脊髓神经管神经上皮干细胞的分离培养和诱导分化

目的：从胚胎大鼠脊髓神经管中分离神经上皮干细胞并诱导其向多巴胺能神经元方向分化。方法：利用无血清悬浮培养、单细胞克隆技术分离神经上皮干细胞；采用5－溴－2－脱氧尿苷（BrdU）标记新生细胞，免疫细胞化学单标或双标染色技术，检测神经上皮干细胞蛋白（nestin）和分化后特异性神经细胞抗原的表达；用纹状体组织提取液，诱导神经上皮干细胞向多巴胺能神经元方向分化。结果：从胚胎大鼠脊髓神经管 中分离的细胞可以连续传代，表达nestin，它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原；与对照组3％相比，纹状体组织提取液可以诱导这些细胞中的12％分化成为多巴胺能神经元。结论：分离自脊髓神经管的细胞具有自我更新能力和多分化潜能（multipotent)，是增殖能力很强的神经干细胞；这些干细胞在一定的体外环境中能被诱导成为特定的神经元，提示其可以为神经移植提供材料。     

大鼠骨骼肌植块诱导脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞的分化

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经于细胞进行体外培养,探讨骨骼肌植块诱导其向运动神经元样细胞分化.方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况;通过与骨骼肌植块共培养观察神经干细胞向运动神经无样细胞的分化情况.结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示.骨骼肌植块组有7.87%的细胞呈胆碱乙酰基转移酶阳性.与10%胎牛血清组(0.94%)比较具有统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,骨骼肌植块可诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

人胚胎纹状体来源神经干细胞的体外培养

背景：目前神经干细胞多由动物获得,不适合人类临床移植治疗。 目的：探索体外环境下人胚胎纹状体来源神经干细胞的培养方法,同时观察其生物学特性。 方法：取经水囊引产的孕8-16周人胚胎纹状体,体外用无血清DMEM培养基进行培养,待细胞形成神经球后进行传代,并应用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/ F12培养液进行诱导分化。 结果与结论：体外培养的人胚胎纹状体来源神经干细胞生长迅速,表达神经干细胞标志物nestin。克隆形成实验显示细胞克隆形成率为6.0%-7.0%;BrdU掺入实验显示细胞增殖率为37.9%。免疫荧光染色显示经诱导分化的细胞表达神经元标志物Ⅲ型β微管蛋白、星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白及神经干细胞标志物nestin,但不表达少突胶质细胞标志物髓鞘碱性蛋白。可见人胚胎纹状体来源神经干细胞在体外无血清条件下可保持其生物学特点,具有自我更新能力,经胎牛血清诱导后可向神经元及星形胶质细胞分化。     

大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞的分离和培养

目的:体外培养大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞(NSCs),观察其生长及诱导分化培养特点。方法:取孕12.5~14.5 d的SD大鼠,采用机械分离法获取中脑腹侧组织,剪碎并吹打成单细胞悬液后,以2×10~5个细胞/ml的密度接种到无血清NSCs培养基中以神经球法培养。培养神经球5~7 d后,按原密度进行传代培养,并取第三代培养的神经球用含10%胎牛血清(FBS)分化培养液分化培养,分化培养7 d后行免疫细胞化学鉴定。结果:神经球呈巢蛋白(nestin)阳性,诱导分化后的细胞作分别呈微管蛋白(βIII-Tubulin)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)阳性。结论:经神经球法培养得到的大鼠胚胎中脑腹侧来源神经干细胞可自我增值,并可诱导分化成神经元和胶质细胞。     

人胚胎大脑皮层神经干细胞的分离培养

目的　为人神经干细胞的基础研究及临床应用提供细胞模型。　方法　采用无血清培养技术 ,分离培养了 10～ 14周人胚大脑皮层细胞 ,并用神经上皮干细胞蛋白 (Nestin)免疫组化鉴定培养细胞 ;5 %胎牛血清诱导其分化 ,神经丝 2 0 0 (NF 2 0 0 )和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫组化鉴定分化细胞。　结果　获得了大量未分化、呈簇状悬浮生长的神经干细胞团 ,且能被诱导分化成神经元和神经胶质细胞。经传 12代后仍具干细胞特性。　结论　本实验成功地分离培养了人胚胎大脑皮层神经干细胞 ,为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

