SHH修饰聚多巴胺涂层纤维蛋白支架对大鼠神经干细胞的影响

目的:构建音猬因子(SHH)修饰的聚多巴胺(PD)涂层纤维蛋白胶(FG),并探究该支架对大鼠神经干细胞(NSCs)的生长及分化的影响。方法:按FG材料表面涂层情况,将实验分为3组:FG表面未处理组(control)、FG表面进行多巴胺涂层组(PD)和FG经多巴胺处理后表面涂有SHH组(PD-SHH)。采用扫描电子显微镜分别观察支架微观结构,用ELISA测量PD-SHH组SHH。分离并培养大鼠神经干细胞,并将神经干细胞分别与该3种支架复合培养,免疫荧光及Western Blot检测各组细胞中胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、生长再生相关蛋白(GAP43)和髓鞘碱性蛋白(MBP)的表达。结果:ELISA结果显示PD-SHH缓释支架可以持续释放SHH达到19 d;扫描电子显微镜可见纤维蛋白胶经冷冻干燥后呈海绵型网状结构,多巴胺及SHH微粒粘附在网状结构上;免疫荧光及Western Blot结果显示:PD-SHH组细胞高表达GAP43和MBP等神经细胞相关蛋白而低表达GFAP(P<0.05)。结论:制备的聚多巴胺涂层纤维蛋白支架具有良好的SHH缓释效果,该复合支架对大鼠NSCs分化有明显的促进作用。     

氯倍他索对大鼠神经干细胞自发分化的影响

目的:研究氯倍他索(Clo)对神经干细胞自发分化的影响,为Clo治疗中枢性神经损伤提供医学理论基础。方法:利用无血清悬浮法分离培养及鉴定大鼠NSCs;选取第三代NSCs,以含10%胎牛血清完全培养基贴壁诱导分化7 d,培养基中各加入同体积二甲基亚砜、2. 5、5μmol/L的Clo;免疫荧光染色和Western Blot方法检测NSCs分化后轴突膜蛋白(GAP-43)、酸性胶质蛋白(GFAP)、髓磷脂碱性蛋白(MBP)表达情况,进一步探讨Clo的作用机制。结果:分离培养的NSCs高表达Nestin; Clo作用组表达GAP-43和MBP较对照组明显提高(P 0. 05),GFAP表达水平低于对照组(P 0. 05),Clo作用组表达音猬因子(SHH)和锌指蛋白(Gli 1)均高于对照组(P 0.05)。结论:Clo可在体外通过SHH信号通路促进NSCs向神经元细胞和少突胶质细胞分化,与此同时Clo可抑制NSCs向星形胶质细胞分化。     

纤维蛋白支架促进神经干细胞向神经元分化并抑制星形胶质细胞增生

目的探讨纤维蛋白支架对神经干细胞和星形胶质细胞分化及增殖的影响。方法分别培养胚胎大鼠脊髓来源的神经干细胞和新生鼠脊髓神经胶质细胞,接种于纤维蛋白支架上,同时用多聚赖氨酸修饰的玻片作为对照。于体外培养不同时间后,用神经丝蛋白(NF200)对神经细胞进行免疫荧光染色,测量各复孔(n=4)内NF阳性细胞的突起长度,计算其平均值;用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)对胶质细胞进行染色,各复孔(n=4)内统计5个不同视野的胶质细胞总数和GFAP阳性细胞数,计算GFAP阳性细胞相对数量的平均值。比较在纤维蛋白支架和玻片上神经干细胞分化、神经纤维延伸及神经胶质细胞增殖的差异。同时用免疫印迹技术对荧光染色结果进行验证。上述实验各重复3次。结果纤维蛋白支架组的NF阳性纤维明显长于对照组,GFAP阳性星形胶质细胞相对数量明显少于对照组,GFAP的表达水平明显低于对照组。结论纤维蛋白支架可促进神经干细胞向神经细胞分化,并有利于神经纤维的延伸而抑制星形胶质细胞的增殖和成熟。     

