三氧化二砷对肝癌细胞表达PTTG1和VEGF的影响及其意义

目的 观察三氧化二砷(As2O3)对人肝癌细胞株BEL-7402和SMMC-7721的作用及其可能机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测As2O3对两种细胞的生长活性;用流式细胞仪测定经不同浓度As2O3溶液处理后的两种细胞的周期变化,并用Annexin V-FITC与PI双染法检测细胞凋亡;用实时逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测As2O3对两种细胞垂体肿瘤转化基因1(PTTG1)和血管内皮生长因子(VEGF)mRNA表达的影响;用蛋白免疫印迹法(western-blotting)检测As2O3对两种细胞PTTG1和VEGF蛋白表达的影响.结果 As2O3可显著抑制BEL-7402和SMMC-7721细胞的生长,并呈量效关系(r=0.973,P<0.01;r=0.985,P<0.01),半数抑制浓度(IC50)分别为4.38 μmol/L和5.16 μmol/L.BEL-7402和SMMC-7721经As2O3处理后均发生显著凋亡(P<0.01).As2O3能显著下调两种细胞PTTG1和VEGF mRNA及蛋白的表达(P<0.01),并使细胞周期阻滞在G2/M期.结论 As2O3可有效抑制人肝癌细胞的生长增殖,其机制可能与诱导细胞凋亡、阻滞细胞周期及下调PTTG1和VEGF的表达有关.     

三氧化二砷对肝癌细胞侵袭转移的影响及机制

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)抗肝癌侵袭转移的机制.方法 体外培养人肝癌细胞株SMMC-7721,将0、1.0、2.0 μmol/L浓度的As2O3作用于SMMC-7721细胞,采用过河实验检测肿瘤细胞体外运动;MTT法观察细胞黏附能力;Transwell体外侵袭转移模型检测细胞迁徙、侵袭能力;并用PCR法检测乙酰肝素酶(HPA)mRNA表达.结果 0、1.0、2.0 μmol/L As2O3作用SMMC-7721细胞后,表现为过河时间延长,细胞黏附抑制率明显上升,过膜细胞数减少(P＜0.01),HPA基因表达量降低(P均＜0.01);且呈剂量依赖性.结论 As2O3可明显抑制人肝癌细胞SMMC-7721细胞黏附、迁徙和侵袭能力,下调HPA mRNA表达,此可能为其抗肿瘤侵袭转移作用的机制之一.     

XPD对SMMC-7721肝癌细胞中DNp73和GADD45β的调控及意义

目的:观察人剪切修复基因人类着色性干皮病D组基因(xeroderma pigmentosum group D,XPD)转染至人肝癌细胞株SMMC-7721细胞后XPD、DNp73和GADD45β基因的表达变化以及对肝癌细胞生长的影响.方法:实验分4组:重组质粒SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD(XPD组)、空载质粒SMMC-7721-pEGFP-N2组(N2组),脂质体组和SMMC-7721细胞空白对照组.应用Lipofectamine2000脂质体瞬时转染,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹(Western blot)法检测转XPD基因后,人肝癌细胞株SMMC-7721细胞中DNp73以及GADD45β的mRNA和蛋白质的表达量变化,并用四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖的活力,流式细胞仪检测细胞凋亡的变化.结果:荧光显微镜下,XPD组和N2组细胞中观察到绿色荧光蛋白表达,说明转染成功;RT-PCR检测显示:XPD组中DNp73 mRNA相对表达量较其他3组显著下调,XPD和GADD45βmRNA相对表达量较其他3组明显上调(均P<0.01);Western blot检测显示:XPD、DNp73以及GADD45β蛋白相对表达量在各组间的差异与其mRNA各组间差异一致;MTT检测示:SMMC-7721细胞空白对照组、脂质体组、N2组、XPD组的吸光度(A)值分别为0.633±0.012,0.623±0.009,0.628±0.016,0.384±0.011,XPD组低于其他3组,差异均有统计学意义(均P<0.01),表明转染XPD后SMMC-7721细胞的增殖能力减弱.流式细胞仪检测SMMC-7721肝癌细胞凋亡:转染XPD的SMMC-7721细胞凋亡显著,凋亡率达56.53%,而其他3组均未见明显凋亡.结论:XPD基因在肝癌的发生发展中起抑制作用,癌基因DNp73的表达随XPD表达增加而降低,抑癌基因GADD45β则随XPD表达增加而增加,提示两者可能在XPD抑制肝癌细胞的生长机制中起重要作用.     

