肿瘤细胞线粒体靶向表达Dm-dNK基因的实验研究

目的：探讨线粒体基质内核苷酸类似物的磷酸化水平,及Dm-dNK作为新的自杀基因杀伤肿瘤细胞的效果.方法：克隆线粒体信号于Dm-dNK序列N端,与绿色荧光蛋白（GFP）形成融合蛋白以确定基因的亚细胞水平表达位点,构建质粒转染骨肉瘤细胞及胰腺癌细胞,测定转染细胞Dm-dNK的活性和其对于嘌呤核苷酸类似物araC、dFdC、BVDU及araT的细胞毒性.结果：在所测试的细胞株中,线粒体基质内表达Dm-dNK具有较高的酶活性,转染肿瘤细胞对araC、araT及dFdC的敏感性增加.结论：Dm-dNK可以定位表达于肿瘤细胞线粒体并保持酶的活性,可能成为肿瘤基因治疗新的靶向作用位点.     

hTERT启动子的克隆及在MCF7乳腺癌细胞中的特异转录活性

背景与目的：利用肿瘤特异性启动子增强肿瘤细胞中治疗基因的转录选择性是达到基因治疗靶向性的有效途径。人端粒酶催化亚基（hTERT）在大部分肿瘤细胞中呈特异性高表达，有可能成为肿瘤特异性启动子。本文扩增了hTERT基因启动子并分别克隆于报告基因重组质粒pEGFP-1和pGL3-Basic，检测并证实hTERT启动子在乳腺癌细胞MCF7中的特异转录活性。方法：采用套式PCR法扩增hTERT启动子，将其分别克隆到含报告基因增强绿色荧光蛋白（EGFP）的重组质粒pEGFP-1和含Luciferase的重组质粒pGL3-Basic，经脂质体分别转染人乳腺正常上皮细胞系HBL100和乳腺癌细胞MCF7，荧光显微镜观察EGFP的表达情况，并测定两种细胞中荧光素酶转录表达差异。结果：与正常细胞HBL100相比，hTERT启动子在MCF7细胞呈现强的绿色荧光表达；荧光素酶活性检测与其一致，hTERT启动子在MCF7乳腺癌细胞的荧光素酶相对活性RLU／U值（33784）约相当于HBL100细胞中（2400）的15倍。结论：hTERT启动子在乳腺癌MCF7细胞中具有很强的特异性，为进一步开发肿瘤的特异性基因治疗奠定实验基础。     

乳腺癌细胞特异性MGA启动子的扩增及功能分析

目的 探讨人乳腺球蛋白（mammaglobin A, MGA）基因启动子的乳腺肿瘤细胞特异性和调控元件,并验证MGA启动子载体系统在活体肿瘤组织中的表达活性。方法 PCR扩增5.6 kb大小的人MGA启动子片段,并在此基础上构建四个含有萤火虫荧光素酶报告基因的重组载体;瞬时转染到乳腺癌细胞系T47D和人胚肾细胞系HEK293T后,利用双荧光素酶报告基因体系,检测各个MGA启动子活性;稳定转染MGA重组载体到乳腺癌细胞系T47D（T47DEM）,进行裸鼠皮下造瘤,活体成像检测报告基因活性。结果 （1）双增强子的启动子活性低于单增强子启动子（降低82%）;（2）定点删除YY1结合元件后,启动子活性下降76.2%,乳腺肿瘤细胞特异性下降38.4%;（3）定点删除Nkx2.5后,启动子活性没有明显变化,但特异性降低31.9%;（4）细胞株T47DEM在体形成肿瘤后,表现出明显的报告基因活性。结论 研究了两个增强子叠加和两个转录因子结合位点（YY1和Nkx2.5）对MGA启动子活性和特异性的影响;构建的细胞株（T47DEM）可以用于治疗乳腺癌药物的在体筛选。     

PAK5通过上皮-间质转化促进人乳腺癌细胞侵袭

目的:探讨p21活化激酶-5（p21-activated kinase 5,PAK5）蛋白对乳腺肿瘤细胞侵袭转移的作用机制。方法:观察PAK5过表达对乳腺癌细胞形态的影响,人乳腺肿瘤细胞MCF-7通过慢病毒感染稳定表达Flag-PAK5。然后提取感染细胞的总蛋白进行蛋白免疫印迹检测上皮-间质转化（EMT）标志物上皮-钙黏蛋白（E-cadherin）,纤维连接蛋白（Fibronectin）和波形蛋白（vimentin）的表达。最后通过Transwell实验检测过表达PAK5对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响。结果:过表达PAK5蛋白能够使细胞形态由鹅卵石样像梭形变化,下调E-cadherin蛋白,促进乳腺癌细胞迁移和侵袭。结论:PAK5可能参与调节乳腺肿瘤细胞发生上皮－间质转化,促进乳腺肿瘤侵袭转移的发生。     

