改良法制备异种脱蛋白骨体内植入修复骨缺损的免疫学分析

摘要 背景：在支架材料选择中,目前尚未完全解决异种骨的免疫原性问题。 目的：观察改良法制备异种脱蛋白骨作为组织工程支架材料修复骨缺损后机体的免疫学改变。 方法：SPF级青山羊18只,随机分为3组,正常骨组不截骨,自体骨组、异种脱蛋白骨组在羊右侧胫骨中下段造成胫骨总长度20%骨膜和骨缺损。自体骨组在缺损处植入羊自体骨;异种脱蛋白骨组培养收集羊自体骨髓间充质干细胞,调整细胞数为1×109 L-1,将2 mL细胞悬液接种于以猪股骨为原料改良制备的猪脱蛋白骨上,再加入重组人骨形成蛋白2,半环槽外固定。采用流式细胞仪进行CD4+及CD8+ T淋巴细胞、血清抗体IgG免疫学检测,以双能X射线测量仪分析骨缺损修复效果。 结果与结论：异种脱蛋白骨组植入后3,7,14,28 d外周血CD4+和CD8+ T淋巴细胞的含量基本正常(P > 0.05),血清抗体IgG水平略高于自体骨组(P > 0.05);植入后24周骨密度、骨矿物含量与自体骨组基本相似(P > 0.05),表现为骨缺损区两断端之间高密度钙化影。3组抗压缩压强及极限压强、抗弯曲载荷及极限载荷、抗扭转转矩及极限转矩均基本相似(P > 0.05)。植入后24周与自体骨组比较,异种脱蛋白骨组的成骨能力无明显差异(P > 0.05)。提示改良法制备的异种脱蛋白骨不引起明显的细胞和体液免疫反应,有良好的组织相容性,不影响自体骨髓间充质干细胞成骨,新骨生物力学性能与自体骨相当。 关键词：脱蛋白骨;异种;猪;山羊;重组人骨形成蛋白2;骨缺损;骨组织构建 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.42.004     

异种脱蛋白松质骨支架构建组织工程骨用于脊柱横突间融合*

背景：异种脱蛋白松质骨来源广泛且具有独特的生物学特性,若能解决其免疫原问题,将有望利用异种脱蛋白松质骨开发出一种新型植骨材料。 目的：探讨异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程支架的性能,及其在山羊脊柱横突间融合中的作用。 设计、时间及地点：细胞-支架学体内实验,于2008-02/10在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成。 材料：6~8月龄健康雄性山羊12只,由牡丹江医学院动物中心提供。 方法：取成年猪股骨远端松质部分,通过理化方法制成脱蛋白松质骨支架,对其形态结构、组成成分、生物力学特性以及材料对种子细胞生物学行为的影响进行检测分析。羊髂骨穿刺取骨髓,梯度密度离心法分离获得第3代骨髓间充质干细胞。将支架材料复合一定量的自体骨髓间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2构建组织工程骨。12只羊建立L3、4双侧横突间植骨模型,修复组于左侧植入组织工程骨,对照组于右侧植入相同体积的自体髂骨。 主要观察指标：分别于植入后4,8,12周行X射线片和组织学观察对比分析。 结果：采用脱蛋白处理后的松质骨可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构,孔径200~500 μm,孔隙率60%左右,其无机成分为羟基磷灰石,有机成分为胶原,力学性能保存良好,细胞相容性良好。X射线片结果显示：植入第4周,横突桥接处部分区域模糊,以内侧明显,此时修复组材料密度略低于对照组;第8周上下桥接部间隙变小,大量连续骨痂生成;12周后完全融合,两组材料密度接近。移植区组织学观察结果显示：修复组植入后第4周以多点方式形成新骨,第8周岛状生成的骨组织贯穿整个移植材料,12周编织骨交错排列,髓腔形成,成骨活性接近自体髂骨移植;对照组植入后4周有较多新骨形成,8周时出现大量胶原纤维,周边成骨明显,至12周纤维组织减少,成骨活跃。 结论：以异种脱蛋白松质骨为支架材料,复合骨髓间充质干细胞、重组人骨形成蛋白2构建组织工程骨,体外X射线衍射分析及力学测试与体内成骨实验均证明其具有良好的组织相容性和较强的成骨能力,是一种良好的组织工程骨支架材料。 关键词：组织工程骨;异种脱蛋白松质骨;脊柱横突间融合     

