rpoB基因突变与结核分枝杆菌利福平耐药相关性研究

目的 探讨临床患者痰标本中分离的结核分枝杆菌rpoB基因突变与利福平耐药之间的关系. 方法 对115株结核分枝杆菌应用L-J药敏培养法,检测对利福平、异烟肼、乙胺丁醇、链霉素、氧氟沙星的耐药情况;根据rpoB基因序列设计包含利福平耐药决定区（RRDR）的扩增引物,PCR法进行扩增,运用生物信息学方法对耐药决定区扩增产物序列进行比对分析,对耐药株与非耐药株基因突变率进行统计学分析. 结果 115株结核分枝杆菌经比例法药敏试验,RIF耐药株53株,占所有菌株的46.09％;53株RIF耐药株中39株rpoB基因存在不同位点的变异,突变率为73.58％,突变位点包括531、526、522、516、513、511,最主要的突变位点集中在531位,引起氨基酸呈Ser531Gln、Ser531Leu、Ser531Trp 3种形式改变;RIF敏感株62株,其中有2株检测到rpoB基因的突变,敏感株与耐药株突变率经McNemar统计检验,差异有统计学意义（P＜0.05）. 结论 岳阳地区rpoB基因变异与利福平耐药呈高度相关,rpoB基因最主要的突变位点位于531位和526位.     

结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的评价检测rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐利福平（I肝）耐药性测定中的应用价值。方法采用DNA序列分析法和聚合酶链反应-单链构象多态性（PER—SSCP）法对91株结核分枝杆菌临床分离株（其中药物敏感株35株，耐RFP或含耐RFP耐多药株56株）rpoB基因核心区域的突变情况进行检测。结果以结核分枝杆菌H37RV为对照，所有35株药物敏感株的rpoB基因均无突变，用DNA序列分析方法检测56株耐药株中53株发生突变，敏感性为94．6％（53／56），其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸。PER—SSCP检测56株耐RFP分离株中，52株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性为92．9％（52／56）。结论DNA序列分析对判断结核分枝杆菌耐利福平非常有价值。PER—SSCP可初步筛选结核分枝杆菌RFP耐药性。     

结核分支杆菌rpoB基因突变与耐利福平的研究

目的：研究结核分支杆菌耐利福平（RFP）分离株rpoB基因突变情况并评价其应用价值。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对355株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株109株，耐RFP或含耐RFP株246株）rpoB基因进行检测，并对其中31株耐药株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果：以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照，所有109株药物敏感株rpoB基因均无突变；246株耐药株中，225株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性为91.5％。31株耐药株（其中SSCP异常25株，正常6株）PCR扩增产物经测序证实，19株在531位密码子TCG-TTG，7株526位密码子CAC-TAC，3株在516位密码子GAC-GTC，2株未改变。结论：rpoB基因突变是耐 RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制；其最常见的突变位点是531位色氨酸和526位组氨酸，PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP耐药性。     

合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究

目的:了解合肥地区结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药株rpoB基因突变特点。方法:应用PCR-直接测序法对合肥地区肺结核病人痰液中分离的90株结核分枝杆菌的rpoB基因629 bp(包括rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)的81 bp)序列进行测定分析。结果:90株结核分枝杆菌中69株对RFP耐药,21株对RFP敏感;69株耐利福平临床分离株中53株发生rpoB基因突变,突变率为76.8%;突变发生在531位丝氨酸的31株,发生率为44.9%,发生在526位组氨酸的8株,发生率为11.6%;还有6株发生了联合突变,发生率为8.7%。21株敏感株中1株rpoB基因发生突变,突变位点是533位亮氨酸。结论:合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB基因的RRDR发生了突变,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。     