TG2基因修饰的鼻粘膜间充质干细胞向神经样细胞分化的研究

目的:研究重组transglutaminase 2(TG2)腺病毒转染对鼻粘膜骨髓间充质干细胞(EMSCs)向神经样细胞分化影响。方法:利用贴壁筛选法分离培养和扩增EMSCs,通过免疫荧光方法分析EMSCs的纯度,采用免疫荧光和免疫印迹方法测定转染效率。实验分组:重组TG2腺病毒转染EMSCs(ad EMSCs)组、重组GFP腺病毒转染EMSCs组(GFP-EMSCs)和空白对照组(control),诱导细胞向神经样细胞分化,倒置显微镜观察分化过程中细胞形态的变化。免疫荧光和免疫印迹方法检测诱导后EMSCs的轴突膜蛋白(GAP-43),微管相关蛋白(MAP2)和髓磷脂碱性蛋白(MBP)的表达情况。向大鼠脊髓内注射ad EMSCs,2周后取脊髓。结果:实验数据表明转染TG2腺病毒的EMSCs可稳定表达TG2。诱导7 d后,ad EMSCs组细胞呈现双极和多极的典型神经样细胞形态,并且GAP-43,MAP2和MBP的表达水平较对照组高。移植入体内2周的ad EMSCs存活良好且部分细胞表达GAP-43。结论:TG2基因修饰有利于EMSCs在体外向神经样细胞分化,并且具有良好的可移植性。     

音猬因子对神经干细胞增殖与分化的影响

目的 探讨音猬因子(SHH)对神经干细胞(NSCs)增殖与分化的影响. 方法从大鼠胚胎端脑皮质及海马分离培养的NSCs分为SHH组、RA组和PBS组.分别用SHH、维甲酸(RA)及PBS条件培养液处理后,通过免疫细胞化学等方法检测NSCs的增殖及分化情况.结果体外培养的NSCs能快速增殖并形成神经球,其中的细胞均表达NSCs特异性标志物nestin.BrdU作用于NSCs 3 h后,SHH组的BrdU阳性率明显高于RA组和PBS组,而RA组和PBS组之间无显著差异.当NSCs在分化条件培养液中培养7d后,SHH组和RA组中的βⅢ-tubulin阳性率及Rip阳性率显著高于PBS组,SHH组又显著高于RA组和PBS组.结论 SHH可以促进NSCs增殖及其向神经元和少突胶质细胞的分化.     

骨髓基质细胞促进人胚神经干细胞向神经元的分化

目的:探讨骨髓基质细胞(BMSCs)对人胚神经干细胞(NSCs)分化的影响。方法:采用机械法分离人胚NSCs,成球法进行传代培养,采用免疫荧光染色检测神经上皮干细胞蛋白(Nestin)的表达鉴定NSCs。按培养方式不同,分为NSCs自然分化组、BMSCs和NSCs直接接触共培养组及Transwell共培养组,采用免疫细胞荧光法及免疫印迹法检测各组神经元和星形胶质细胞标志物的表达。结果:在直接接触共培养组和transwell共培养组中,免疫荧光染色显示神经元标志物NSE阳性细胞率明显高于自然分化组,而星形胶质细胞标志物GFAP阳性细胞率低于自然分化组。免疫印迹检测显示Transwell共培养组中NSE表达量显著高于自然分化组,而GFAP表达量低于自然分化组。结论:BMSCs具有促进NSCs向神经元分化的作用。     

