丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌诱导骨髓来源巨噬细胞功能的影响

目的 观察丹皮酚对牙龈卟啉单胞菌作用下对体外培养的小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMM）炎性因子分泌及向破骨细胞分化能力的影响,并探讨其作用机制。方法 体外分离获得小鼠生长良好的BMM,加入不同浓度丹皮酚溶液处理1 h,再加入牙龈卟啉单胞菌进行24 h诱导刺激。采用流式细胞术检测炎症相关蛋白程序性死亡分子配体1（PD-L1）的表达量,采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）及白细胞介素-6（IL-6）水平;在核因子κB受体活化因子配体（RANKL）和巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）刺激后的BMM中加入不同浓度的丹皮酚溶液处理1 h后,加入牙龈卟啉单胞菌刺激,采用抗酒石酸性磷酸酶（TRAP）染色观察破骨细胞形成情况,Western blot检测破骨细胞形成相关蛋白TRAP和核因子κB受体活化因子（RANK）的表达。结果 丹皮酚在10~50 μmol·L^-1的范围内,对BMM无毒性作用。流式细胞术结果提示丹皮酚可以抑制牙龈卟啉单胞菌诱导PD-L1的表达,并存在剂量依赖效应。ELISA实验证明丹皮酚能以剂量依赖性方式抑制BMM释放TNF-α、IL-1β及IL-6（P<0.01）。牙龈卟啉单胞菌可以明显诱导BMM分化形成破骨细胞;TRAP染色显示丹皮酚各浓度组能抑制BMM向破骨细胞分化;Western blot结果显示丹皮酚抑制TRAP和RANK表达且存在剂量依赖效应。结论 丹皮酚可以剂量依赖方式抑制牙龈卟啉单胞菌诱导的BMM炎性因子TNF-α、IL-1β及IL-6的分泌及其向破骨细胞分化的能力。     

IL-1β在大鼠颞下颌关节炎性痛中的作用机制探讨

目的：探讨ERK1/2、NF-κB信号通路是否参与白细胞介素1β（IL-1β）上调疼痛因子Nav1.7的表达,进而参与大鼠颞下颌关节炎性痛。方法：建立颞下颌关节炎症模型或通过大鼠三叉神经节脑立体定位实验,于活体大鼠三叉神经节内注射IL-1β,评估三叉神经节p-ERK1/2、p-p65、Nav1.7、COX-2、p-CREB等分子的表达及摆头阈值变化。体外培养大鼠三叉神经节,IL-1β单独或联合ERK、NF-κB抑制剂U0126、PDTC,利用实时定量 PCR及蛋白免疫印迹评估三叉神经节p-ERK1/2、p-p65、Nav1.7、COX-2、p-CREB的表达变化。采用SPSS 22.0软件包进行数据统计。结果：诱导颞下颌关节炎症24 h及活体大鼠三叉神经节内注射IL-1β 24 h后,三叉神经节内p-ERK1/2、p-p65、Nav1.7、COX-2、p-CREB 表达显著上调,同时摆头阈值降低。ERK及NF-κB抑制剂均可阻断IL-1β上调三叉神经节内Nav1.7、COX-2、p-CREB表达。结论：IL-1β通过ERK1/2、NF-κB信号通路上调三叉神经节内Nav1.7的表达,进而参与大鼠颞下颌关节炎性痛。     

