ZNF24基因过表达慢病毒载体的构建及其在人结直肠癌HCT116细胞中的表达

目的 通过构建ZNF24基因过表达慢病毒载体,建立ZNF24基因过表达的人结直肠癌HCT116细胞株,为开展后续研究提供物质基础。方法 通过PCR扩增ZNF24基因序列片段和3FLAG标签序列片段,并将两产物通过同源重组克隆至慢病毒载体pMT406中,构建成重组表达ZNF24慢病毒质粒pMT-ZNF24。将重组质粒pMT-ZNF24与辅助包装载体质粒p CMV-dR8.9和pCMV-VSV-G一起共转染293T细胞并收集慢病毒。应用孔稀释法检测病毒滴度,用qRT-PCR和蛋白印迹法检测慢病毒转染HCT116细胞后ZNF24的表达水平。结果 成功构建了重组载体pMT-ZNF24,并获得相应的病毒,病毒滴度为3.25×10⁹ TU/ml。转染重组ZNF24慢病毒的HCT116细胞中ZNF24表达水平显著高于空白组和阴性对照组细胞。结论 构建了ZNF24基因过表达慢病毒载体,并获得相应的病毒和稳定表达ZNF24的HCT116细胞株。     

表皮生长因子受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建和鉴定研究

目的构建表皮生长因子受体(EGFR)基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,为其体内外实验研究提供依据。方法合成EGFR基因的miRNA干扰序列,构建pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR-EGFR质粒,测序验证插入序列正确,连接到慢病毒载体pLenti6.3-MCS/V5 DEST中,获得pLenti6.3-EGFR-miRNA质粒,与慢病毒包装质粒Packaging MIX、POLOdelivererTM3000 Transfection Reagent共转染293T细胞株,细胞包装产生慢病毒颗粒,测定慢病毒滴度。结果 PCR和测序结果证实,EGFR miRNA核苷酸链序列插入正确,包装慢病毒产生病毒悬液滴度为1.8×106ifu/ml。结论成功构建EGFR基因RNAi慢病毒载体,为研究其在胶质瘤细胞中的生物学功能奠定基础。     

人miR-378慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的构建人miR-378慢病毒表达载体。方法酶切法从已构建的质粒获得pri-miR-378,克隆于含绿色荧光蛋白(GFP)编码基因的PGCSIL载体,转化感受态细胞,产生重组慢病毒质粒PGCSIL-miR-378,并进行PCR及测序鉴定。将PGCSIL-miR-378、pHelper 1.0和pHelper 2.0三种质粒DNA共转染293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平用逐孔稀释滴度法测定病毒滴度。结果成功构建miR-378的慢病毒表达载体,测序证实所插入基因序列完全正确。荧光显微镜检测证实PGCSIL-miR-378携有正确的miR-378基因,并能在293T细胞中表达。检测病毒滴度为8×108 TU/ml。结论成功建立了miR-378慢病毒表达系统。     

小鼠miR-125b慢病毒过表达载体构建与鉴定

目的 构建小鼠胰腺β细胞NIT-1中miR-125b慢病毒过表达载体.方法 从小鼠基因组DNA中用PCR扩增miR-125b的前体序列,经Nhe Ⅰ和PstⅠ酶切后连接到Lv-CMV-GFP载体中,并对重组质粒进行双酶切鉴定和测序分析.将miR-125b过表达载体、pVSV-G和delta8.91质粒共转染293T细胞,收获慢病毒感染NIT-1细胞,流式细胞术分选阳性细胞,RT-PCR鉴定稳转细胞株中miR-125b的表达.结果 成功构建了miR-125b慢病毒表达载体,感染小鼠胰腺β细胞NIT-1后能够成功过表达miR-125b.结论 成功构建miR-125b慢病毒过表达载体,为进一步研究其功能建立了实验基础.     

Toll样受体4重组质粒及稳转HepG2细胞株的构建

目的 将Toll样受体(TLR4)野生型及突变型(包括单突变和双突变)基因分别转入HepG2细胞,建立稳定表达TLR4蛋白的细胞株.方法 PCR扩增用于合成TLR4的cDNA,设计引物应用PCR点突变的方法合成1196T及896G单突变质粒和TLR4-1196T,896G双突变质粒.经慢病毒包装后,将合成的pLVX-TLR4-Puro、pLVX-TLR4(A-G)-Puro、pLVX-TLR4(C-T)-Puro、pLVX-TLR4(A-G,C-T)-Puro质粒转染HepG2细胞.在细胞贴壁后加入嘌呤霉素进行筛选;Western blot检测各组细胞TLR4的表达量.结果 嘌呤霉素筛选出含有抗性基因的细胞,说明TLR4重组质粒成功转入细胞;Western blot结果表明TLR4在HepG2细胞中稳定过表达.结论 成功构建了4组TLR4过表达的细胞株,为研究TLR4基因多态性对HepG2细胞生物学功能的影响奠定基础.     

