不同样本测序前处理方案对冠状病毒基因组高通量测序结果的影响

目的以基因组最大RNA病毒(冠状病毒)为代表,研究不同测序前样本处理模式对高通量测序获得病毒全基因组序列信息质量的影响。方法以细胞培养的人冠状病毒HCoV-OC43样本为代表,分为4种测序前样本处理模式,即:未处理组、核酸提取前DNase和RNase处理组、核酸提取后DNase处理组、核酸提取前DNase和RNase处理且核酸提取后DNase处理组。不同模式处理后的核酸分为两份,一份直接RNA测序(未扩增),另一份经序列非依赖的单引物扩增(SISPA)后DNA测序。结果尽管不同处理方式下获得的病毒基因组覆盖率差别不大,但是样本核酸提取后经DNase处理组直接测序获得了最高的基因覆盖度和测序准确性,而SISPA扩增可有效提高病毒测序读长(reads)比例与基因组各位点的测序深度。结论本研究为优化冠状病毒等RNA病毒全基因组测序策略提供了技术参考。     

人LAIR-1/CD305基因启动子的生物信息学分析

目的:研究人LAIR-1/CD305启动子及其5′上游调控序列。方法:通过检索NCBI中的人类基因组数据库,获得LAIR-1的转录本序列及翻译起始位点上游2500bp的序列。利用Promoter2.0等软件预测LAIR-1的启动子序列,然后利用MatInspector等软件对启动子序列的转录因子结合位点和启动子功能模块进行预测。结果:LAIR-1基因的核心启动子区位于翻译起始密码子上游的600～200bp区域内。在转录调控区发现了一些重要的转录因子结合位点,并预测到13种启动子功能模块。结论:LAIR-1基因的表达可能受到多种转录因子和5′端上游调控序列的调控。     

人免疫缺陷病毒LTR转录调控机制的研究进展

人免疫缺陷病毒(HIV)的长末端重复序列(LTR)含有SPl区,增强子区,TATA区,NRE区和TAR区等5个调控序列,这些调控序列通过与病毒调控蛋白及细胞因子之间的相互作用,共同完成对HIV基因转录的调控。人免疫缺陷病毒(HIV)的复制受LTR的调控。HIV基因组的5′和3′末端各有一个LTR,HIV的转录受5′LTR调     

Southwestern印迹杂交

Soathwestern印迹杂交(Southwestern Blot)主要用于调控蛋白(Transacting Factors)与DNA调控元件(Cisacting Elements)相互作用的研究,是根据位点特异性DNA结合蛋白借助于氢键、离子键和疏水键与同位素标记的特异DNA序列探针结合,通过放射自显影体系对DNA结合蛋白进行定性、定量及对基因组DNA     

人类血管内皮细胞一氧化氮合成酶基因启动子序列的功能分析

目的 血管内皮细胞一氧化氮合成酶（ｅｎｄｏｔｈｉｌｉａｌ ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ,ｅｃＮＯＳ）在体内催化一氧化氮合成。为研究一氧化氮合成酶基因转录的调控,对一氧化氮合成酶基因启动子序列进行功能分析。方法 以血管内皮细胞核提取物为材料,采用凝胶迁移实验和ＤＮａｓｅⅠ足迹法实验。结果 启动子序列有３个区域与蛋白／转录因子结合。其中（－１０６～－８８）ＧＣ含量丰富,为转录因子ＳＰ１所     

α和β珠蛋白调节元件对染色质结构的相反作用可能与其染色体环境不同有关

人类α和β珠蛋白基因簇的表达分别受位于其上游5～40 kb的红系特异DNase Ⅰ高敏位点的HS-40和β位点调控区(β-LCR)的调节。这两种远端序列(remote sequence)具有共同的祖先、类似的排列及协调的表达。已知α和β基因簇具有完全不同的染色质环境。且两种调节元件发挥不同的顺式活化作用。     