survivin反义寡核苷酸对SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的 观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对人肝癌细胞株SMMC-7721增殖和凋亡的影响.方法 人工合成survivin基因ASODN和正义ODN(SODN),并行硫代磷酸化修饰,通过脂质体途径转染SMMC-7721;分别用RT-PCR和Western blot检测survivin mRNA和蛋白表达;用MTT法检测ASODN对SMMC-7721增殖的影响;流式细胞仪检测细胞周期变化及细胞凋亡率;倒置显微镜观察细胞形态变化.结果 SMMC-7721可强表达survivin mRNA和蛋白;ASODN呈浓度依赖性抑制survivin mRNA和蛋白表达及SMMC-7721增殖,诱导细胞凋亡,使细胞阻滞于G2/M期.SODN对survivin mRNA和蛋白及SMMC-7721的增殖、细胞周期无明显抑制作用.结论 脂质体介导转染survivin ASODN可抑制细胞增殖、使细胞阻滞于G2/M期,从而促进细胞凋亡.     

苦参碱诱导人前列腺癌pc-3m细胞凋亡及对骨桥蛋白表达的影响

目的 探讨苦参碱治疗前列腺癌的可行性及机制.方法 将一定浓度梯度的苦参碱与人前列腺癌细胞株pc-3m孵育后,采用MTT法及流式细胞仪检测细胞增殖与凋亡变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测pc-3m中骨桥蛋白基因(OPN mRNA)表达水平.结果 苦参碱作用后pc-3m生长明显受抑,且呈时间-浓度依赖性;在流式细胞仪上可见凋亡率增加;pc-3m细胞中OPN mRNA表达阳性,OPN mRNA表达水平明显下调.结论 苦参碱体外能有效抑制pc-3m生长,其机制可能与诱导细胞凋亡、下调OPN mRNA表达有关.     

NRF2/PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究

目的探讨NRF2PI3K通路介导肝癌细胞SMMC-7721出现索拉非尼耐药的机制研究。方法建立肝癌细胞系SMMC-7721耐药细胞株SMMC-7721-SR,构建NRF2-siRNA转染肝癌细胞,并给与10μmol/L索拉非尼处理48 h。采用CCK-8法检测细胞活力,采用流式细胞仪检测细胞凋亡,Western blot检测NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白表达水平。Real-Time PCR检测NRF2、Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt基因表达水平。结果索拉非尼明显抑制肝癌细胞SMMC-7721的存活率,促进肝癌细胞SMMC-7721凋亡发生(P0.05)。索拉非尼对SMMC-7721细胞促凋亡作用明显强于SMMC-7721-SR细胞(P0.05)。SMMC-7721-SR细胞中NRF2蛋白水平及mRNA表达明显高于SMMC-7721细胞,Keap1、ARE、PI3K和Akt蛋白水平及mRNA表达明显增加(P0.05)。索拉非尼明显上调SMMC-7721细胞中NRF2蛋白水平及mRNA表达(P0.05)。抑制NRF2 mRNA表达并给予索拉非尼处理后,SMMC-7721-SR细胞存活率明显降低,凋亡率显著升高,Keap1、ARE、p-PI3K和p-Akt蛋白水平及mRNA表达明显降低(P0.05)。结论索拉非尼激活NRF2后诱导肝癌细胞SMMC-7721出现耐药;抑制NRF2可逆转肝癌细胞SMMC-7721对索拉非尼的耐药情况。     