CRISPR/Cas 9介导的基质Gla蛋白基因敲除对破骨细胞分化的影响

目的利用 CRISPR/Cas 9基因编辑技术,构建基质 Gla蛋白(MGP)基因敲除的 RAW264.7巨噬细胞系,明确 MGP基因在破骨细胞分化过程中的作用。方法利用在线软件分析并筛选出 3个针对 MGP基因外显子区的单链向导 RNA(gRNA)人工合成 gRNA寡核苷酸序列,并将其插入线性化的 LentiCRISPRv2质粒中,构建成 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA重组质粒。将重组,质粒与 psPAX2、VSVG包装质粒一同转染 293?T细胞,包装并收集重组慢病毒,将其感染 RAW264.7细胞。经嘌呤霉素筛选得到稳定 RAW264.7细胞系,实时荧光定量多聚核苷酸链式反应(qPCR)、蛋白质印迹法(Western Blot)验证 MGP mRNA及蛋白表达水平。 qPCR检测破骨细胞分化标志分子的表达情况。结果成功构建了 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA重组质粒,成功包装了含有 MGP?gRNA的重组慢病毒,筛选得到了稳定低表达 MGP的 RAW264.7细胞系。 qPCR及蛋白质印迹法检测显示,MGP mRNA、蛋白表达显著性下调(P＜0.05)。 qPCR结果显示,最具有代表性的 LentiCRISPRv2?MGP?gRNA1细胞破骨标志分其子 Itgb3(2.29±0.17)、 Acp5(2.86±0.15)、 Ctsk(2.07±0.13)的 mRNA水平均显著上调(P＜0.05)。结论利用 CRISPR/Cas 9基因编辑技术成功构建了 MGP基因敲除的 RAW264.7细胞系,敲除 MGP后 RAW264.7细胞破骨分化能力增强。     

ST8Sia1基因过表达载体构建与鉴定及对人黑色素瘤细胞增殖的影响

目的构建ST8Sia1基因过表达载体,建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,检测ST8Sia1的表达及对细胞增殖的影响。方法通过PCR反应扩增ST8Sia1基因片段,双酶切目的基因片段和pEGFP-C1载体以及pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZsGreen-T2A-Puro载体,分别将目的基因片段和不同载体连接,得到ST8Sia1-pEGFP-C1重组载体和重组慢病毒载体。采用PCR方法和DNA序列进行鉴定。分别用不同载体转染黑色素瘤细胞WM451,筛选建立稳定过表达ST8Sia1的细胞株,Real-time PCR检测稳转细胞ST8Sia1 mRNA水平;Western blot法检测稳转细胞中ST8Sia1蛋白表达水平;CCK-8法检测稳转细胞的生长增殖活性;软琼脂克隆形成实验分析稳转细胞的克隆形成能力。结果成功构建ST8Sia1-pEGFP-C1重组质粒及ST8Sia1过表达慢病毒载体。发现ST8Sia1过表达慢病毒载体转染效率较高,建立稳定过表达ST8Sia1的WM451细胞株,发现ST8Sia1过表达促进肿瘤细胞增殖和克隆形成。结论成功构建了ST8Sia1过表达载体,并发现ST8Sia1过表达能够促进黑色素瘤细胞WM451的增殖、克隆形成能力。     