维甲酸核受体－β抑制乳腺癌细胞的生长

维甲酸核受体－β（ＲＡＲβ）在多种细胞的分化中已证实起着很重要的作用，在多种肿瘤细胞包括乳腺癌中发现ＲＡＲβ基因的表达很低或无表达，而在正常乳腺组织中，ＲＡＲβ基因的表达则明显升高。作者采用质粒转染技术将ＲＡＲβ基因转移至乳腺癌细胞中，发现ＲＡＲβ基因转移的细胞和对照组细胞相比，能明显降低肿瘤细胞的生长，表现在：（１）在软胶细胞生长中，和对照组细胞相比形成小而少的细胞克隆。（２）在裸鼠模型生长中，和对照组相比，亦形成体积小得多的肿瘤块。实验结果提示，在乳腺癌细胞中，ＲＡＲβ具有抑制肿瘤生长功能     

miR-1287通过干扰GPX4的表达调控乳腺癌细胞的增殖

目的:探讨miRNA-1287（miR-1287）通过靶向结合并负向调控谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）表达在乳腺癌增殖中的作用及相关分子机制。方法:收集2018年01月至2019年01月期间来我院就诊的50位乳腺癌患者肿瘤标本及癌旁标本;运用实时定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）,检测乳腺癌患者肿瘤标本及癌旁标本miR-1287、GPX4 mRNA的表达水平;运用Western blot检测乳腺癌患者肿瘤标本及癌旁标本GPX4蛋白表达水平;运用Starbase 2.0软件预测miR-1287与GPX4 mRNA的结合位点;构建野生型位点（wt）和突变型位点（mut）GPX4荧光素酶报告基因质粒,探索miR-1287能否靶向结合并影响GPX4的表达;通过MTT实验检测miR-1287对乳腺癌细胞增殖能力的影响;通过谷胱甘肽（GSH）试剂盒检测乳腺癌细胞GSH水平,运用活性氧（ROS）试剂盒检测乳腺癌细胞活性氧水平。结果:乳腺癌患者肿瘤标本中miR-1287水平显著低于癌旁组织;而乳腺癌患者肿瘤标本中GPX4 mRNA及蛋白表达水平明显高于癌旁组织,其表达水平与miR-1287水平呈负相关关系;Starbase 2.0软件分析结果提示,miR-1287可以直接靶向结合GPX4 mRNA序列中的潜在位点;荧光素酶报告基因实验结果发现,miR-1287 mimic显著降低GPX4（wt）荧光素酶活性,对GPX4（mut）荧光素酶活性无明显影响;过表达miR-1287明显降低乳腺癌细胞GSH水平,增加ROS水平并显著抑制乳腺癌细胞增殖能力,而铁死亡抑制剂Fer-1预处理可以逆转miR-1287对乳腺癌细胞的上述作用,提示miR-1287通过促进铁死亡来执行其抑癌功能。结论:miR-1287通过抑制GPX4表达,进而促进肿瘤细胞铁死亡过程,最终抑制乳腺癌细胞增殖能力。     

核苷酸还原酶亚单位M1和内切修复交叉补体1在非小细胞肺癌中的研究进展

核苷酸还原酶亚单位M1（RRM1）属抑癌基因，RRM1可以激发G2期检测点功能，使受损的DNA得以修复或者发生凋亡，并具有抑制细胞侵袭和转移的作用，另外RRM1还可以调节核苷酸还原酶的活性，是抗代谢药吉西他滨作用的靶分子，RRM1高表达的细胞对吉西他滨耐药。内切修复交叉补体1（ERCC1）是细胞内负责修复受损DNA的核苷酸内切修复通路中的限速酶，可以识别和去除铂-DNA附加物而导致细胞对铂类耐药。本文综述RRM1和ERCC1在非小细胞肺癌患者预后和化疗个体化方面的研究进展。     