去甲斑蝥素诱导人肝癌细胞凋亡的研究

目的探讨去甲斑蝥素（NCTD）对人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。方法用MTT方法检测人肝癌细胞SMMC-7721的生长抑制率。应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果 NCTD对人肝癌细胞SMMC-7721有生长抑制作用,随浓度升高、时间延长作用增强,呈剂量和时间效应关系。流式细胞仪示SMMC-7721细胞的S期细胞明显增多,G0/G1期细胞减少,凋亡率上升（P〈0.05或〈0.01）。结论 NCTD能显著抑制人肝癌SMMC-7721细胞的生长,其可能与抑制SMMC-7721细胞增殖,诱导细胞凋亡有关。     

熊果酸诱导人肝癌SMMC-7721细胞凋亡的研究

目的：观察熊果酸（UA）对人肝癌SMMC-7721细胞的增殖抑制及诱导其凋亡作用。方法：MTT法检测5、10、20、30、40、50μmol/L UA对SMMC-7721细胞生长的抑制作用,吖啶橙（AO）荧光染色、电镜和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果：UA能显著抑制SMMC-7721细胞的增殖,其作用呈剂量依赖性。35.2μmol/L UA作用SMMC-7721细胞48小时后AO染色,荧光显微镜下可见细胞出现体积缩小,核碎裂,染色质凝集等凋亡形态改变;电镜下SMMC-7721细胞出现明显的细胞凋亡的形态学改变,细胞核染色质出现边聚和中聚,细胞内部分线粒体肿胀;SMMC-7721细胞凋亡率为（67.91±5.24）%,与对照组（2.95±0.56）%比较差异有显著性意义（P〈0.05）。结论：UA通过诱导SMMC-7721细胞凋亡抑制其生长。     

三氧化二砷对肝癌细胞株凋亡的诱导作用

目的研究三氧化二砷(As2O2)对人、鼠肝癌细胞株凋亡的诱导作用.方法用不同质量浓度(0.25,0.5,1,2,3,4 mg/L)的三氧化二砷处理体外培养的鼠7919,人HePG2肝癌细胞株,以MTT比色法、AO/EB荧光染色法、DNA凝胶电泳和免疫组化染色法检测细胞凋亡.结果不同浓度的三氧化二砷均可抑制7919,HePG2细胞生长;AO/EB荧光染色在荧光显微镜下观察肝癌细胞呈典型的凋亡形态学改变;DNA凝胶电泳呈梯形条带为凋亡的特征;免疫组化染色加药组bcl-2表达下调,bax表达上调,对照组bcl-2表达上调,bax表达下调,两株细胞结果相同.结论As2O3对两株细胞均有诱导凋亡作用.这为临床应用As2O3治疗肝癌提供了一个可供参考的实验依据.     

三氧化二砷对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移及侵袭能力的影响

目的 探讨三氧化二砷(As2O3)对人肝癌SMMC-7721细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响及其分子机制.方法 利用MTS/PMS法检测As2O3对SMMC-7721细胞增殖的影响;划痕愈合和侵袭实验检测As2O3对SMMC-7721细胞迁移与侵袭能力的影响;实时定量PCR、Western印迹检测As2O3作用SMMC-7721细胞后MMP-9的表达.结果 2.0 μmol/L的As2O3对肿瘤细胞增殖有抑制作用;划痕实验结果显示,2.0μmol/LAs2O3处理SMMC-7721细胞12和24 h后,较未处理组划痕距离明显增加(P＜0.05),表明As2O3可抑制SMMC-7721细胞迁移.Transwell实验结果显示,2.0μmol/LAs2O3处理SMMC-7721细胞12h和24 h后,穿膜细胞数较未处理组明显减少(P＜0.05),表明As2O3可抑制SMMC-7721细胞侵袭能力.实时定量PCR和Western印迹结果显示,以2.0μmol/L As2O3处理SMMC-7721细胞后,MMP-9 mRNA和蛋白表达均明显下调(P＜0.05).结论 As2O3可通过抑制肿瘤细胞增殖、迁移及侵袭,抑制肿瘤的转移.     