Wnt/β-Catenin对低氧诱导绿色荧光蛋白小鼠神经干细胞体外增殖的影响

目的:体外观察低氧对绿色荧光蛋白(GFP)小鼠神经干细胞(NSCs)增殖的影响,并探讨Wnt/β-catenin通路在此过程中的作用。方法:经低氧(3±2)%O_2和常氧205O_2培养GFP小鼠海马组织NSCs,通过NSCs克隆形成率检测、BrdU掺入法和四唑盐比色法(MTT)法检测细胞增殖情况;脂质体介导法将NSCs转染β-catenin,通过免疫细胞化学染色、Western印迹法检测β-catenin表达情况,MTT法检测转染β-catenin后低氧对NSCs增殖的影响。结果:低氧组细胞克隆球形成率、BrdU阳性细胞数量、NSCs增殖活性、NSCs内β-catenin表达均显著高于常氧组;转染β- catenin的NSCs经低氧培养后,NSCs增殖活性明显高于未转染组。结论:体外低氧培养能促进NSCs增殖和NSCs内β-catenin表达;增加NSCs中β-catenin表达能促进低氧培养下NSCs的增殖。表明Wnt/β-catenin通路具有促进低氧诱导NSCs增殖的作用。     

Olig2过表达对神经干细胞向少突胶质细胞分化的影响

目的:构建大鼠olig2真核表达载体,观察其过表达对大鼠神经干细胞(NSCs)向少突胶质细胞分化的影响.方法:采用 RT-PCR,以新生大鼠脊髓RNA为模板,扩增olig2基因,定向克隆到pEGFP-N3载体中.用电穿孔方法转染pEGFP-N3-olig2表达载体至NSCs中.用RT-PCR鉴定olig2的表达,用免疫荧光显色鉴定NSCs向少突胶质细胞的分化情况.结果:成功构建了pEGFP-N3-olig2真核表达载体;olig2在重组质粒转染的NSCs中能够高效表达;重组质粒转染的NSCs在体外诱导分化后,能够较空质粒转染的NSCs产生更多的受体相互作用蛋白(RIP)阳性细胞.结论:olig2过表达能够促进大鼠NSCs向少突胶质细胞方向分化.     

大面积脑梗塞患者自体神经干细胞的培养与鉴定

目的:通过改进原代培养方法,从大面积脑梗塞患者废弃脑组织中培养、传代和鉴定自体神经干细胞(NSCs),并进行诱导分化研究。方法:收集2例右侧大面积脑梗塞患者手术中废弃脑组织各1 g以上,按改良方法进行原代培养并传代,通过细胞免疫荧光染色检测NSCs标志物巢蛋白(nestin)的表达。传代培养至7代时选取部分细胞进行诱导分化研究,通过细胞免疫荧光染色检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和微管蛋白(β-tubulin)的表达来评估NSCs分化情况。结果:培养3～7 d后,2例患者废弃脑组织中均可见干细胞球生长,nestin检测呈阳性表达。经传代培养至第10代后,仍可维持其神经干细胞特征,选取7代贴壁细胞经β-Tubulin及GFAP免疫荧光检测可见阳性表达。结论:成功从大面积脑梗塞患者前颞叶(邻近于海马区)废弃脑组织中分离培养获得自体NSCs,并可向神经元样细胞及星形胶质样细胞分化。     

