK/ERK、c-Myc 表达下降（均 P＜ 0.05）。经凋亡抑制剂 Z-VAD-FMK 预处理后,SHL 对 Nalm6 细胞的促凋亡作用被抑制。结论 SHL 可通过抑制 MEK-ERK信号通路来诱导Nalm6细胞凋亡。