乳腺癌组织中HIF-1α和Glut1蛋白表达及其与肿瘤细胞增生的关系

 目的　探讨乳腺癌组织中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和葡萄糖转运蛋白1（Glut1）表达的关联性及其与细胞增生活性和临床病理因素的关系。方法　采用免疫组织化学方法检测HIF-1α、Glut1、增生细胞核抗原（PCNA）在80例乳腺癌组织、20例乳腺纤维腺瘤及20例乳腺增生组织中的表达水平并比较它们之间的相关性。结果　HIF-1α和Glut1在乳腺纤维腺瘤、乳腺增生组织中不表达；HIF-1α在乳腺导管内原位癌中阳性率55 %（11／20），浸润性乳腺癌中85 %（51／60）；乳腺癌中Glut1阳性率58.8 %（47／80）；乳腺癌中PCNA阳性率75 %（60／80），其中原位癌中65 %（13／20），浸润癌中78.3 %（47／60）。乳腺癌中HIF-1α表达与Glut1显著正相关（r＝0.653，P＜0.01）；HIF-1α表达与PCNA显著正相关（r=0.693，P<0.01）；Glut1与PCNA呈显著正性相关（r＝0.742，P＜0.01）。HIF-1α和Glut1在淋巴结、雌激素受体状态及组织学分级中表达差异有统计学意义；Glut1在肿瘤大小及孕激素受体状态表达差异也有统计学意义。结论　HIF-1α和Glut1蛋白的过表达共同参与了乳腺癌的发生、发展，与乳腺癌细胞增生活性密切相关，有望成为乳腺癌治疗的新靶点。     

乳腺癌组织中缺氧诱导因子-1α和葡萄糖转运蛋白1表达及其意义

目的探讨乳腺癌组织中缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）和葡萄糖转运蛋白1（Glut1）表达的关联性及其与细胞增生活性和临床病理因素的关系。方法采用免疫组织化学方法检测HIF-1α、Glut1、增生细胞核抗原（PCNA）在80例乳腺癌组织、20例乳腺纤维腺瘤及20例乳腺增生组织中的表达水平并比较它们之间的相关性。结果HIF-1α和Glut1在乳腺纤维腺瘤、乳腺增生组织中不表达；HIF-1α在乳腺导管内原位癌中阳性率55．0％（11／20），浸润性乳腺癌中85．0％（51／60）；乳腺癌中Glut1阳性率58．8％（47／80）；乳腺癌中PCNA阳性率75％（60／80），其中原位癌65％（13／20），浸润癌78．3％（47／60）。乳腺癌中HIF-1α表达与Glut1呈显著正相关（r=0．653，P〈0．01）；HIF-1α表达与PCNA呈显著正相关（r=0．693，P〈0．01）；Glut1与PCNA呈显著正性相关（r=0．742，P〈0．01）。HIF-1α和Glut1在淋巴结、雌激素受体状态及组织学分级中表达差异有统计学意义；Glut1在肿瘤大小及孕激素受体状态表达差异也有统计学意义。结论HIF-1α和Glut1蛋白的过表达共同参与了乳腺癌的发生、发展，与乳腺癌细胞增生活性密切相关，有望成为乳腺癌治疗的新靶点。     

乳腺癌C-erbB-2、nm23表达与免疫活性细胞反应的相关性

[目的]探讨乳腺癌C-erbB-2、nm23表达与间质中免疫活性细胞反应的相关性。[方法]应用免疫组化SP法检测126例浸润性乳腺癌中C—erbB-2、nm23；检测癌间质CD68和粒酶B（Gr-B）表达。[结果]（1）乳腺癌中C-erbB-2阳性表达率为61．9％，与肿瘤TNM分期、组织学分级、肿瘤大小及淋巴结转移呈正相关（P〈O．01）。nm23阳性表达率为71．4％．与肿瘤TNM分期、组织学分级、淋巴结转移呈负相关（P〈0．01）。（2）乳腺癌间质淋巴细胞数量在nm23的表达不同强度时有显著性差异。癌间质巨噬细胞数量nm23（＋＋）组显著高于nm23（-）组。粒酶B阳性细胞数量在nm23（＋＋）组高于nm23（＋＋＋）和（＋）组。[结论]C-erhB-2及nm23联合检测反映乳腺癌病理生物学特征，癌组织基因表达与间质免疫活性细胞反应有显著相关性。