SHH缓释纤维蛋白支架移植促大鼠脊髓损伤的修复

目的:研究应用可缓释音猬因子(sonic hedgehog,SHH)的纤维蛋白胶(fibrin glue,FG)支架促大鼠脊髓完全横断损伤的修复效果。方法:(1)制作体外缓释SHH的纤维蛋白胶支架模型,探究缓释效果。(2)选用健康的SD大鼠60只,制作大鼠脊髓完全横断模型,随机分为三组:单纯脊髓横断组(SCI),纤维蛋白胶组(FG),音猬因子-支架移植组(F-SHH)。术后每周记录大鼠双后肢功能活动(BBB评分)。术后12周取出脊髓组织,采用免疫组织化学染色和免疫蛋白印迹检测,观察脊髓损伤的近远端神经元存活情况及神经丝蛋白(neurofilament200,NF200),生长再生相关蛋白(growth associated protein-43,GAP43),胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)表达情况。结果:(1)载SHH的纤维蛋白胶具有良好的缓释SHH的效果;(2)F-SHH组BBB评分从术后到第十二周较FG、SCI组上升明显(P0.05);(3)免疫组化结果显示:F-SHH组脊髓横断端有一些神经元存活且排列规则,许多神经纤维未完全溃变。SCI组细胞凋亡明显,纤维溃变严重,退变空泡大,FG组较SCI组稍好;(4)Western Blot结果显示:F-SHH组NF200,GAP43相对含量高于FG、SCI组(P0.05),而GFAP相对含量低于FG、SCI组(P0.05)。结论:SHH缓释纤维蛋白支架缓释效果良好,对大鼠脊髓完全横断损伤的修复有明显的促进作用,SHH对于脊髓损伤的修复机理值得进一步研究。     

成年小鼠神经干细胞体外培养、鉴定及分化

目的:建立一种简便易行的从成年小鼠脑组织分离、培养和鉴定神经干细胞(neural stem cells,NSCs)的方法,为相关研究提供新的研究手段。方法:采用机械分离和酶消化结合方法分离成年昆明种小鼠的脑组织,用无血清培养基悬浮培养;倒置相差显微镜观察细胞形态;MTT法(四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法)观察NSCs的自我增殖能力;免疫荧光细胞化学技术检测NSCs标志物巢蛋白(Nestin)的表达;多聚赖氨酸铺板和撤除培养基中FGF和EGF的条件下,给予5%血清和1μm维甲酸诱导NSCs分化,免疫荧光细胞化学技术检测GFAP(标记胶质细胞),β-tubulin Ⅲ(标记神经元)蛋白的表达来测定NSCs的分化能力。结果:从成年小鼠脑组织分离的细胞,在无血清培养液中可形成神经球,并可在体外扩增和连续传代,免疫荧光细胞化学表明神经球Nestin阳性表达,在给予血清和维甲酸条件下神经球可表达GFAP和β-tubulin Ⅲ。结论:本研究成功建立了体外培养成年小鼠脑组织分离和培养NSCs的方法,培养的NSCs具有自我更新、增殖及多向分化潜能。此方法是一个稳定、简便易行的方法,可广泛用于神经干细胞相关的基础和应用研究。     

小鼠脑皮质神经干细胞体外培养及miRNAs影响其分化能力

目的系统建立小鼠脑皮质神经干细胞(NSCs)体外培养的技术平台,并探索一组microRNA对NSCs分化能力的影响。方法胎鼠(E14)脑皮质分离NSCs进行体外培养;免疫荧光法检测NSCs向神经元和星型胶质细胞的自然分化;Real-time定量PCR筛选一组分化前后表达水平有显著性差异的microRNA;应用新一代脂质体高效转染NSCs,将该组microRNA或其抑制物导入NSCs;Western blot检测导入的RNA序列对NSCs分化能力的影响。结果基于小鼠NSCs体外培养模型,筛选出一组NSCs分化前后表达水平存在显著性差异的microRNA(miR-124,137,128)。Western blot结果显示miR-124的反义链能够明显下调β-tubulinⅢ的表达(P<0.01),过表达miR-137和miR-128后β-tubulinⅢ的表达量有所升高。结论脂质体转染技术能够将miRNAs高效导入NSCs中;microRNA-124,137,128能够影响NSCs的分化。     