釉质基质蛋白通过miR-32对乳牙牙髓干细胞成骨与成脂分化的影响

目的: 探讨釉质基质蛋白（EMPs）对乳牙牙髓干细胞（SHED）成骨和成脂作用的影响,并探讨其分子机制。方法: 采用流式细胞术检测SHED表面抗原CD73、CD146、CD34和CD45的表达。通过OB成骨诱导液诱导SHED,采用茜素红染色检测其成骨分化能力。将SHED分为4组,NC组为无效序列shRNA干扰SHED,EMPs组为无效序列shRNA干扰SHED后,再用100 μg/L EMPs干预SHED,miR-32 inhibitor组为miR-32 shRNA质粒干扰SHED,EMPs+miR-32 inhibitor组为沉默miR-32后,再用100 μg/L的EMPs组干预SHED。qPCR检测miR-32、牙本质涎磷蛋白 (DSPP)、牙本质基质蛋白1 (DMP-1)、过氧化物酶体增殖剂激活受体γ（PPARγ）和CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）的基因表达。采用Western免疫印迹法检测DSPP、DMP-1、PPARγ和C/EBPα蛋白表达量,茜素红染色检测SHED成骨能力,油红O染色检测SHED成脂能力。采用GraphPad Prism 5软件进行统计学分析。结果: 流式细胞术结果显示,SHED的CD146和CD73阳性表达,CD34和CD45阴性表达,与干细胞表面标志物特征一致。茜素红染色和油红O染色显示,矿化结节和油滴明显增多,与干细胞多向分化特征一致。与NC组相比,EMPs组中miR-32基因表达量显著增加（P<0.05）,miR-32 inhibitor组和EMPs+miR-32 inhibitor组中miR-32表达量显著减低（P<0.05）。与NC组相比,EMPs组DSPP和DMP-1表达量,矿化结节数量显著增加（P<0.05）,PPARγ和C/EBPα表达量和油脂滴数量显著降低（P<0.05）,而miR-32 inhibitor组结果与之相反（P<0.05）。与miR-32 inhibitor组相比,EMPs+miR-32 inhibitor组DSPP、DMP-1、PPARγ和C/EBPα表达量,矿化结节数量和油脂滴数量无显著差异（P>0.05）。与EMPs组相比,EMPs+miR-32 inhibitor组DSPP和DMP-1表达量,矿化结节数量显著降低（P<0.05）,而PPARγ和C/EBPα表达量及油脂滴数量显著增加（P<0.05）。结论: EMPs通过促进miR-32的表达,从而调控SHED的成骨和成脂分化。     

低氧诱导因子1α在小鼠下颌第一磨牙萌出过程中的表达及意义

目的:研究小鼠下颌第一磨牙萌出过程中低氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1alpha,HIF-1α）的表达,并探讨其表达与牙萌出及破骨细胞活性之间的关系。方法:分离出生后1.5~14.5 d小鼠的下颌骨,连续切片,对每组切片进行苏木精-伊红（H-E）染色、抗酒石酸酸性磷酸酶染色以及免疫组织化学染色。采用SPSS 25.0软件包进行统计学分析。结果:小鼠下颌第一磨牙萌出过程中,其冠方牙槽骨厚度逐渐减小,破骨细胞数量逐渐减少,HIF-1α在萌出过程中的表达逐渐减少。结论:小鼠下颌第一磨牙萌出过程中,HIF-1α表达越少,破骨细胞数量也越少。HIF-1α可能通过影响破骨细胞活性而参与小鼠下颌第一磨牙的萌出。     

雷洛昔芬对牙周炎合并系统性绝经后骨质疏松症小鼠模型局部牙槽骨破坏的影响

目的：探讨雷洛昔芬对牙周炎合并系统性绝经后骨质疏松症（PMO）小鼠模型局部牙槽骨破坏的影响。方法：无特定病原级雌性成熟Wistar小鼠,适应性喂养7 d 后,随机分为空白组（保留两侧卵巢,只切除卵巢组织周围与卵巢重量相当的脂肪组织）、对照组（切除两侧卵巢+口腔正畸结扎丝结扎）、实验组（切除两侧卵巢+口腔正畸结扎丝结扎+雷洛昔芬试剂）,每组各15只。术后4周拍摄CT,检测骨密度和骨吸收情况,体视显微镜观察牙槽骨破坏情况,酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测破骨相关因子白细胞介素1(IL-1)、IL-1α、转化生长因子(TGF)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、TNF-β的表达水平。采用SPSS 18.0软件包对数据进行统计学分析。结果：对照组新骨形成少于实验组。亚甲蓝染色结果显示,对照组小鼠骨显著吸收,体视显微镜下可见骨破坏,实验组小鼠骨吸收程度较轻。与空白组相比,对照组、实验组牙槽骨密度降低而牙槽骨丧失、IL-1、IL-1α、TGF、TNF-α、TNF-β显著升高（P<0.05）;对照组牙槽骨密度显著低于实验组（P<0.05）,牙槽骨丧失、IL-1、IL-1α、TGF、TNF-α、TNF-β显著高于实验组（P<0.05）。结论：雷洛昔芬可减少PMO牙周炎症小鼠牙槽骨吸收、破骨细胞因子表达,防止牙槽骨破坏而有效防止牙周炎进展。     