淮南矿区煤工尘肺结核患者耐多药结核分枝杆菌耐药基因rpoB序列分析

目的 分析淮南矿区尘肺结核患者感染的耐多药结核分枝杆菌(multiple drugs resistant bacillus tuberculosis,MDR-TB)利福平耐药基因rpoB突变特点.方法 收集结核分枝杆菌临床分离株114株,采用药敏试验鉴定MDR-TB,抽提MDR-TB DNA和H37Rv标准菌株DNA,PCR法扩增rpoB基因,并应用全自动DNA测序仪对rpoB基因的突变集中区域进行测序分析.结果 从114株结核分枝杆菌临床分离株中检出MDR-TB31株(27.19％,31/114),31株MDR-TB中rpoB基因突变率为93.55％(29/31),主要集中在531(45.16％,14/31)和526位点(29.03％,9/31)碱基置换突变,其次是516(3.23％,1/31)、535位点(3.23％,1/31);1株526位和531位同时突变,1株511位和526位同时突变,2株未发现rpoB基因突变.随机检测的10株利福平敏感株未见rpoB基因单链构象异常.结论 高度保守的rpoB基因突变是导致尘肺结核患者MDR-TB利福平耐药的分子基础,其突变位点呈多样性.     

结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特征研究

目的了解郑州市结核分枝杆菌耐利福平临床分离株的相关耐药rpoB基因突变特征。方法应用PCR方法对40株结核分枝杆菌利福平耐药、40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株中包含"利福平耐药决定区(RRDR)"在内的rpoB基因片段(385bp)进行扩增,并将扩增产物进行测序,以H37Rv结核分枝杆菌标准株的DNA序列作为参比序列,分析结核分枝杆菌临床分离株的突变特征。结果 40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株均未检测到突变,结核分枝杆菌耐利福平临床分离株中有36株检测到突变,突变率92.3%,且突变均位于RRDR区域内;突变位点为8个,共有8个突变类型;最常见的突变热点依次为531位点,该位点突变率为64.1%;526位点,其突变率为12.8%和516位点,其突变率为10.3%。结论 rpoB基因是郑州市结核分枝杆菌对利福平耐药的最相关基因,其中在RRDR内的531位点基因突变率最高,并可通过对rpoB基因的突变检测,对耐多药结核病进行预测。     

煤矿工尘肺结核患者结核分枝杆菌L型耐药基因rpoB序列分析

目的 探讨淮南矿区尘肺结核患者感染结核分枝杆菌L型利福平耐药基因rpoB突变特点.方法 收集结核分枝杆菌L型临床分离株42株,其中利福平耐药株31株,敏感株11株,抽提临床分离株DNA和H37Rv标准菌株DNA,PCR法扩增rpoB基因,并应用全自动DNA测序仪对rpoB基因的突变集中区域进行测序分析.结果 42株结核分枝杆菌L型中,31株耐药株rpoB基因突变率93.55%(29/31),主要集中在531位点(51.61%,16/31)和526位点(32.26%,10/31)碱基置换突变,新发现516位点突变目前在国内外研究中未见报道.11株敏感株未见rpoB基因单链构象异常.结论 高度保守的rpoB基因突变是导致结核分枝杆菌L型利福平耐药的分子基础,其突变位点呈多样性.     

55株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因突变研究

[目的]了解福建省耐多药结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因的突变特征。[方法]PCR扩增了55株结核分枝杆菌临床分离株，对包括81个碱基利福平耐药决定区（RRDR）在内的rpoB基因片段进行序列测定。[结果]10株敏感菌株rpoB基因未检测到突变。45株耐多药分离株中有40株rpoB基因存在21种不同类型突变，其中17个点突变，2个插入突变，2个缺失。[结论]88．9％的耐多药菌株检测到rpoB基因的突变，最常见的突变部位分别是531、526和516位密码子，突变率分别是47．1％、19．6％和7．8％。     

云南省结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征分析

目的 分析云南省结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征。方法 应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）法对1株H37Rv结核分枝杆菌标准株及102株结核分枝杆菌临床分离株中包含"利福平耐药决定区"在内的rpoB基因片段进行扩增,并将扩增产物进行直接基因测序,测序结果用MEGA 5软件进行分析。结果 利福平耐药基因型与表型的符合率为92.00%（69/75）,突变类型11种,涉及氨基酸11种,均为碱基的点突变,单位点突变占92.96%,联合突变占7.04%,突变率最高的位点依次是rpoB531（43.66%）、rpoB526（26.76%）、rpoB516（9.86%）,前3个位点的突变占总突变的80.28%。初复治患者临床分离株rpoB耐药突变位点构成差异无统计学意义（（口恶）2=7.653,P=0.354）;耐多药结核与单耐利福平临床分离株rpoB突变位点构成差异有统计学意义（（口恶）2=16.917,P=0.010）。结论 对rpoB的突变的检测在云南省可作为利福平耐药筛查的重要指标。rpoB基因突变可能不受是否使用过利福平和使用时间长短的影响,但是异烟肼可能会影响结核分枝杆菌rpoB基因突变的分子机制。     