大鼠脊髓神经干细胞的鉴定及光镜和电镜观察

本研究应用无血清培养技术对分离的大鼠胚胎脊髓神经干细胞进行体外培养,在倒置显微镜和电镜下观察细胞形态,应用BrdU标记、免疫荧光染色检测细胞增殖、分化情况。免疫荧光显示nestin、MAP2、GFAP以及BrdU/nestin、BrdU/MAP2、Br-dU/GFAP均有阳性表达,说明从大鼠胚胎脊髓可成功分离出神经干细胞,它们分化后可以表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原。脊髓神经干细胞具有自我更新能力,能分化为神经元和星型胶质细胞。     

大鼠胚胎脑组织神经干细胞的培养和鉴定

目的探讨从不同胎龄的大鼠脑组织中分离,培养神经干细胞(NSC)并对其鉴定,了解生物特性。方法通过采用机械分离和消化分离相结合的方法分离不同胎龄大鼠脑NSC。在无血清DMEM/F12(含20ng/m lbFGF,20ng/m lEGF及B27辅助培养液)中培养、传代和鉴定。诱导分化后采用SABC法对分化的细胞进行神经元特异烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)检测作细胞鉴定。结果从不同胎龄的胎鼠脑组织中成功培养出神经干细胞,胎龄为12.5天的胎鼠提取的神经干细胞集落最多,在上述条件下培养及传代的细胞不断分裂增殖,形成悬浮生长的呈巢素蛋白(nestin)阳性的神经球;用血清诱导分化为大量表达NSE阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞。结论胎龄为12.5天胎鼠大脑皮质培养出的神经干细胞数量最多,可分化为神经元、神经胶质细胞及少突胶质细胞。     

促红细胞生成素促进体外鼠胚脑皮质神经干细胞增殖

目的检测体外培养SD大鼠胚脑皮质神经干细胞(neural stem cells,NSCs)增殖和分化的生物学特性,为NSCs研究提供适宜的细胞模型;探讨促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)对NSCs增殖的影响,为NSCs的相关研究提供实验依据。方法本研究对孕14d(E14)SD大鼠取鼠胚脑皮质悬浮培养、贴壁诱导分化。采用光电镜观察,以nestin免疫荧光染色鉴定NSCs,微管相关蛋白2(microtubule associated protein2,MAP2)和神经胶质原纤维酸性蛋白(glia fibrillary acid protein,GFAP)检测NSCs分化。取第三代(P3)NSCs向悬浮培养基中添加不同剂量的EPO,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)检测法检测NSCs的增殖情况。结果分离E14dSD大鼠胚脑皮质,在添加B27、bFGF、EGF的无血清培养基中培养,可形成大量悬浮的神经球并可进行体外扩增传代,神经球内的细胞均呈Nestin阳性、BrdU阳性。在添加10%胎牛血清的培养基中,神经干细胞可自然分化为神经元和神经胶质细胞。与对照组对比,加入≥5U/mlEPO后MTT检测NSCsOD值明显增高。结论 SD大鼠胚脑皮质体外培养可得到大量增殖的神经干细胞并能分化为神经元和神经胶质细胞,EPO可促进体外NSCs的增殖。     

大鼠脑源性神经干细胞的分离培养

目的 探讨大鼠不同年龄组来源的神经干细胞体外培养和诱导分化的最佳条件。方法 分离12～15d大鼠胚胎、1～2d新生鼠的脑组织和成年大鼠脑的海马区和嗅球，在条件培养基(包含生长因子)中增殖培养，用神经干细胞的特异性单克隆抗体巢蛋白(nestin)鉴定克隆细胞；去除生长因子，降低血清浓度到2％后，诱导细胞分化，用神经细胞的特异性单克隆抗体鉴定分化细胞。结果 获得了大量可自我增殖并分化为3种神经细胞(神经元，星形胶质细胞，少突胶质细胞)的神经前体细胞。结论 在适当的分离培养条件下，可以获得大量的神经前体细胞，为神经干细胞的基础和临床研究提供细胞基础。     

血清浓度对雪旺细胞诱导神经上皮干细胞分化的影响

目的:探讨血清对雪旺细胞诱导神经上皮干细胞分化的影响。方法:从新生鼠坐骨神经及臂丛神经分离纯化雪旺细胞,从孕11.5 d大鼠胚胎分离培养神经上皮干细胞,含0%、1%、5%、10%胎牛血清的培养液联合培养雪旺细胞与神经上皮干细胞,收集上清作为条件培养液诱导神经上皮干细胞分化,1周后MAP-2和GFAP细胞免疫化学染色,显微镜下观察统计神经上皮干细胞分化为神经元与星形胶质细胞的比例。结果:条件培养液促进神经上皮干细胞存活和分化,分化形成的神经元大体形态与成熟神经元相似,0%、1%、5%、10%血清条件培养液组神经元与星形胶质细胞比例分别为1.53:1、1.13:1、1.03:1、0.75:1。结论:血清影响雪旺细胞诱导神经上皮干细胞向神经元分化,血清浓度增加,神经上皮干细胞分化形成的神经元减少。     