异种脱蛋白松质骨作为支架材料的性能分析*★

背景：异种脱蛋白松质骨因其来源广泛和独特的生物学特性有望成为较好的骨组织工程支架，其关键点为免疫原问题，如能解决免疫原问题，则有望开发出一种新型植骨材料。 目的：通过理化方法制备脱蛋白松质骨，对其结构、组成及生物安全性能进行分析，探讨异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体可行性。 设计、时间及地点：对比观察实验，于2008-02/2009-01在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成。 材料：取成年猪和山羊股骨远端松质部分，1∶1氯仿甲醇液脱脂、体积分数30%H2O2脱蛋白，制得脱蛋白松质骨。 方法：①通过红外光谱仪、X射线衍射分析仪、氨基酸分析仪、力学测试仪进行载体性能测试。②取第3代人髂骨骨髓间充质干细胞调整浓度为2×108 L-1细胞悬液，接种到载体至饱和，倒置显微镜和扫描电镜观察种子细胞黏附及生长增殖情况。③40只BALB/C小鼠随机分为实验组和对照组，每组20只。分离小鼠股后肌肉制成肌袋，实验组植入猪脱蛋白松质骨，对照组直接缝合。术后1,2,4,8周检测分析血清肌苷、谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平。④采用免疫酶组织染色方法分析猪脱蛋白松质骨和植入小鼠体内4周脱蛋白松质骨标本的免疫原性。 主要观察指标：体外实验分析脱蛋白松质骨理化性能、免疫原性。动物实验分析生物安全性能。 结果：脱蛋白松质骨载体无机成分主要是与人骨天然成分相同的羟基磷灰石，经过一系列处理后，胶原蛋白并没有被脱除，这种结构保持了较好的力学性能。脱蛋白松质骨由于脱除了主要的免疫原性物质，其免疫原性较弱，毒性低。人骨髓间充质干细胞接种于载体后生长分化良好。 结论：异种脱蛋白松质骨是一种良好骨组织工程载体。     

异种骨支架材料的研制及相关表征

背景：异种脱蛋白松质骨因其来源广泛和独特的生物学特性使其有望成为较好的骨组织工程支架,不同处理方法可使其免疫原性和力学性能产生差异。 目的：对异种脱蛋白松质骨的制备工艺及免疫学和力学性能进行论证。 设计、时间及地点：对比观察实验,于2008-02/10在黑龙江省纤维化生物治疗重点实验室完成。 材料：取成年猪新鲜股骨远端松质部分,所截取骨块内不含软骨及皮质骨成分,初制为3 cm×0.5 cm×0.5 cm大小,其长轴与所取松质骨骨小梁排列方向一致,取材各骨块的表观孔隙密度基本相同。 方法：骨块于1∶1氯仿甲醇液脱脂24 h,50 ℃蒸馏水震荡冲洗,体积分数为0.2的H2O2浸渍24 h。反复3次。将处理后的骨块蒸馏水于室温下浸泡透析24 h,烘干。 主要观察指标：大体形态结构和组织学特点,氨基酸含量,生物力学性能。 结果：经脱蛋白处理的松质骨立体空间结构并无大的破坏,由羟基磷灰石和胶原网架构成大小不等、相互交通、开放的孔隙和高度的孔隙间连接。材料中胶原类氨基酸与新鲜松质骨无明显差异,而芳香族氨基酸如酪氨酸、蛋氨酸波峰消失。脱蛋白松质骨弹性模量高于新鲜松质骨(P < 0.05)。 结论：异种脱蛋白松质骨具有良好的孔隙与孔隙率,低免疫原情况下可以保持良好的力学性能。     

脱蛋白松质骨作为异种骨移植材料的修复作用*☆

背景：采用脱蛋白处理后的松质骨可见大小不等、相互交通、开放孔隙的网架结构，其无机成分为羟基磷灰石，有机成分为胶原,力学性能保存良好，有良好的细胞相容性，可能是一种新型骨移植材料。 目的：介绍异种脱蛋白松质骨作为骨组织工程载体的性能，以及其用于骨融合的作用。 方法：分别以“异种脱蛋白松质骨、骨融合、载体”，为检索词，应用计算机检索重庆维普(VIP)期刊全文数据库及Pubmed 数据库1998-01/2009-12有关文章，排除与研究目的无关和内容重复者，保留33篇文献做进一步分析。 结果与结论：动物骨均有相似的生物材料结构和造型，较人工合成材料骨具有极好的细胞贴附性和细胞生长增殖环境。但由于异种骨移植时种属间的抗原差异，存在剧烈的免疫排斥反应，骨组织兼容性差，关键问题是植入体内免疫问题。如能克服免疫原性，异种脱蛋白松质骨是一种良好的组织工程骨载体材料，可为再血管化和成骨细胞的分化提供一个稳定的环境。     