基因治疗新策略:转录因子诱捕方法的应用进展

转录因子诱捕方法是一种在转录前和转录水平调控靶基因表达的技术,该技术利用双链诱捕性寡核苷酸(double-stranded decoy oligonuezleotide)竞争性结合转录因子的特异序列识别结构域,抑制转录因子与启动子序列的特异性结合,从而抑制下游基因的转录起始。近几年在基因治疗方面取得了明显进展。     

遗传学前沿领域的研究进展

(一 )于 1990年 10月正式启动的人类基因组计划 (ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ ,ＨＧＰ)已经取得了显著进展 ,约占整个基因组6 .3%的ＤＮＡ序列已被测定 ,已鉴定的基因 7484个 ,约 1万个人类基因的序列已经被克隆[1] 。据最新报道人类基因组全序列测定预计可以提前在 2 0 0 2年完成 ,比预计提前了一年。全球有关研究人员尝试将人类ＤＮＡ中的全部基因归类 ,这样使防治癌症、遗传性疾病成为可能。该计划的目标可概括为两点 :(1)人类 3× 10 10 ｂｐ的全序列分析 ;(2 )全部基因的识别及功能分析。人类基因组中约 5 10万个基因 ,它们…     

长链非编码RNA在神经发生中的调控作用

<正>基因组计划的研究成果表明,哺乳动物基因组中仅仅只有不到1%的序列能够转录为mRNA,剩下大部分基因组序列转录为之前被称为"转录噪音"的非编码RNA(noncoding RNA,ncRNA)~([1])。而lncRNA是ncRNA家族中最大的一类~([2])。近几年来,随着二代测序技术的广泛应用,lncRNA的神秘面纱才逐渐被揭开。许多研究表明,lncRNA虽然不编码蛋白质,但它有多种功能,包括招募转录因子来调控基因     

组织特异性表达基因PLUNC调控元件的生物信息学分析

目的分析组织特异性表达基因PLUNC的调控元件。方法采用进化足迹法,结合生物信息学工具,预测PLUNC基因的顺式作用元件和反式作用因子。结果预测的PLUNC基因的转录起始位点位于-1～＋10bp区域间、-29bp存在TATA盒子,启动子集中在-490bp～＋89bp内,在人和小鼠PLUNC基因的启动子保守区内存在29个共同的转录因子结合部位及5个增强子。结论PLUNC基因调控元件的分析可为探讨上呼吸道特异性表达基因的调控机制提供模型。生物信息学技术结合进化足迹法,在基因表达调控机制的研究中具有重要的应用价值。     

应用序列非依赖扩增技术检测儿童呼吸道标本中潜在病毒病原体

目的 应用序列非依赖扩增技术(sequence-independent amplification,SIA)检测常见病毒筛查阴性的5岁以下急性呼吸道感染患儿的呼吸道标本中可能存在的潜在病毒病原体,了解SIA扩增文库中各种背景核酸的组成.方法 随机选择45份常见病毒筛查阴性的5岁以下急性呼吸道感染患儿的鼻咽吸出物,0.45μm过滤和DNase/RNase处理去除病毒颗粒外的各种外源性核酸,再通过序列非依赖扩增技术对处理后的标本提取的核酸进行扩增,继而对扩增产物进行克隆、测序和BLAST比对.结果 测序403个克隆,获得有效序列368个,检出16个(16/368,4.3％)真核病毒同源序列,分别与Torque teno mini virus,Torque teno midi virus和Human bocavirus同源.此外,还检出1个真菌病毒( sclerotinia sclerotiorum hypovirulence associated DNA virus 1)同源序列和5个细菌病毒(噬菌体)同源序列.其余检出序列包含206个( 206/368,56.0％)与人基因组DNA同源的序列,11个(11/368,3.0％) rRNA同源序列,72个(72/368,19.6％)细菌同源序列,4个(4/368,1.1％)真菌同源序列,5个(5/368,1.4％)寄生虫同源序列,6个(6/368,1.6％)食源性序列,以及36个(36/368,9.8％)未能确定分类的序列.结论 核酸消化结合SIA方法可以检出常规检测方法所无法检出的潜在病毒病原体,本研究为后续系统性的查找和监测未知病毒提供了基础.     