维甲酸、音猬因子对大鼠脊髓神经干细胞向运动神经元样细胞分化的影响

目的:分离大鼠胚胎的脊髓神经干细胞进行体外培养,探讨维甲酸(RA)、音猬因子(Shh)诱导其向运动神经元样细胞分化. 方法:应用无血清培养技术分离培养脊髓神经干细胞,通过5-溴-2-脱氧尿苷标记、免疫荧光显色检测细胞增殖、分化情况;培养液分组添加Shh、 RA或Shh+RA,观察神经干细胞向运动神经元样细胞的分化情况. 结果:大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,分化后可表达神经元、星形胶质细胞的特异性抗原;诱导分化后结果显示Shh组未检测到胆碱乙酰转移酶阳性细胞,RA组为20.63%, Shh+RA组为66.84%,其差异具统计学意义.结论:从大鼠胚胎脊髓可成功分离神经干细胞,Shh、 RA可不同程度地诱导脊髓神经干细胞分化为运动神经元样细胞.     

大鼠胚胎脑和脊髓神经干细胞分化特性比较

体外分离大鼠胚胎脑和脊髓神经干细胞,经培养传代后,撤除生长因子(bFGF和EGF)并给予 1%胎牛血清促其自然分化,然后比较两者的分化规律,以及传代次数对分化的影响。结果发现:在完全相同的培养条件下,来源于脑和脊髓的神经干细胞均可分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞,但两者分化为神经元的能力均随细胞体外传代次数的增加而显著下降 (P<0. 05);此外,脑来源的神经干细胞分化为神经元的能力远高于脊髓来源的神经干细胞 (P<0. 01)。提示,来自中枢神经系统不同部位的神经干细胞在分化潜力上存在差别,体外传代会影响神经干细胞的分化能力。     

新生小鼠海马神经干细胞体外培养条件下的增殖与分化

背景：神经干细胞移植可用于中枢神经损伤的临床治疗。 目的：观察新生小鼠海马神经干细胞在体外培养条件下的增殖和分化。 方法：从新生昆明小鼠海马取材,采用机械分离法对原代细胞进行无血清培养,采用机械法复合酶消化法对原代细胞进行传代,以体积分数为10%胎牛血清诱导分化。免疫荧光行巢蛋白、β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白染色,对培养的细胞进行鉴定。CCK-8法检测神经干细胞增殖能力。 结果与结论：从新生小鼠海马分离得到的细胞具有连续传代形成克隆球的能力,克隆球呈巢蛋白免疫反应阳性;加入胎牛血清可诱导分化为β-微管蛋白Ⅲ和胶质纤维酸性蛋白阳性细胞。提示实验成功建立了体外培养新生小鼠海马组织分离和培养神经干细胞的方法,培养的神经干细胞在体外培养条件下保持着自我增殖和分化的潜能。     

骨髓基质细胞对共培养条件下的脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的诱导

目的：研究骨髓基质细胞对共培养条件下脊髓源性神经干细胞分化为胆碱能神经元的情况。方法：从孕龄13 d的胚胎大鼠脊髓组织中分离神经干细胞,采用含EGF及bFGF的无血清限定性培养基培养,并通过与骨髓基质细胞进行共培养,观察脊髓源神经干细胞向胆碱能神经元分化的情况,用细胞免疫荧光染色鉴定分化结果。结果：从胚胎脊髓中分离得到大量的神经干细胞,通过限定性培养基培养可获得干细胞球,与骨髓基质细胞共培养可被诱导分化,用细胞免疫荧光染色鉴定,可见有胆碱能神经元生成。结论：胚胎大鼠脊髓源神经干细胞在添加EGF与bFGF的限定性培养基中可以增殖并保持稳定的性状,在与骨髓基质细胞共培养时,可以被诱导分化为胆碱能神经元。     