壳聚糖作载体的NSCs移植对大鼠脑损伤区胶质增生的抑制作用

目的：探讨壳聚糖作载体的神经干细胞（NSCs）移植对大鼠创伤性脑损伤（TBI）区胶质增生的抑制作用。方法：用低温冷冻干燥法制备壳聚糖多孔支架。将从鼠胚前脑中分离的NSCs进行扩增传代。Feeney法制备SD大鼠TBI模型12只，随机均分为2组：损伤对照组和NSCs＋支架移植组2组。术后3个月取脑切片行Nissl染色、GFAP免疫荧光染色，观察两组损伤区和海马变化以及损伤区周边星形胶质细胞增生情况。结果：Nissl染色见损伤对照组创伤区形成烧杯状空洞，损伤侧海马萎缩变形，而NSCs＋支架移植组创伤区有移植物填充且已与宿主整合，损伤侧海马萎缩不明显。GFAP免疫荧光染色，损伤对照组创伤区周边可见到大量GFAP阳性细胞，荧光强度较强，疤痕较宽，而NSCs＋支架移植组创伤区周边仅见到少量的GFAP阳性细胞，荧光强度弱，疤痕较窄。t检验结果显示两组损伤区周围GFAP免疫荧光的灰度值、胶质疤痕宽度有显著性差异（P〈0．01）。结论：大鼠TBI后行壳聚糖作载体的NSCs移植治疗可以抑制脑损伤区胶质增生，从而促进脑损伤的修复。     

脑源性神经营养因子基因修饰的胚胎大鼠皮质神经干细胞及其在体外的分化

目的 探讨脑源性神经营养因子（BDNF）基因修饰大鼠脑皮质神经干细胞（NSCs）后BDNF的表达,并观察其对NSCs体外诱导分化的影响。 方法 体外分离、培养大鼠胚胎脑皮质神经干细胞并鉴定;构建BDNF基因重组质粒,非脂质体法转染NSCs,实验分为pcDNA3-1- BDNF组、pcDNA3-1组和未转染NSCs组。免疫细胞化学技术和RT-PCR检测转染后BDNF蛋白和mRNA的表达;在含5％胎牛血清的分化培养基中诱导分化,βIII微管蛋白、神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP） 和突触素( SYP)免疫细胞化学染色对分化细胞进行鉴定,并观察pcDNA3-1-BDNF转染NSCs分化过程中SYP的表达变化。 结果 体外培养获得巢蛋白（nestin）阳性的NSCs。成功构建BDNF基因重组质粒,免疫细胞化学和RT-PCR检测均显示,与pcDNA3-1组和NSCs组比较,pcDNA3-1-BDNF组NSCs的BDNF表达明显增强（P<0.05）。pcDNA3-1组和NSCs组比较,无显著性差异（P＞0.05）。分化后第4天,各组细胞均可分化为Βiii-微管蛋白阳性和GFAP阳性细胞,pcDNA3-1-BDNF组可见少量SYP阳性表达细胞。分化后第7天,与pcDNA3-1组和NSCs组比较,pcDNA3-1-BDNF组NSCs分化为βIII微管蛋白阳性神经元的比例明显增高,有显著性差异（P<0.05）,SYP阳性细胞数增多,表达增强。 结论 BDNF转染NSCs具有体外分泌BDNF的能力,能够促进NSCs定向分化为神经元,SYP表达增强,可能在促进神经元之间的突触发生中发挥作用。     

靶向大鼠β-catenin基因的shRNA真核表达质粒的构建与筛选

目的 构建靶向β-连环蛋白(β-catenin)基因的shRNA的真核表达质粒,并筛选出沉默β-catenin基因效果最明显的shRNA表达质粒.方法 设计3对针对β-catenin 基因不同位点的shRNA片段,构建携带此shRNA片段的真核表达质粒(shRNA1～3)并行测序分析,电穿孔转染神经干细胞(neural stem cells NSCs),测定转染率,并分别采用RT-PCR及Western 印迹检测β-catenin mRNA和蛋白表达情况,免疫组化方法检测shRNA对神经干细胞分化的影响.结果 构建靶向β-catenin基因的shRNA真核表达重组质粒shRNA1,2,3.经筛选,NSCs转染shRNA3后,β-catenin RNA水平和蛋白水平均明显低于阴性对照组和空白对照组(0.08±0.00 vs 0.75±0.01,0.74±0.02;0.12±0.10,vs 0.56±0.02,0.65±0.01,P均＜0.01;与空白组和阴性对照组相比,shRNA3组NSCs分化为GFAP阳性细胞的百分率明显增加,分化为NSE阳性细胞的百分率明显减少(P＜0.05).结论 β-catenin RNA3对神经干细胞的β-catenin表达具有明显抑制作用,可影响细胞的分化.为研究wnt/β-catenin信号途径在NSCs生长分化中的作用奠定基础.     