牙髓卟啉单胞菌脂多糖对小鼠成骨细胞表达MCP-1的影响

目的: 探讨牙髓卟啉单胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.endodontalis)脂多糖对小鼠成骨细胞表达单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)mRNA和蛋白的影响,以及是否有p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）信号通路和核因子κB（Nuclear Factor-κB, NF-κB）信号通路的参与。方法: 以不同质量浓度的P.endodontalis脂多糖(0~50 mg/L)刺激MC3T3-E1细胞24 h;以20 mg/L P.endodontalis脂多糖作用于细胞不同时间（0~48 h）后,采用实时反转录PCR和酶联免疫吸附测定检测MCP-1mRNA和蛋白的表达。采用p38MAPK抑制剂SB203580和NF-κB抑制剂BAY11-7082分别预处理细胞1 h,检测其对P.endodontalis脂多糖刺激MC3T3-E1细胞后MCP-1mRNA表达的影响。采用SPSS 13.0软件包对结果进行单因素方差分析和Dunnett t检验。结果: 不同质量浓度的P.endodontalis脂多糖（0~50 mg/L）刺激MC3T3-E1细胞后,MCP-1的mRNA表达和蛋白分泌呈剂量依赖性;观察时间内（0~48 h）,20 mg/L P.endodontalis脂多糖作用于MC3T3-E1细胞后,MCP-1 mRNA的表达和蛋白分泌呈时间依赖性;10 mol/L的SB203580和BAY11-7082分别预处理细胞1 h,可以降低P.endodontalis脂多糖诱导MCP-1 mRNA的表达,且SB203580的抑制作用强于BAY11-7082。结论: P.endodontalis脂多糖可能通过激活p38MAPK和NF-κB信号通路诱导成骨细胞表达MCP-1mRNA和蛋白。     

黄芩苷调控的IKKα对HOKs炎症反应的保护作用

目的: 观察黄芩苷对HOKs炎症反应中IKKα介导的MASPIN的调控作用,探讨黄芩苷对口腔黏膜炎症的分子调控机制。方法: 以脂多糖（LPS）刺激人口腔角质细胞（human oral keratinocytes, HOKs）,体外局部模拟口腔黏膜上皮细胞炎性环境。CCK-8法检测黄芩苷对HOKs的毒性作用;在LPS刺激的HOKs中预先加入不同浓度黄芩苷,应用ELISA法检测黄芩苷对LPS刺激的HOKs中IL-6和TNF-α分泌的调控作用;利用RT-PCR及Western免疫印迹检测黄芩苷对LPS刺激的HOKs中IKKα介导的MASPIN基因及蛋白表达水平的调控作用。采用SPSS 21.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 以10 μg/mLLPS刺激HOKs,可作为口腔黏膜上皮细胞炎症模型。黄芩苷（1~20 μg/mL）对HOKs无毒性作用;随着黄芩苷浓度的升高,MASPIN在LPS刺激的HOKs中的表达逐渐升高,而IKKα及炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达逐渐降低（P<0.05）。结论: 在LPS刺激的HOKs中,黄芩苷可降低炎性因子表达,下调IKKα,上调MASPIN。     