ErbB4基因miRNA慢病毒载体的构建及其在小鼠海马齿状回的表达

目的构建靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体,包装产生高滴度慢病毒并观察其感染小鼠海马齿状回基因的表达。方法将靶向ErbB4基因的miRNA干扰质粒利用Gateway重组技术构建慢病毒表达质粒,并与慢病毒包装系统共转染HEK293T包装细胞,收获上清并浓缩得到慢病毒浓缩液,通过测定绿色荧光蛋白(GFP)表达水平测定其滴度。所得慢病毒浓缩液经立体定位微量注射感染小鼠海马齿状回。观察鼠脑冰冻切片基因表达情况,并用神经元标志物神经元核抗原(NeuN)和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白(GFAP)特异性抗体行免疫染色分析转导的细胞类型。结果阳性克隆测序结果与设计序列一致,说明靶向ErbB4基因的miRNA慢病毒干扰载体构建成功。包装收获慢病毒。浓缩的慢病毒包装上清感染HEK293T细胞后,流式细胞术检测GFP阳性率,计算得慢病毒活性滴度为1.0×1012转导单位(TU).L-1。小鼠海马齿状回立体定位微量注射1.0×1012TU.L-1慢病毒6个月后,观察到注射部位外源基因的显著表达。免疫荧光染色显示,慢病毒转导的细胞多呈NeuN标记阳性,并与GFAP的表达不重叠。结论靶向ErbB4的miRNA慢病毒载体构建成功,获得了靶向ErbB4基因的高滴度miRNA慢病毒颗粒,并实现了脑实质的局部长期稳定转导,慢病毒转导的主要细胞类型为神经元。     

白细胞介素-35慢病毒表达载体的构建及稳转A549细胞系的建立北大核心CSCD

目的构建过表达白细胞介素(IL)-35的慢病毒载体,包装慢病毒并感染肺癌细胞A549建立过表达IL-35的A549稳定细胞株,为研究IL-35在肺癌发生发展中的作用奠定基础。方法根据基因序列及所用载体序列设计用于无缝克隆的引物序列,用聚合酶链式反应(PCR)扩增IL-35基因,EcoRⅠ和Bam HⅠ酶切PCR产物及载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro,经载体重组、转化、PCR鉴定和测序鉴定等获得重组质粒。将筛选出的重组慢病毒质粒与包装质粒共转染HEK-293T细胞,收取病毒浓缩液并检测其滴度。病毒浓缩液感染A549细胞,用Real-time PCR和Western blot方法检测稳转细胞系中IL-35的表达。结果测序结果与预期完全符合,成功构建过表达载体IL-35-pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-T2A-Puro。pCDH-GFP组及pCDH-IL-35-GFP组的慢病毒滴度分别为5.1×10~8和1.03×10~9TU·mL^(-1)。Western blot和real-time PCR显示,A549-IL35组的EBI3及P35蛋白相对表达量分别为0.27±0.05和0.75±0.02,A549-pGFP组的EBI3及P35蛋白相对表达量分别为0.06±0.01和0.24±0.01,A549-IL35组的EBI3及P35 mRNA的相对表达量分别为444.75±37.31和309.78±53.92,A549-pGFP组的EBI3及P35 mRNA相对表达量分别为1.03±0.05和1.04±0.03,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论成功构建了过表达IL-35的慢病毒载体和过表达IL-35的A549稳定细胞株。     

人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体构建及鉴定

目的构建并鉴定靶向人ERRα基因的小分子干扰RNA的慢病毒载体。方法针对ERRαmRNA设计了4条si RNA,并构建pGCSIL-GFP-siERRα慢病毒质粒,PCR扩增阳性克隆并测序鉴定。用pGCSIL-GFP-siERRα、pHelp-er1.0和pHelper2.0质粒共转染293T细胞包装产生慢病毒,测定病毒滴度。将慢病毒干扰RNA及含有ERRα过表达载体共转染293T细胞,Western-blot检测ERRα表达,观察蛋白表达抑制效果。结果 PCR和测序结果与设计的干扰序列一致,病毒滴度达2×109TU/ml。转染细胞中ERRα蛋白表达显著降低。结论成功构建高表达、高效率的人ERRα基因小分子干扰RNA慢病毒载体,为进一步研究ERRα在细胞核内转导中的作用机制和靶向ERRα治疗奠定基础。     

新型Tet-On系统大鼠GDNF和TH双基因的慢病毒载体的构建与表达

目的采用改良的Tet-On四环素可调控系统,构建携带大鼠胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)基因和酪氨酸羟化酶(TH)双基因的慢病毒载体,观察四环素类抗生素对GDNF、TH基因的表达调控。方法 PCR方法获得大鼠GD-NF、TH基因,将其克隆至改良的Tet-On四环素调控慢病毒载体。通过瞬间转染法包装出病毒上清,用实时荧光定量PCR鉴定滴度。将包装的慢病毒-TH-GDNF与rtTA2S-M2以相同感染复数(MOI)感染293T细胞,实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测强力霉素对GDNF、TH基因mRNA和蛋白的表达调控。结果实验成功构建重组慢病毒载体质粒;生产的病毒浓缩后滴度为2.1×1011TU·L-1;感染293T细胞实时荧光定量PCR和免疫印迹显示强力霉素阳性组可见GDNF、TH基因mRNA表达明显升高(P<0.01)和蛋白条带,阴性组未见。结论在改良的Tet-On调控系统的慢病毒载体上成功克隆大鼠GDNF、TH双基因,其表达受四环素类抗生素调控并未见背景效应。     