小鼠脊髓血管-神经干细胞龛与神经细胞的增殖和分化

目的探讨小鼠脊髓发育过程中血管-干细胞龛对神经干细胞分化、增殖和迁移的影响;探讨龛中的各种细胞、血管在发育中的变化及相互作用。方法发育过程中的胚胎鼠或生后小鼠150只,取脊髓腰膨大处的横断面切片。采用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)免疫荧光标记神经干细胞;用尼氏(Nissl)染色观察神经元的发育和形态变化;利用血管墨汁灌注结合免疫荧光三重标记的方法检测神经干细胞、神经元和神经胶质细胞在小鼠胚胎期及生后的形态分布变化;同时对脊髓内血管发育的动态变化进行形态学观察和体视学处理。结果妊娠14d(E14)小鼠脊髓内即有BrdU标记的阳性细胞,均匀分布。新生的神经元自神经管侧脑室下带迁移至中间层附近,逐渐分化为神经元,并集中于灰质呈现典型的"H"型。统计学分析表明,BrdU阳性细胞计数在发育中呈现抛物线,高峰值位于出生3d(P3)左右。此外,神经胶质细胞的祖细胞最早集中于边缘白质,随后又向中央的灰质回迁。血管发育经历了早期均匀分布,成年后集中在灰质分布的过程。血管、神经干细胞、神经元和神经胶质细胞构成了所谓的血管-干细胞龛。血管-干细胞龛主要位于侧脑室下带和灰质附近,其中的血管、神经干细胞、神经元和神经胶质细胞互相交织、紧密联系。结论血管-神经干细胞龛与脊髓发育紧密联系,同时影响神经元、神经胶质细胞和血管的相互作用。血管-神经干细胞龛为脊髓发育及神经元和神经胶质细胞分化提供了适宜的微环境。     

细胞来源和培养液成分对大鼠神经前体细胞增殖和分化的影响

在成功建立体外分离培养大鼠胚胎脑和脊髓神经前体细胞(neuron precursor cells,NPCs)的基础上,本研究设计了三种培养液组合:DF/N2、DF/B27和DF/(N2+B27),观察在不同培养液成分对胚胎脑和脊髓NPCs增殖和分化的影响。结果显示:与NF/N2組和DF/B27组相比,脑来源的NPCs在DF/(N2+B27)中增殖最快、最稳定(P<0.01),而脊髓来源的NPCs在三种培养液组合中的增殖速度无明显差异。脑和胚胎15 d脊髓来源的NPCs在DF/B27和DF/(N2+B27)中分化为神经元的比例明显高于DF/N2组合(P<0.01);取自胚胎15 d的脊髓NPCs分化为神经元和少突胶质细胞的比例均显著高于胚胎16 d的NPCs(P<0.05)。以上结果提示:(1)在培养液中同时添加N2和B27不仅可以提高体外培养的NPCs的增殖速度,同时可显著增加神经元分化的比例;(2)NPCs的分化潜能可因NPCs来源(脑或脊髓)和发育阶段的不同而有差异。     

人胎脑神经干细胞的体外培养

目的从人胎脑纹状体中分离培养并鉴定神经干细胞。方法采用包含碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和表皮细胞生长因子(EGF)的无血清培养和单细胞克隆技术,从36周自愿水囊引产人胎脑纹状体中分离出神经干细胞,并观察神经干细胞体外培养、传代、分化潜能。结果从36周人胎脑纹状体中成功分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞,在无血清培养时细胞呈悬浮状态生长,形成神经球,该细胞具有连续克隆能力,可传代培养,呈Nestin免疫反应阳性细胞;在含血清培养时诱导神经干细胞分化,分化后的细胞表达神经元细胞、星形胶质细胞和少突胶质细胞的特异性抗原。结论神经干细胞的存活和分裂有赖于EGF和bFGF的共同作用;36周人胎脑纹状体仍能培养出具有自我复制和分化潜能的神经干细胞。     

体外诱导的皮肤源性神经干细胞在大鼠受损伤脊髓内的存活、分化和迁移

目的探讨经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能否在大鼠脊髓半横断损伤处存活、迁移和分化.方法应用转染绿色荧光蛋白基因新生大鼠的皮肤在体外经分离细胞、培养、诱导增殖以及用免疫细胞化学染色鉴定神经干细胞等过程,将诱导产生的皮肤源性神经干细胞移植入大鼠脊髓半横断损伤处,30 d和60 d后用免疫细胞化学染色法观察移植细胞的存活、迁移和分化.结果皮肤分离细胞在培养10 d时,呈悬浮生长的细胞已增殖成若干细胞球,并呈nestin免疫细胞化学阳性染色,表明是神经干细胞球.在体内可观察到脊髓损伤处有许多带有绿色荧光的移植皮肤源性神经干细胞,有些还迁移到较远的宿主脊髓组织内.存活的移植细胞有些呈现nestin阳性、MAP2阳性及GFAP阳性.结论经体外诱导的皮肤源性神经干细胞能够在受损伤的大鼠脊髓内存活、迁移并分化为神经元样细胞和星形胶质样细胞.