人类基因组的单核苷酸多态性及其医学应用

１引言人类基因组计划已经取得了显著的进展,约占整个基因组６．３％的ＤＮＡ序列已被测定,已鉴定的基因７４８４个,约１万条人类基因的序列已被克隆。人类基因组全序列测定预计可以提前在２００３年完成［１］。人类基因组是一个十分稳定的体系,不同的民族、群体和个...     

细胞核对线粒体呼吸链功能调控的研究

核基因组(nuclearDNA,nDNA)与线粒体基因组(mitochondrial DNA,mt DNA)在调控呼吸链功能方面的研究一直处于探索阶段,线粒体核转录因子和线粒体解偶联蛋白(uncoupling protein,UCP)的发现,使细胞核调控呼吸链功能的研究得到了很大发展和应用.这些发现在细胞核对呼吸链功能的调控方面产生了新的认识.     

Krtippel样锌指因子在血液疾病中的研究进展

Krilppel,样锌指因子是真核生物中广泛存在的一类转录调控因子,参与细胞分化、增殖、凋亡和肿瘤形成等多种生理病理过程。其结构特点是羧基端高度保守,含有3个C2H2型锌指结构,与富含GC盒或CACCC序列的DNA结合;而氨基端的转录调控区在不同因子之间差异较大,发挥转录激活或转录抑制效应。现有研究显示多个Kriippel样锌指因子成员参与调控各类血细胞的生命活动。此文将就这几个与血液疾病发生有关的KLF样锌指因子作一概述。     

肽核酸的研究与应用

肽核酸(PNA)是近年设计合成的一种不带磷酸戊糖骨架的寡核苷酸类似物。不同碱基寡聚体PNA均能与DNA和RNA的序列特异性靶位点结合,形成稳定的特殊结构,可用于不同的目的:①基因组定点切割、基因克隆与图谱分析;②基因表达调控;③基因突变检测。如果PNA能在细胞内发挥作用,将成为最理想的基因靶向药物。     

转录调控子CRP对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌 entC的调控机制

目的确定环腺苷酸(cAMP)受体蛋白(CRP)对碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(CRKP)肠杆菌素铁载体相关基因entC的调控机制。方法以CRKP-27野生株构建crp基因缺失株Δcrp和回补株c-Δcrp。利用铬天青S(CAS)定量试验观察CRP对CRKP铁载体分泌量的影响。RT-qPCR试验和lacZ报告基因融合试验研究CRP对entC表达及对其启动子的调控。凝胶阻滞试验(EMSA)确定CRP是否与entC启动子区结合, DNaseⅠ足迹试验进一步确定结合序列。结果成功构建Δcrp和c-Δcrp菌株;在正常条件和缺铁条件下, Δcrp菌株的铁载体分泌量均高于野生株和c-Δcrp菌株, 但仅在正常环境中有统计学意义(P<0.05);正常条件和缺铁条件下, Δcrp菌株中entC基因的mRNA相对表达量较野生株和c-Δcrp菌株明显降低(P均<0.05);正常条件和缺铁条件下, Δcrp菌株中entC基因的启动子活性低于野生株和c-Δcrp菌株(P均<0.05);EMSA结合试验显示随着CRP蛋白量的增加, entC探针朝正极移动的距离都相应缩短, 出现阻滞现象;DNas...     

什么是“人类基因组计划”?