大鼠 paralemmin-3基因重组慢病毒载体构建及其在肺泡巨噬细胞中的表达

目的 构建大鼠 paralemmin-3（PALM3）基因重组慢病毒载体,探讨转染大鼠肺泡巨噬细胞系 NR8383细胞的最佳感染复数（MOI）值及目的基因 PALM3的表达情况。方法 采用聚合酶链反应技术（PCR）扩增鼠 PALM3基因片段,并将其克隆到 pCV186-Cherry载体上;经 PCR及 DNA测序鉴定后,将重组质粒 pCV186-Cherry-PALM3、辅助包装质粒 pHelper 1.0与 pHelper 2.0共转染至 293T细胞进行重组慢病毒 lenti-CV186-Cherry-PALM3的包装,并用荧光标记法行滴度的测定。将不同 MOI值（0、1、10、20、50）的 lenti-CV186-Cherry-PALM3转染 NR8383细胞,依据转染效率得到最佳 MOI 值,以此 MOI 值感染 NR8383细胞,采用 Western blot 法检测目的基因的表达情况。结果 通过 PCR扩增获得了大小约 2 246 bp的目的基因片段,并成功连接到 pCV186-Cherry重组质粒上。PCR及 DNA测序结果证实重组质粒 pCV186-cherry-PALM3 携带正确的鼠 PALM3 基因并成功包装重组慢病毒颗粒。重组慢病毒 lentiCV186-Cherry-PALM3 的滴度测定为 3×108 TU/mL,感染 NR8383 的最佳 MOI 为 20,慢病毒 lenti-CV186-CherryPALM3 感染后 NR8383 细胞中 PALM3 的蛋白表达水平显著上调（P＜0.05）。结论 本实验成功构建了含大鼠PALM3基因的重组慢病毒载体 lenti-CV186-Cherry-PALM3,并能在 NR8383细胞中高效表达,为进一步研究 PALM3对肺泡巨噬细胞极化的影响奠定了基础。     

大鼠Adrb3基因重组慢病毒干扰载体的构建及其对血管平滑肌细胞Adrb3表达的影响

目的 构建大鼠Adrb3 （rAdrb3） 基因慢病毒干扰载体, 筛选高效率rAdrb3基因干扰序列, 观察其对大鼠血管平滑肌细胞 （VSMC） Adrb3基因表达的影响, 为进一步研究Adrb3在心力衰竭中的作用机制提供实验工具。方法 设计2条rAdrb3基因shRNA寡核苷酸序列, 构建慢病毒干扰质粒并进行测序鉴定。三质粒法共转染293T细胞包装慢病毒, 测定慢病毒滴度。大鼠VSMC设置正常对照组 （Normal组）, 空载慢病毒组 （Lv-rAdrb3-shRNA-control组）,携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体1组 （Lv-rAdrb3-shRNA-1组）, 携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体2组 （Lv-rAdrb3- shRNA-2组）, 感染5 d后, 收集细胞。提取细胞总RNA和蛋白, Real-time PCR检测rAdrb3 mRNA表达, Western blot 检测rAdrb3蛋白表达。结果 构建2个携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体, 滴度均为2×108 TU/mL。慢病毒感染大鼠 VSMC 72 h后, 感染效率可达80%。与Normal组比较, Lv-rAdrb3-shRNA-1、 Lv-rAdrb3-shRNA-2组Adrb3 mRNA水平沉默效率为87.18%、 65.27% （P＜0.05）; 与Normal组比较, Lv-rAdrb3-shRNA-1、 Lv-rAdrb3-shRNA-2组rAdrb3蛋白水平沉默效率为85.57%、 70.04% （P＜0.05）。结论 成功构建并筛选出有效携带rAdrb3基因慢病毒干扰载体, 可显著抑制大鼠VSMC Adrb3的表达。     

has-miR-181b慢病毒表达载体的构建与鉴定

目的构建靶向has-miR-181b基因的慢病毒表达载体。方法根据has-miR-181b序列设计互补的单链寡核苷酸引物序列进行退火延伸后连入经双酶切的pGCSIL-GFP载体质粒,与辅助元件载体质粒pHelper 1.0及pHelper 2.0共同导入感受态细胞T293进行慢病毒包装,收集、浓缩并测定病毒滴度。用所得病毒转染U87胶质瘤细胞;实时定量PCR检测转染后miR-181b表达,流式细胞术检测细胞凋亡以及Transwell实验评价细胞侵袭能力的改变。结果目的序列成功连接入载体,测序分析证实目的序列载体构建成功,并测得病毒滴度为6×109 TU/ml;病毒转染U87胶质瘤细胞能够显著上调has-miR-181b表达,该病毒载体能够有效诱导胶质瘤细胞凋亡,显著抑制U87细胞的侵袭性。结论成功建立高效稳定表达has-miR-181b的慢病毒转染系统,体外实验中能够有效诱导U87胶质瘤细胞凋亡,并且可以抑制胶质瘤的侵袭能力。     