肝癌组织、缺氧SMMC-7721细胞中HPA的表达变化及机制探讨

目的观察肝癌组织及缺氧培养的肝癌SMMC-7721细胞中乙酰肝素酶（HPA）和缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）的表达变化,并探讨其机制。方法免疫组化法检测50例肝癌组织、28例肝癌癌旁组织、14例正常肝组织中的HPA、HIF-1α蛋白。分别采用RT-PCR和Western blot法检测常氧和缺氧培养的人肝癌SMMC-7721细胞中HPA mRNA及其蛋白。结果 HPA、HIF-1α蛋白在肝癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁和正常肝组织（P〈0.05）;肝癌组织中HPA、HIF-1α蛋白的表达呈正相关（r=0.295,P〈0.05）。缺氧培养20 h后,SMMC-7721细胞HPA mRNA表达量（6.234±0.457）显著高于常氧培养细胞的表达量（2.910±0.137）,两者相比,P〈0.05;其HPA蛋白表达量（65 kD为1.437±0.067,50 kD为1.706±0.066）也显著高于常氧培养细胞的表达量（65 kD为1.192±0.060,50 kD为1.580±0.265）,两者相比,P〈0.05。结论肝癌组织中HPA蛋白阳性表达率升高,缺氧肝癌SMMC-7721细胞中HPAmRNA及蛋白表达量均升高,可能与缺氧导致的HIF-1α表达上调有关。     

牛蒡子苷元对肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响及机制探讨

目的观察牛蒡子苷元（ARG）对肝癌SMMC-7721细胞增殖、凋亡的影响,并探讨其机制。方法将不同浓度的ARG作用于SMMC-7721细胞,并设不加ARG对照组。MTT法测算细胞增殖抑制率、流式细胞术检测细胞周期及凋亡率,RT-PCR法检测细胞中的Bcl-2 mRNA。结果与对照组比较,随ARG浓度增加,SMMC-7721细胞增殖率逐渐降低（P均〈0.05）,G0/G1期细胞比例显著增加（P均〈0.05）,G2、M、S期细胞比例减少（P均〈0.05）;随ARG浓度增加、作用时间延长,SMMC-7721细胞凋亡率显著增加（P均〈0.05）,Bcl-2 mRNA表达量减少（P均〈0.05）。结论 ARG可明显抑制SMMC-7721细胞增殖并诱导其凋亡;可能与ARG下调细胞中Bcl-2基因的表达有关。     

辛二酰苯胺异羟肟酸对人肝癌SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响

目的：探讨辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞增殖和凋亡的影响。方法体外培养SMMC-7721细胞,给予不同浓度（2.5、5.0和7.5μmol/L）SAHA处理12~72h,采用噻唑蓝（MTT）比色法检测细胞增殖;加入SAHA（5.0和7.5μmol/L）处理SMMC-7721细胞24h或48h,使用流式细胞仪检测细胞凋亡和细胞周期的变化;采用RT-PCR法检测p53、bcl-2及bax基因mRNA水平;采用分光光度法检测Caspase-3蛋白表达。结果经5.0μmol/L SAHA处理细胞24h和48h时,细胞增殖率较对照下降了25.8%和28.8%,经7.5μmol/L SAHA处理细胞24h和48h时,下降了30.6%和48.6%;经5.0μmol/L或7.5μmol/L SAHA处理细胞24 h后,S期细胞从对照水平（24.33±0.17）%分别显著上升至（32.08±0.160）%和（33.96±0.20）%,（P=0.00）,早期凋亡率均由（0.19±0.04）%显著上升至（1.67±0.59）%和（8.92±0.94）%,（P=0.03）,而在48h后,S期细胞由（24.33±1.18）%分别显著上升至（32.25±0.53）%和（34.61±0.08）%,早期凋亡率由（0.19±0.04）%分别显著上升至（14.49±2.26）%和（26.23±0.55）%,（P=0.00）;SAHA能够上调p53、bax基因mRNA水平,下调bcl-2基因mRNA水平;经5.0μmol/L和7.5μmol/L SAHA处理细胞24h后,Caspase-3蛋白活性由对照水平（0.41±0.07）分别上升至（0.81±0.02）,（P=0.01）和（1.09±0.21）,（P=0.00）,而在处理48 h后,Caspase-3蛋白活性由对照水平分别上升至（1.43±0.23）和（2.01±0.01）,（P均=0.00）。结论 SAHA通过影响p53、bcl-2及bax凋亡相关基因水平及Caspase-3蛋白的活性,对人肝癌细胞株SMMC-7721细胞具有抑制增殖和促进凋亡的作用。     