壳聚糖支架与神经干细胞生物相容性的研究

为探讨壳聚糖多孔支架与神经干细胞(NSCs)的生物相容性,应用冷冻干燥技术制备壳聚糖多孔支架,将神经干细胞克隆球接种于壳聚糖支架载体上,分为NSCs+支架组和NSCs+支架+NGF组。培养2周后冰冻切片,行Nissl染色及微管相关蛋白-2(MAP-2)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNP)免疫组化染色来检测NSCs的分化,并进行MAP-2阳性细胞计数、胞体面积、细胞周长的图像处理和统计分析。结果显示:壳聚糖支架孔隙率为90%,支架孔径为50～350μm。NSCs可以在壳聚糖支架上存活、迁移并分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。NSCs+支架+NGF组的MAP-2阳性细胞数明显多于NSCs+支架组,且胞体较大,突起较多且长。上述结果提示,壳聚糖支架与NSCs具有良好的生物相容性,外源性的NGF能够促进壳聚糖支架中的NSCs向神经元分化。     

神经调节蛋白-1与碱性成纤维细胞生长因子对大鼠神经干细胞增殖和分化的影响

目的:探讨神经调节蛋白-1(NRG-1)和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)对神经干细胞(NSCs)增殖和分化的影响.方法:从新生大鼠大脑组织分离NSCs,进行体外培养,分别用bFGF、 NRG-1和NRG-1加bFGF处理,观察各组神经球的形成情况;应用免疫细胞化学法鉴定NSCs及检测分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、 2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNP)的表达.结果:NRG+bFGF组和bFGF组形成的神经球数量和直径的差别不明显,但都明显多于和大于NRG组和对照组.免疫细胞化学显色结果显示,NRG+bFGF组、bFGF组中的神经球分化出的NSE、 GFAP、 CNP阳性细胞数量明显多于NRG组和对照组,尤其是NRG+bFGF组分化的NSE、CNP阳性细胞的突起较bFGF组更长和增多.结论:NRG-1与bFGF合用能促进NSCs的增殖和分化,促进分化的神经元、少突胶质细胞突起的生长.     

人诱导性多能干细胞向神经干细胞分化的方法探讨

目的:探讨人诱导性多能干细胞(iPS细胞)体外定向分化为神经干细胞(NSCs)的方法。方法:人iPS细胞悬浮培养4 d形成的拟胚体(EB)经维甲酸(RA)诱导4 d,诱导后的EB在无血清培养基中筛选并扩增培养。倒置显微镜下观察诱导后细胞的形态变化,RT-PCR检测iPS细胞多能性基因Nanog、Oct4和Sox2的表达,免疫荧光法检测NSCs特异性标志物Nestin、神经元标志物β-tubulinⅢ和神经胶质细胞标志物GFAP的表达。结果:(1)人iPS细胞在饲养层细胞上稳定传代,表达多能性基因Nanog、Oct4和Sox2,去除饲养层后悬浮培养能形成球形EB;(2)经RA诱导后的EB在无血清培养基中筛选培养第1 d贴壁生长,周围爬出细胞;第3 d,在高倍镜下可见中央聚集的细胞呈环形的rosette结构,rosette结构增多到第7 d达高峰。对照组未观察到rosette结构。随后大部分rosette细胞脱离瓶壁悬浮生长,形成神经球样克隆。免疫荧光显示神经球呈nestin阳性表达。贴壁培养的神经球能分化成β-tubulinШ和GFAP阳性细胞。结论:RA诱导结合无血清培养基筛选法能诱导iPS细胞高效分化为NSCs。     