大鼠HSP27基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达shRNA的结构酶切插入慢病毒转移质粒pNL-IRES2-EGFP,产生pNL-HSP27-IRES2-EGFP,在293T细胞中与VSVG、pHelper包装产生慢病毒。48 h后收集上清液,离心过滤后进行病毒滴度测定。用构建正确的慢病毒质粒载体感染血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs),检测干扰效果。结果酶切和测序两种方法结果证明3种质粒载体的插入序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为3.12×109fu.L-1。重组慢病毒质粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1的RNA干扰效率最高,为0.771。结论成功构建靶向大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体。为进一步研究HSP27功能和用慢病毒进行基因治疗奠定基础。     

人脂联素基因慢病毒载体在293 T细胞中的表达及意义

目的构建携带人脂联素(human apM1,hapM1)基因的慢病毒载体,并观察其在293 T细胞中的表达及意义。方法将hapM1的编码区(CDS区)从克隆载体上亚克隆到慢病毒载体上,构建重组慢病毒载体质粒。在脂质体介导下与包装质粒HELPER、包膜质粒VSVG共转染293 T细胞包装生产慢病毒。慢病毒感染293 T细胞后,RT-PCR和Westernblot法检测在293 T细胞中hapM1基因的表达。采用抑制血管平滑肌细胞增殖实验,检测表达产物的生物学活性。结果hapM1基因经测序后与GenBank报道序列完全一致。重组慢病毒载体质粒PNL-hapM1-IRES2-EGFP经鉴定正确。三质粒共转染293 T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2.0×105TU·L-1。感染293 T细胞后RT-PCR、Western blot检测hapM1组细胞有hapM1蛋白表达,其余两组(Mock-293 T组、293 T组)均无表达。表达产物hapM1蛋白能够抑制血管平滑肌细胞的增殖。结论成功构建带有hapM1基因慢病毒载体,并且能够在293 T细胞中表达具有生物学活性的hapM1蛋白。     

CYP4F3基因RNA干扰重组慢病毒载体的构建

目的构建细胞色素P450(CYP)4F3基因RNA干扰(RNAi)重组慢病毒载体。方法设计并合成CYP4F3 siRNA序列,与含U6启动子和绿色荧光蛋白(GFP)的pGCL载体连接产生PscsiCYP4F3慢病毒载体,PCR和测序鉴定。用PscsiCYP4F3、pHelper1.0和pHelper2.0质粒共转染人肾上皮细胞系293T细胞,包装产生慢病毒,测定病毒滴度,并以人肺腺癌A549细胞中CYP4F3mRNA表达水平确定该基因干扰的有效靶点。结果成功构建CYP4F3siRNA的慢病毒载体,并筛选出该基因的有效干扰靶点。结论成功构建人CYP4F3基因RNAi慢病毒载体,为后期研究CYP4F3基因功能奠定基础。     

慢病毒介导的人MUC1核心肽串联重复片段修饰的树突状细胞疫苗的制备

目的探讨制备慢病毒介导的人mucin糖粘蛋白1(MUC1)核心肽串联重复序列(TR)修饰的树突状细胞(DC)疫苗的可行性。方法人工合成编码MUC1 5个TR片段的基因序列,将其克隆入慢病毒载体pLV-GFP中,经酶切、基因测序鉴定。构建成功的慢病毒载体转染293T细胞,制备病毒。病毒液感染DC细胞。流式细胞术检测感染效率及DC表型,RT-PCR及Westernblot检测MUC1目的基因的表达。结果酶切及测序证实慢病毒载体构建成功。制备的慢病毒能有效感染DC细胞,感染效率达32.54%;流式检测证实慢病毒感染后DC成熟表型未受影响;RT-PCR及Western blot检测证实转染后的DC可有效表达MUC1。结论成功制备慢病毒介导的MUC1基因TR片段修饰的DC疫苗。