高纯度破骨样细胞体外培养及功能表达的研究

目的建立大量高纯度破骨样细胞体外培养的方法,并运用分子生物学技术观察体外诱导培养的破骨样细胞标志酶的基因表达。方法按照巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF） 30 ng/mL、核因子κB受体活化因子配基（RANKL） 50 ng/mL的质量浓度对骨髓单个核细胞诱导培养6 d,利用形态学观察、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、Giemsa染色、骨吸收陷窝检测以及破骨细胞标志酶基因表达的检测,对生成的破骨样细胞进行鉴定。结果实验获得的破骨样细胞中,TRAP阳性的单核破骨样细胞多见、TRAP阳性的多核破骨样细胞数量相对较少,胞核从2个到十几个不等;光镜下牙本质片上可见各种形态的骨吸收陷窝;应用RT-PCR方法证实破骨样细胞表达膜型基质金属酶（MT1-MMP）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）、TRAP和组织蛋白酶K（CK）4种标志酶。结论以M-CSF和RANKL作为诱导因子,对大鼠骨髓单个核细胞进行诱导培养可以获得具有典型的破骨细胞形态特征,可以表达特征性标志酶基因,且数量大、纯度高。     

牡荆素对脂多糖诱导牙髓干细胞表达炎症因子的影响

目的：探讨牡荆素（vitexin,VTX）对脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）诱导的人牙髓干细胞（human dental stem pulp cells,hDPSCs）表达炎症因子的影响,并初步探讨其相关作用机制。方法：分离、培养hDPSCs,以CCK-8法检测VTX对hDPSCs增殖的影响,检测VTX毒性浓度范围。铺种hDPSCs,分为4组,空白组以不含LPS和VTX的无血清DMEM,LPS组仅加入含LPS终浓度为2 μg/mL的无血清DMEM培养,VTX处理组1(V1组)加入2 μg/mL LPS+25 μmol/L VTX,VTX处理组2(V2组)加入2 μg/mL LPS + 50 μmol/L VTX。培养48 h,实时荧光定量PCR检测各组细胞中IL-1β、IL-6及IL-8基因转录,蛋白质免疫印迹检测hDPSCs内MPAK信号通路及COX-2等蛋白的变化。采用SPSS 16.0软件包对数据进行统计学分析。结果：VTX在200 μmol/L范围内时细胞活力不受影响(P>0.05);VTX抑制LPS刺激hDPSCs转录IL-1β、IL-6及IL-8,抑制效果与VTX的浓度呈正相关;VTX可显著抑制LPS激活p38及ERK信号通路。结论：VTX可能通过抑制p38及ERK信号通路的激活,降低LPS诱导的hDPSCs转录IL-1β、IL-6及IL-8。     

姜黄素对环孢素A诱导激活的大鼠牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3通路的抑制作用

目的：体外实验研究姜黄素（curcumin,Cur）对环孢素A（cyclosporine A,CsA）作用大鼠牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3通路的影响,为进一步探讨Cur抑制CsA所致药物性牙龈增生的发生机制提供理论依据。方法：使用CCK-8法观察0、5、10、20、30 μmol/L Cur对大鼠牙龈成纤维细胞增殖的影响, 20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用对大鼠牙龈成纤维细胞增殖的影响。实时荧光定量PCR检测20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用下,牙龈成纤维细胞中转化生长因子TGF-β1、Smad3、平滑肌肌动蛋白α-SMA和I型胶原蛋白COL-I的mRNA表达变化;蛋白免疫印迹实验检测TGF-β1、Smad3、p-Smad3、α-SMA和COL-I的蛋白表达变化。细胞划痕实验观察20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA 对牙龈成纤维细胞迁移能力的影响。采用SPSS 23.0 软件包对数据进行统计学分析。结果：大鼠牙龈成纤维细胞在20 μmol/L Cur+200 ng/mL CsA共同作用下,细胞增殖和迁移能力明显降低;20 μmol/L Cur显著下调了牙龈成纤维细胞中TGF-β1、α-SMA 和COL-I的mRNA 表达,蛋白免疫印迹实验提示,TGF-β1、p-Smad3、α-SMA 和COL-I的表达同样显著下调。结论：Cur可能通过抑制CsA激活的牙龈成纤维细胞TGF-β1/Smad3 信号通路,从而降低牙龈成纤维细胞增殖、迁移、平滑肌肌动蛋白和胶原分泌,改善牙龈增生。     