骨形态发生蛋白2复合异种脱蛋白骨支架材料修复山羊大段骨缺损

背景：单纯骨形态发生蛋白2修复骨缺损只有骨诱导性，单纯异种脱蛋白骨只有骨传导性。 目的：评估异种脱蛋白骨复合骨形态发生蛋白2修复山羊大段长骨缺损的效果。 设计、时间及地点：随机分组设计、动物对照观察实验，于2005-03/2007-02在解放军第三军医大学创伤、烧伤与复合伤国家重点实验室完成。 材料：山羊24只用于制备大段长骨缺损模型。市售猪股骨用于制备脱蛋白骨。重组骨形态发生蛋白2为美国Biosource公司产品。 方法：山羊右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20%制备节段性骨缺损模型。24只山羊按植入材料的不同分为3组，单纯异种脱蛋白骨组、自体骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组，每组8只。 主要观察指标：植入后4，8，12，16，20，24周X射线评估骨缺损情况。植入后24周取新生骨组织进行双能X射线、组织学、生物力学检测修复效果。 结果：植入后12，24周自体骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组X射线评分均高于单纯异种脱蛋白骨组，差异有显著性意义（P < 0.05）。植入后24周自体骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组骨密度和骨矿含量均高于单纯异种脱蛋白骨组，差异有显著性意义（P < 0.05）。自体骨组和异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组之间比较差异均无显著性意义（P > 0.05）。植入后24周生物力学测试表明，自体骨组>异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组>单纯异种脱蛋白骨组。植入后24周，自体骨组、异种脱蛋白骨+重组骨形态发生蛋白2组，新生骨与最初两断端连成一体，新生骨骨小梁排列整齐有序。单纯异种脱蛋白骨组，新生骨与最初两断端部分相连。 结论：重组骨形态发生蛋白2复合异种脱蛋白骨修复山羊胫骨大段缺损成骨能力与自体骨相当。     

改良法制备异种脱蛋白骨复合重组人骨形态发生蛋白支架修复长骨大段骨缺损

目的：异种脱蛋白骨因其来源广泛和独特的生物学特性作为组织工程骨支架材料在修复长骨大段骨缺损上有较好的应用前景。 目的：采用改良法制备异种脱蛋白骨复合重组人骨形态发生蛋白支架材料,评价其修复大动物大段长骨缺损的成骨能力。 方法：山羊24只,随机分为单纯异种脱蛋白骨组、自体骨组及异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组,在每只山羊右侧胫骨中下段截除胫骨总长度20%形成节段性骨缺损,按分组情况植入不同材料,采用半环槽式外固定器固定。术后4~24周每隔4周进行X射线检查,术后24周取新生骨进行双能X射线、组织学、生物力学检测骨缺损修复效果。 结果与结论：①制得的异种脱蛋白骨为三维多孔结构,其孔隙率为(78.5±6.45)%,孔径大小为(472.5±7.02) μm。②各组骨缺损表现为时间依从性的骨修复,生物力学试验抗压缩、三点抗弯曲和抗扭转试验均为自体骨组> 异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组>单纯异种脱蛋白骨组。③自体骨组、异种脱蛋白骨+重组人骨形态发生蛋白组与正常组比较,山羊胫骨骨密度及骨矿含量、抗压缩压强及极限压强、抗弯曲载荷及极限载荷、抗扭转扭矩及极限扭矩平均值差异均无显著性意义。结果提示改良法制备的异种脱蛋白骨复合重组人骨形态发生蛋白修复山羊胫骨大段缺损成骨能力与自体骨相当,可以作为组织工程支架材料。 关键词：异种脱蛋白骨;重组人骨形态发生蛋白;骨缺损;组织工程;支架材料 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.16.043     

猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体兔体内成骨☆

目的：生物衍生骨具有天然骨组织的三维立体孔隙-网架结构，有利于种子细胞的黏附、增殖。观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解。 方法：实验于2005-03/2006-12在中南大学湘雅医院中心实验室完成。选择健康家兔16只，3月龄左右，其中1只提供骨髓，另15只作组织工程骨植入，分4，8，12周3个时间点，每个时间点5只。采用Ficoll密度梯度离心法得到兔骨髓基质干细胞并诱导培养；采用物理化学方法对猪松质骨进行处理得到猪松质骨支架，与经诱导培养的骨髓基质干细胞体外复合培养后植入机体内，同时植入单纯猪松质骨支架做自身对照。 结果：纳入动物15只，均进入结果分析。采用X射线、苏木精-伊红染色、Masson三色染色及图像分析观察猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体在兔体内成骨及支架的降解。①X射线观察：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体移植术后4周移植区周围可见少量散在分布的中密度影，8，12周时中高密度影逐渐向中心区增大。单纯猪松质骨支架移植术后各时间点移植区内均呈低密度影。②组织学观察：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后4周开始有新骨生成，支架开始降解；8周时新骨的形成及支架的降解都明显增加；12周时新骨继续增加，逐渐向成熟骨组织转变，可见少量哈佛系统，但骨小梁尚不典型，毛细血管增生明显，少量支架残留，未见炎症细胞。单纯猪松质骨支架植入后各时间点无新骨形成。③图像分析表明：猪松质骨支架/骨髓基质干细胞复合体植入后新骨组织随时间延长而增加，而材料组织随时间延长而减少，但新生骨组织增加与支架材料组织减少无明显直线相关（P > 0.05）。 结论：猪松质骨支架与骨髓基质干细胞复合移植后新骨逐渐形成，支架逐渐降解，是一种较理想的骨组织工程支架材料。     