RNA干扰p21对肝癌细胞SMMC-7721增殖的影响

目的:探讨RNA干扰技术沉默p21基因对肝癌细胞SMMC-7721增殖及恶性表型变化的影响.方法:通过慢病毒载体将p21小干扰RNA片段稳定转染入SMMC-7721细胞,通过RT-PCR,Western blot分别检MJp21 Mrna和蛋白表达变化,流式细胞仪检测7721-p2l RNAi组(感染p21 siRNA...     

腺病毒介导的环氧合酶-2反义RNA对肝癌细胞株生长的影响

目的探讨环氧合酶-2(COX-2)的表达与肝癌的关系,并构建表达人COX-2反义RNA的腺病毒载体,研究其对人肝癌细胞生长的抑制作用。方法采用免疫组织化学法探讨34例肝癌组织COX-2 的表达与肝癌病理特征的关系。采用基因重组法把人COX-2的cDNA片段反向克隆于穿梭质粒pHCMVSP1A,获得pAd-AShcox-2,通过脂质体与pJM17共转染293细胞,经同源重组产生编码COX-2反义RNA的重组腺病毒--Ad-AShcox-2。经聚合酶链反应法鉴定为阳性克隆者大量扩增、纯化,转染人肝癌细胞株SMMC-7402和SMMC-7721,采用免疫细胞化学、细胞集落形成率及流式细胞术检测其对肝癌细胞生长、凋亡及细胞周期分布的影响。结果34例肝癌组织中有28例COX-2高度表达,阳性率达82.4%; COX-2的表达水平与肝癌的病理分级有关,与甲胎蛋白、细胞类型、有无肝内转移无关。成功构建、扩增、纯化得到编码COX-2反义RNA的重组腺病毒Ad-AShcox-2,滴度达1.06×1012PFU/ml;Ad-AShcox- 2转染两种肝癌细胞株后,发现高度表达COX-2的SMMC-7402 COX-2表达水平明显降低,细胞凋亡率明显增加,出现G1期阻滞,与Ad-LacZ组及空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);而不表达COX- 2的SMMC-7721变化不明显。细胞集落形成实验显示SMMC-7402细胞集落形成率较低(2.7%±0.94%); 而SMMC-7721     

Expression of gap junction genes connexin32 and connexin43 mRNAs and proteins, and their role in hepatocarcinogenesis

AIM: To investigate the relationship between hepatocarcinogenesis and the expression of connexin32 (cx32), connexin43 (cx43) mRNAs and proteins in vitro.METHODS: Gap junction genes cx32 and cx43 mRNA in hepatocellular carcinoma cell lines HHCC, SMMC-7721 and normal liver cell line QZG were detected by in situ hybridization (ISH) with digoxin-labeled cx32, and cx43 cDNA probes. Expression of Cx32 and Cx43 proteins in the cell lines was revealed by indirect immuno-fluorescence and flow cytometry (FCM).RESULTS: Blue positive hybridization signals of cx32 and cx43 mRNAs detected by ISH with cx32 and cx43 cDNA probes respectively were located in cytoplasm of cells of HHCC, SMMC-7721 and QZG. No significant difference of either cx32 mRNA or cx43 mRNA was tested among HHCC, SMMC-7721 and QZG (P=2.673, HHCC vs QZG; P=1.375, SMMC-7721 vs QZG). FCM assay showed that the positive rates of Cx32 protein in HHCC, SMMC-7721 and QZG were 0.7%, 1.7% and 99.0%, and the positive rates of Cx43 protein in HHCC, SMMC-7721 and QZG were 7.3%, 26.5% and 99.1% respectively. Significant differences of both Cx32 and Cx43 protein expression existed between hepatocellular carcinoma cell lines and normal liver cell line (P=0.0069, HHCC vs QZG; P=0.0087, SMMC-7721 vs QZG). Moreover, the fluorescent intensities of Cx32 and Cx43 proteins in HHCC, SMMC-7721 were lower than that in QZG.CONCLUSIONS: Hepatocellular carcinoma cell lines HHCC and SMMC-7721 exhibited lower positive rates and fluorescent intensities of Cx32, Cx43 proteins compared with that of normal liver cell line QZG. It is suggested that lower expression of both Cx32 and Cx43 proteins in hepatocellular carcinoma cells could play pivotal roles in the hepatocarcinogenesis. Besides, genetic defects of cx32 and cx43 in post-translational processing should be considered.     