1990年 10月由美国科学家提出“人类基因组计划 (ｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ,ＨＧＰ)” ,目前世界许多国家都在进行此研究。该计划要在 2 0 0 5年完成对人体 10万个基因的全部分析。遗传学家估计人类基因组由 30亿个ＤＮＡ碱基对 (ｂｐ)组成 ,约含10万个基因 ,目前已有数千个人类基因被克隆分析。ＨＧＰ包括四个方面内容 :1 遗传图 ,又称连锁图 ,基因标志在染色体上的相对位置与遗传距离。 2 物理图 ,基因在ＤＮＡ序列上实际距离 ,3 ＤＮＡ的测序。 4 基因的确定和分析。现在有显微排阵、基因芯片等新技术 ,可大大提高基因分析…     

从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组序列特征研究

目的通过现代分子生物学理论与技术测定和分析了从脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）全基因组序列特征,以了解其致病性的分子基础。方法采用RT．PCR法和核酸序列测定法获得病毒基因组全序列,并利用DNASTAR、ClustalX version2．0．9及MEGAversion4．1等生物学软件分析该乙型脑炎病毒核苷酸序列、氨基酸序列及系统进化等。结果研究结果表明从病毒性脑炎患者脑脊液标本分离的基因I型乙脑病毒（GZ56株）基因组全长为10965nt,编码3432个氨基酸。病毒全基因组分子进化分析显示GZ56株全基因组与国际上第一株从蚊虫分离的基因I型乙脑病毒（M-28株）处于同一进化分支。GZ56株与其他基因I型乙脑病毒核昔酸和氨基酸序列同源性分别为96．2％～98．6％和98．2％～99．7％。病毒E基因与乙脑病毒灭活疫苗株P3相比存在11个氨基酸差异位点,而与乙脑病毒减毒活疫苗株SA14-14-2相比,在E蛋白上存在14个氨基酸差异位点。结论本研究提示,从病毒性脑炎患者标本分离的基因I型乙脑病毒全基因组未见明显变化,从基因组水平可以推测该病毒可以被现行的乙脑疫苗所保护。     

非编码RNA在人脑胶质瘤中的研究进展

非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)是近年发现的一类新型RNA,其共同特点是它们都能经基因组转录产生,但不产生蛋白产物,通过RNA水平调控执行多种生物学功能。哺乳动物基因组序列中绝大多数为ncRNA,其中,长链非编码RNA(long non-coding RNA,ln RNA)在人类脑部大量表达,参与胶质瘤染色质重构、介导修饰、转录调控、选择性剪切等生物过程。微小RNA(microRNA,miRNA)在脑部也被大量发现,在胶质瘤中部分miRNA表达异常升高,调控癌症相关基因的表达或参与调控肿瘤形成机制和调控通路。另外,环状RNA(circular RNA,circRNA)和与PIWI蛋白家族结合的RNA(Piwi-interacting RNA,piRNA)在胶质瘤发生发展中也可能发挥作用。     

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建

人NOD2基因启动子的绿色荧光蛋白表达载体的构建。以人基因组DNA为模板,PCR扩增含有人NOD2基因启动子不同长度的4段序列,利用特定的限制性内切酶位点,以切除启动子的pEGFP-N3作为框架结构,将这4个序列片段进行酶切并插入表达载体pEGFP-N3中,用Vsp I和Pst I双酶切和PCR鉴定重组质粒,再将重组质粒进行DNA序列分析。构建的重组质粒经脂质体LipofectamineTM2000介导转染HTK293T细胞,转染24 h后加入TNF-α持续刺激细胞24 h或不加TNF-α刺激,在倒置荧光显微镜下观察其能否在NOD2基因启动子的调控下表达报告基因绿色荧光蛋白(green fluores-cent proteins,GFP)。结果:pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEG-FP-N3-NOD2(1 387 bp)分别经酶切鉴定和序列测定证实目的基因已插入重组质粒;细胞转染结果表明,构建的4段重组质粒pEGFP-N3-NOD2(617 bp)、pEGFP-N3-NOD2(747 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 136 bp)、pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)转染的HTK293T均能表达绿色荧光,其中构建pEGFP-N3-NOD2(1 387 bp)重组质粒经TNF-α持续刺后激绿色荧光表达最强。4段不同长度的人NOD2基因启动子绿色荧光蛋白表达载体成功构建,这为进一步研究NOD2基因表达及调控机制奠定了良好的基础。