煤工尘肺肺结核患者结核分枝杆菌L型耐药基因rpoB突变特点

目的 分析淮南矿区煤工尘肺结核患者感染的结核分枝杆菌L型利福平耐药基因rpoB突变特点.方法 收集尘肺并发肺结核患者的痰标本97份,对检出的结核分枝杆菌L型临床分离株52株进行分析,抽提临床分离株DNA和H37Rv标准菌株DNA,PCR法扩增rpoB基因,并应用全自动DNA测序仪对rpoB基因的突变集中区域进行测序分析.结果 52株临床分离株中,47株耐药株中rpoB基因突变率为91.49%(43/47),主要集中在531位点(48.94%,23/47)和526位点(25.25%,12/47)碱基置换突变,其次是511、516位点,1株535位点突变,其中41株单位点突变(87.23%,41/47),2株双位点突变(4.26%,2/47);5株敏感株未见rpoB基因单链构象异常.结论 煤工尘肺结核患者感染的结核分枝杆菌L型利福平耐药的分子基础是高度保守的rpoB基因突变,其突变位点呈多样性.     

47株结核分枝杆菌利福平耐药决定区基因突变特征的研究

目的了解吉林省结核分枝杆菌的利福平耐药决定区(RRDR)基因突变特征。方法结核分枝杆菌(MTB)分离自2008-2009年吉林省临床肺结核病人的痰液标本,培养方法为改良酸性罗氏(L-J)培养基。分离出的抗酸杆菌经对硝基苯甲酸(PNB)培养基初步鉴定后选出结核分枝杆菌复合群并应用比例法进行药敏试验(DST)。根据DST结果,选择22株利福平耐药株、22株利福平敏感株以及3株临界值标本进行聚合酶链式反应(PCR)扩增rpoB中包含RRDR在内的部分基因,阳性DNA片段通过基因测序以及Bioedit软件分析方法比对基因突变情况。结果 22株利福平耐药株中,16株同时对异烟肼耐药;22株利福平敏感株中,1株异烟肼耐药。利福平耐药菌株中,95%(21/22)的菌株在利福平耐药决定区RRDR发生了基因突变,其中第531位密码子突变频率占50%,第526位占27%,第533位占9%,第516位及513位均为4.5%;22株利福平敏感株中,RRDR区全部无基因突变发生;3株临界值标本中,1株在第531位密码子发生了基因突变,1株在533位发生基因突变,最后1株无突变。结论 RRDR区点突变的发生与利福平耐药高度一致;异烟肼耐药与利福平耐药高度相关。     

苏州市耐利福平结核分枝杆菌rpoB基因突变特点的研究

目的 了解苏州市利福平( rifampin,RFP)耐药结核分枝杆菌rpoB基因突变特点,以期为苏州市RFP耐药结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis,MTB)临床快速诊断提供有价值的分子标记靶点.方法 通过裂解MTB抽提基因组DNA,采用PCR扩增和DNA测序方法,分析苏州市结核病患者痰培养阳性并经药敏试验诊断为RFP耐药MTB的rpoB基因RFP耐药决定区(rifampin resistance-determining region,RRDR)和CⅡ区变异谱与变异率.将主要突变形式RRDR-531 (TCG→TTG)与传统药敏实验进行诊断学试验,评价此类型突变作为RFP耐药菌株分子标记靶点的临床应用价值.结果 42株RFP耐药MTB的rpoB基因总突变率为90.5％ (38/42),在所检测到的突变中,以RRDR-531 (TCG→TTG)为主要形式(61.9％).以此类型的位点突变作为RFP耐药菌株诊断的分子标记,与传统药敏试验比较进行配对x2检验,结果表明,与敏感菌株相比,RRDR-531(TCG→TTG)突变在RFP耐药菌株中差异有统计学意义(x2=12.51,P＜0.01).结论 rpoB基因RRDR-531(TCG→TTG)突变是苏州市MTB产生RFP耐药性的主要分子机制,其作为RFP耐药MTB诊断的分子标记靶点具有较好的临床应用价值.     

rpoB Gene mutations in rifampin-resistant Mycobacterium tuberculosis identified by polymerase chain reaction single-stranded conformational polymorphism.