超声脱细胞异种松质骨材料的抗原性与生物相容性

背景：异种骨是一种复合组织,来源广泛,一直是骨修复研究领域热衷于制备、改良、开发的植骨材料,其抗原主要分布于骨组织的有核细胞,充分脱细胞是去除异种骨抗原的有效手段。 目的：观察超声脱细胞异种松质骨材料的抗原性与生物相容性。 方法：提取新鲜松质骨、常规材料和超声材料上清,检测抗原特异性淋巴细胞刺激增殖指数;将常规材料和超声材料分别植入SD大鼠体内,以假手术组做对照。流式细胞分析仪检测其外周血CD4+、CD8+淋巴细胞亚群的百分率及CD4+/CD8+淋巴细胞比值的变化;与骨髓基质细胞的接触培养,观察两种材料对基质细胞增殖指数的影响,扫描电镜观察骨髓基质细胞在超声材料和常规材料表面的黏附和增殖情况。 结果与结论：新鲜松质骨刺激指数值最高,超声材料组刺激指数值接近于1,与常规材料组比较有显著性差异(P < 0.05)。术后第2周,常规材料组CD4+T细胞亚群百分率为32.89%,与假手术组(28.72%)比较,差异有显著性意义 (P < 0.05),超声材料组与假手术组比较无显著差异(P > 0.05);常规材料组和超声材料组CD8+T细胞亚群百分率分别为16.28%和13.49%,两组差异有显著性意义(P < 0.05),均高于假手术组(10.07%) (P < 0.01),常规材料组和超声材料组CD4+/CD8+T细胞比值无显著性差异;2周后各组动物CD4+ 、CD8+ T细胞亚群百分率逐渐回落,至术后6周3组之间差异无显著性意义。常规材料和超声材料对骨髓基质细胞的增殖均产生接触抑制效应,常规材料的抑制作用稍强,但差异无显著性意义(P > 0.05)。扫描电镜观测骨髓基质细胞在超声材料表面黏附生长,培养至5 d呈亚融合状态,细胞密度明显高于常规材料组。 结果提示,实验所制备的超声材料,其抗原性较常规材料弱,有利于骨髓基质细胞的黏附生长,表现出良好的生物相容性。 关键词：异种骨;超声生物技术;生物材料;抗原性;生物相容性 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.34.015     

5000兔骨髓基质细胞在纤维蛋白胶与异种骨复合支架中培养(英文发表）

目的 应用纤维蛋白胶、异种无机骨构建骨组织工程复合支架材料,探讨兔骨髓基质细胞在这种复合支架材料中立体培养情况。 方法 实验完成于吉林大学中日联谊医院骨科研究室、天津科技大学机械工程学院。牛松质骨经去脂去蛋白等无机化处理后与纤维蛋白胶复合制成复合骨支架材料;将兔骨髓基质细胞作为种子细胞进行传代培养,收集后再与纤维蛋白胶、异种无机骨构成的复合支架中进行立体培养,采用相差显微镜、透射电子显微镜等手段观察骨髓基质细胞在纤维蛋白胶中的生长状况。结果 相差显微镜下观察见骨髓基质细胞均匀分布于复合支架中,具有良好活性,细胞不断增殖、分化,培养4周骨髓基质细胞形成密集立体网状。透射电子显微镜下见复合支架中培养4周的基质细胞内细胞器结构完整,局部有细突起,胞质内可见线粒体,核糖体,粗面内质网。进一步证实骨髓。结论 在纤维蛋白胶与异种无机骨构建的复合支架中骨髓基质细胞具有良好活性,可迅速扩增生长,提示这种支架材料具有适合种子细胞生长的环境,具备两种支架材料的优越性,可以成为良好的骨组织工程支架材料。