黄芩苷对肝癌细胞SMMC-7721 JAK-STAT信号通路STAT3的影响

目的:探讨黄芩苷对肝癌细胞SMMC-7721JAK-STAT信号通路STAT3的影响.方法:将肝癌细胞SMMC-7721分为4组:对照组、黄芩苷组、AG490组、黄芩苷+AG490组.应用RT-PCR法检测各组肝癌细胞SMMC-7721中STAT3mRNA表达,Westernblot法检测肝癌细胞SMMC-7721中STAT3、P-STAT3蛋白表达.结果:黄芩苷可以下调肝癌细胞SMMC-7721STAT3mRNA表达,与对照组比较明显下降(0.505±0.111vs0.697±0.145,P<0.05);并可以降低STAT3蛋白的表达量(0.879±0.012vs1.087±0.015,P<0.05);还可以抑制STAT3向活化形式P-STAT3转化,与对照组比较P-STAT3表达明显下降(0.983±0.085vs1.103±0.074,P<0.05),而与AG490联合应用后P-STAT3蛋白表达量较单用黄芩苷下降明显(0.756±0.103vs0.983±0.085,P<0.05).结论:黄芩苷能下调STAT3mRNA表达水平,降低STAT3蛋白表达,还可以抑制STAT3向活化形式P-STAT3转化,...     

骨桥蛋白促进人肝癌细胞株SMMC-7721恶性表型的实验研究

目的研究骨桥蛋白(OPN)对低侵袭性人肝癌细胞株SMMC-7721恶性表型的影响。方法pcDNA 3,1(-)/OPN重组质粒转染SMMC-7721细胞,以空质粒转染作对照,用RT- PCR反应、Western blot检测OPN表达水平,用ELISA检测细胞培养上清液OPN、MMP-2、-9、尿激酶纤溶酶原活化因子(uPA)水平,并用体外功能试验观察转染前后恶性表型的变化。结果重组质粒转染SMMC-7721后OPN表达明显升高,细胞培养上清液OPN为(3.02±0.12)ng/ml,对照组为(1.43±0.07)ng/ml,MMP-2重组质粒转染组为(43.04±3.06)ng/ml,对照组为(22.15±4.34)ng/ml、uPA重组质粒转染组水平明显高于空质粒转染组,分别为(4.78±0.70)ng/ml和(1.61±0.34)ng/ml,两组差异均有统计学意义,t值分别为19.89、6.81和7.03,P值均<0.01。MMP-9水平分别为(7.82±2.25)ng/ml和(7.70±1.92)ng/ml,两组差异无统计学意义。体外功能试验提示SMMC-7721转染OPN重组质粒后细胞黏附、运动和侵袭能力明显增强,细胞黏附率为75.33%±10.59%,对照组为57.34%±2.52%,t=2.86,P<0.05。运动试验透膜细胞数分别为(14.3±2.5)个和(6.3±1.5)个,t=4.70,P<0.05。侵袭试验透膜细胞数分别为(8.2±1.5)个和(4.1±1.3)个,t=4.11,P<0.05。而细胞增殖能力无明显改变。结论OPN可能是通过增加MMP-2、uPA分泌促进人肝癌细胞株SMMC-7721的恶性表型。