髓鞘结合糖蛋白抑制神经干细胞向神经元分化和轴突生长

目的： 观察来源于胚胎大鼠海马神经细胞的特征;观察髓鞘结合糖蛋白(MAG)对神经干细胞的增殖、分化及神经元轴突生长的影响。方法: 从胚胎鼠的海马提取细胞进行体外培养,应用免疫荧光染色法检测神经干细胞(NSCs)标志蛋白nestin和doublecortin的表达。应用BrdU掺入法检测不同剂量的MAG-Fc对NSCs增殖的影响。免疫荧光染色法观察各种亚型神经细胞的比例并比较神经元样细胞的轴突长度。结果: 来自SD大鼠16 d 胚胎海马的细胞明显表现出神经干细胞的特征。神经干细胞分化7 d 后,对照组新生成的β-tubulin Ⅲ阳性细胞的比例为18.17%±2.79%,其轴突长度为(136.27±33.66)μm。MAG-Fc (200 μg/L)处理后,β-tubulin Ⅲ阳性细胞比例和轴突长度分别显著减少为10.05%±3.42% (P<0.01)和(84.87±24.94)μm(P<0.01)。增殖实验表明,不同浓度的MAG-Fc对神经干细胞的BrdU整合比率无明显影响(P>0.05)。结论: MAG-Fc对神经干细胞向神经元样细胞的分化及其轴突的生长均有抑制作用,但对神经干细胞的增殖无明显影响。     

鼠巨细胞病毒抑制神经干细胞分化及分化基因表达的体外研究

目的 研究鼠巨细胞病毒(MCMV)感染对体外培养神经干细胞(NSCs)分化及分化基因表达的影响,探讨CMV先天感染致神经损伤的机制.方法 体外分离培养和鉴定BALB/c胎鼠NSCs并检测其分化潜能,用感染复数(MOI)为5、1和0.1的MCMV Smith毒株感染NSCs并进行分化培养,倒置显微镜下观察细胞形态学改变,流式细胞术检测分化细胞比率,免疫荧光法观察NSCs及其分化细胞标记物Nestin、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)表达的变化,采用MCMV早期抗原(EA)示踪感染过程(MOI=1),real-time RT-PCR检测分化早期NSCs Wnt信号途径关键分化基因Wnt-3和Wnt-Ta mRNA水平的动态变化.结果 体外培养的NSCs呈球样生长,神经干细胞特异性标记Nestin表达阳性,并可进一步诱导分化为NF-200阳性的神经元和GFAP阳性的星形胶质细胞;分化培养后,感染组NSCs不能贴壁分化生长并逐渐出现肿胀,细胞Nestin表达下调缓慢并显著高于正常对照组,而GFAP和NSE表达显著低于正常对照组(P<0.05),可检测到MCMV EA的阳性表达;分化培养3-9 d,感染组Nestin阳性细胞比率显著高于正常对照组,GFAP和NSE阳性细胞比率显著低于正常对照组(P<0.05);感染组Wnt-3 mRNA水平在分化培养后第1～2天显著低于正常对照组(P<0.05),感染组Wnto-7a mRNA水平在第0.5～2天明显低于正常对照组(P<0.05);感染组和正常对照组的差异随病毒MOI的增加而更加明显.结论 MCMV感染可明显抑制NSCs向神经元和星形胶质细胞方向分化,导致分化细胞比率减少;下调或干扰NSCs wnt信号途径分化基因wnt-3和Wnt-7a的表达;抑制NSCs分化及其分化基因表达的效应与MOI大小存在一定量效依赖关系;MCMV可能通过抑制NSCs分化基因的表达来抑制其分化,这可能是CMV先天感染致脑发育异常的重要机制之一.