牙本质细胞外基质蛋白对乳牙牙髓干细胞体外增殖、分化能力的影响

目的:提取牙本质细胞外基质蛋白(Dentinextracellularmatrixproteins,DEMPs)研究其对人脱落的乳牙牙髓干细胞(Stemcellfromhumanexfoliateddeciduousteeth,SHED)体外增殖分化能力的影响。方法:采用组织块联合酶消化法获得SHED并进行体外培养。成骨诱导液诱导细胞,鉴定其多向分化能力;拔取健康牛牙,用4mol/L盐酸胍和0.5mol/LEDTA提取DEMPs,四唑盐比色法(MTT)检测不同浓度DEMPs对SHED增殖能力的影响,同时测定DEMPs对SHED碱性磷酸酶(ALP)活性的影响;实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测牙本质磷蛋白与牙本质基质蛋白1的mRNA表达情况。结果:DEMPs诱导细胞培养3d、5d可促进细胞增殖。细胞培养5、7d上调ALP活性,RT-PCR结果显示,DEMPs诱导后可促进DSPP与DMP-1基因的表达。结论:牙本质细胞外基质蛋白可以促进SHED的增殖与牙向分化能力。     

干扰素-γ对脱落乳牙干细胞增殖和凋亡影响研究

目的　研究促炎症细胞因子干扰素-γ（interferon-gamma,IFN-γ）对脱落乳牙干细胞（stem cells from exfoliated deciduous teeth,SHED）增殖和凋亡的影响,为揭示免疫微环境在组织再生中的作用及潜在机制提供理论基础和实验依据。方法　原代分离培养人SHED,用不同浓度（10、50、100、200 ng/mL）的IFN-γ处理SHED记为IFN-γ处理组,未加入IFN-γ的记为对照组。应用CCK-8实验检测细胞增殖情况,流式细胞术和甲苯胺蓝染色检测细胞凋亡情况。采用SPSS 20.0软件进行统计学分析。结果　原代培养SHED表达间充质干细胞表面标记物CD73、CD90、CD105,体外诱导培养具有成骨、成神经和成脂的多向分化潜能。不同浓度IFN-γ均显著抑制SHED的增殖（F = 169.7,P < 0.0001）,且可能具有浓度依赖性;随IFN-γ处理时间的延长,其对SHED增殖的抑制作用越强（F = 4.81,P = 0.0007）;高浓度IFN-γ处理组（100、200 ng/mL）SHED凋亡率和存活率与对照组相比,差异有统计学意义（均P < 0.05）。结论　IFN-γ能够抑制SHED增殖以及诱导其凋亡,从而损伤SHED的生物学性能,降低其骨再生能力。     

低能量微波照射对大鼠正畸牙移动及牙周组织改建的影响

目的： 探讨低能量微波照射对大鼠正畸牙移动及牙周组织改建的影响。方法： 将SD大鼠随机分为对照组和实验组。采用螺旋弹簧加力法,通过镍钛拉簧装置构建大鼠正畸模型。实验组每天1次,用微波治疗仪照射被移动的第一磨牙,每次30 min;对照组不施加任何干预措施。分别在造模当天、第7、14、21天处死大鼠,测量大鼠第一磨牙的移动距离。抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色检测大鼠牙周组织中破骨细胞计数;免疫组织化学检测破骨细胞分化因子（ODF）的表达;实时荧光定量PCR（RT-PCR）检测白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）mRNA的表达。采用SPSS 20.0软件包对实验数据进行统计学分析。结果： 第7、14、21天时,与对照组相比,实验组大鼠第一磨牙移动距离、牙周组织中破骨细胞计数、ODF表达显著升高（P<0.05）,牙周组织中IL-6和TNF-α的mRNA表达显著下降（P<0.05）。结论： 低能量微波照射能明显加快正畸牙移动速度,抑制炎性基因表达,促进牙周组织改建。