The use of polymerase chain reaction-single-stranded conformational polymorphism (PCR-SSCP) to study rpoB gene mutations in rifampin-resistant (RIFr) Mycobacterium tuberculosis has yielded contradictory results. To determine the sensitivity of this method, we analyzed 35 RIFr strains and 11 rifampin-susceptible (RIFs) strains, using the DNA sequencing of the core region of rpoB for comparison. Of the RIFr, 24 had a PCR-SSCP pattern identical to that of H37Rv; the other 11 had four different patterns. The 11 RIFs had PCR-SSCP patterns identical to that of H37Rv. The sensitivity of the assay was 31.4%; its specificity was 100%. We observed a strong correlation between the degree of resistance and the type of mutation.     

焦磷酸测序技术在利福平rpoB基因突变检测中的应用评价

目的 应用焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,并探讨其在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用价值.方法 利用焦磷酸测序技术,测定150株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因81个碱基的利福平抗药性决定区(RRDR),分析rpoB基因突变特点,并与绝对浓度法和MIC法药敏结果进行比较.结果 150株结核分枝杆菌中66株耐药84株敏感,54株为耐多药菌株,rpoB基因突变涉及6个密码子12种突变基因型,最常见的突变位点及突变形式分别为531位TCG突变为TYG,占60.6%,526位CAC突变为TAC、GAC,占22.7%.耐药性检测结果表明,焦磷酸检测法与绝对浓度法二者的符合率为92.7%,与MIC法的符合率为97.8%.结论 焦磷酸测序检测技术不仅是一种快速、准确、高通量的利福平分子药敏检测方法,同时也是结核分枝杆菌耐药性研究的有用工具.     

用DNA芯片检测结核分枝杆菌耐利福平基因突变的初步研究

目的研制一种新型DNA芯片，用于快速检测结核分枝杆菌耐利福平rpoB基因突变。方法根据结核分枝杆菌rpoB基因序列设计探针并制作DNA芯片，PCR掺入法荧光标记根据结核分枝杆菌rpoB基因突变热点的目的片断，与DNA芯片杂交，同时以DNA测序法为对照。结果18株结核分枝杆菌临床分离株中，1株敏感株DNA芯片杂交结果与标准株完全相同；17株耐RFP临床分离株中有17株检测到rpoB基因突变，其中14株单位点突变，1株511和516位双位点突变，与测序结果完全一致。另有两株为517和518、526和517位双位点突变，因为芯片上未点517位突变的探针，所以只检测到518和526位的突变，该突变与测序结果完全一致、结论用DNA芯片可快速、特异地检测出大多数结核分枝杆菌耐利福平分离株的rpoB基因突变，可用于临床耐药性的检测，指导临床用药。     

rpoB gene sequencing and spoligotyping of multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates from India

Multi drug-resistant Mycobacterium tuberculosis (MDR TB) has been well studied in outbreaks in settings of low endemicity in developed countries. However, the characteristics of MDR TB in the community with high endemicity such as India have not been well investigated. Mutations in the 81-bp rifampicin resistance-determining region of the rpoB gene were analyzed by DNA sequencing of 187 M. tuberculosis clinical isolates (149 resistant and 38 sensitive) from different parts of India. 146-Point mutations and two insertions were found in 146 of 149 resistant isolates in seven codons. The most common mutations were in codons 531 (59%), 526 (22%), and 516 (11.5%). Mutations were not found in three (2%) of the resistant isolates. N-terminal sequencing in these isolates showed no mutation at codon V176. None of the drug-susceptible isolates showed any mutation in the 437-bp rpoB gene segment sequenced. Genotypic analysis revealed a total of 80 different spoligotypes. A unique pattern was found in 65 (43.6%) isolates, whereas 84 (56.4%) were in 15 clusters. Comparison with an international spoligotype database showed ST26, Delhi type (18.1%), ST1, Beijing type (9.4%), and ST11 (5.4%), as the most common. The majority of isolates in the Beijing genotype (13/14) were associated with mutation 531TTG and similar drug-resistance patterns while other major clusters showed that the nature and frequency of occurrence of mutations in the rpoB gene were independent of spoligopatterns.