慢性乙型肝炎患者外周血中T细胞受体基因重组及其作用

运用ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ技术分析１０９例慢性乙型肝炎患者外周血Ｔ细胞受体基因β链（ＴｃｅｌｒｅｃｅｐｔｏｒｇｅｎｅＢｅｔａｃｈａｉｎ，ＴＣＲβ）重组。发现有４．５ｋｂ，５．０ｋｂ，２１ｋｂＥｃｏＲ１重组带和５．５ｋｂ，１６ｋｂ，１８ｋｂＨｉｎｄⅢ重组带。白人患者的５．０ｋｂＥｃｏＲ１和５．５ｋｂＨｉｎｄⅢ重组带出现的频率（分别为４４．４％）高于亚裔患者（１０．８％和１８．８％）和土著患者（１５．６％和２５．６％）。表明：慢性乙型肝炎患者对ＨＢＶ的应答由寡克隆参与，优势克隆分别由Ｃ１区和Ｃ２区参与重组，白人患者对ＨＢＶ感染有较强的应答能力。     

乙型肝炎病毒基因型与拉米夫定疗效关系研究

目的 探讨乙型肝炎病毒（HBV）基因型与拉米夫定治疗疗效的关系及其机理。方法 收集拉米夫定治疗的51例慢性乙型肝炎患者的临床资料，分析HBV基因型与拉米夫定治疗疗效的关系。结果 HBV基因型B型对拉米夫定的应答率为45．4％（10／22），C基因型的应答率为20．7％（6／29），两组应答率差异有显著性（P〈0．05）；B基因型的HBeAg的血清转换率为31.8％（7／22），C基因型为13．8％（4／29），经统计学处理差异有显著性（P〈0．05）。结论 拉米夫定治疗慢性乙型肝炎患者，B基因型疗效较C基因型好，HBV基因型可能是预测拉米夫定治疗效果的因素之一。     

HBV前C／BCP区变异对HBeAg阳性慢乙肝患者干扰素治疗早期应答的影响

目的：研究HBV DNA前C区1896位变异,BCP区1762/1764位变异与干扰素α治疗应答的关系。方法以41例接受干扰素治疗的HBeAg阳性慢性乙型肝炎（慢乙肝）患者为研究对象。治疗前取患者外周血清,采用PCR 技术扩增前C区、BCP区,并测序分析。同时监测治疗0、12、24周患者外周血ALT、HBsAg、HBeAg、HBV DNA水平。结果①PC/BCP区变异（突变型,non-WT）患者HBeAg转阴率（ n＝13,72．2％）高于未发生PC/BCP变异（野生型,WT）患者（n＝4,28．8％）（P＝0．014）;②突变组HBsAg降低（ n＝5,56．7％）、HBVDNA转阴（n＝8,53．5％）,完全应答（ n ＝5,62．5％）,野生组 HBsAg 降低（ n ＝6,43．3％）、HBV DNA 转阴（ n ＝7,46．7％）,完全应答（n＝3,37．5％）,2组间无明显差异。结论突变型患者HBeAg转阴率高于野生型患者。     

输血传播病毒(TTV)重叠感染在慢性乙型肝炎病毒感染患者中的临床意义

目的：研究乙型肝炎病毒感染患者TTV重叠感染情况及初步探讨TTV的致病性。方法：在ORF1区设计特异性引物建立巢式多聚酶链式反应（PCR），检测乙型肝炎病毒感染患者血清中TTV DNA，对PCR产物进行分子克隆和测序。结果：献血员、慢性乙型肝炎病毒携带者、慢性乙型肝炎和慢性重型乙型肝炎患者TTV DNA阳性率分别为10％、11％、27％、48％。其中前两者与后两者比较均有显著差异，慢性乙型肝炎和慢性重型乙型肝炎患者相比也有显著差异（P＜0．05），乙型肝炎病毒感染者中其HBV感染复制指标的阳性率在TTV DNA阳性与TTV DNA阴性组之间无明显差异（P＞0．05）。慢性乙型肝炎和慢性重型乙型肝炎患者的ALT和TBIL在TTV DNA阳性病人组与TTV DNA阴性病人组之间比较有显著性差异（P＜0．05），TTV DNA阳性病人组明显高于TTV DNA阴性病人组。结论：献血员中存在TTV感染，乙型肝炎病毒感染患者重叠感染TTV较常见。慢性乙型肝炎和慢性重型乙型肝炎患者TTV DNA阳性率明显高于献血员和慢性乙型肝炎病毒携带者的阳性带，提示TTV的重叠感染可能是HBV感染病情加重因素之一，TTV重叠感染对HBV的复制可能不存在相互作用。     

HBV转录后调节序列中与干扰素α应答有关位点的初步鉴定与分析

目的：筛选乙型肝炎病毒（HBV）感染者转录后调节序列中与干扰素α治疗应答有关的差异位点。方法：采用PCR反应产物直接测序法，对31例HBV感染者血清中HBV DNA上的转录后调节序列（HPRE）片段扩增后测序，与GenBank中来源于欧美人群的乙型肝炎序列进行比较，并结合临床资料进行分析。结果：在中国慢性HBV感染者HPRE的β2区，存在3个位点变化，分别为ntI504(T→C），占75．0％，nt1508(C→T)，占57．1％（C→G），占10．7％；nt1509(C→T)占60．9％。而在欧美HBV感染者的HBV DNA序列中均不存在上述位点变化。HPRE位点差异的发生率与HBV DNA水平未见明显相关。结论：不同种族HBV感染者转录后调节序列的差异可能与干扰素α治疗的应答性有关。     

中国云南少数民族地区慢性乙型肝炎患者病毒基因在大肠杆菌中的表达及其抗原性

目的 研究不同民族慢性乙型肝炎（CHB）患者HBV前S2／S（preS2／S）和C（core,C）基因在大肠杆菌Escherichia coli（E.coli）中表达的稳定性和水平,并对其抗原性进行鉴定,为创制新型疫苗提供抗原材料。方法从中国云南少数民族地区50例慢性乙型肝炎患者血清中提取HBV基因组DNA,将聚合酶链反应（PCR）扩增-克隆-测序的HBV preS2／S和C基因插入到表达载体pkPR上,构建重组pkPR-S2S和pkPR-C表达质粒,并在大肠杆菌TOP10中表达。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定表达产物非融合蛋白,并对其抗原性用Western印迹和ELISA方法进行检测。结果SDS-PAGE检测到全部慢性乙型肝炎患者pkPR-S2S和pkPR-C重组质粒在大肠杆菌TOP10中存在稳定性和高水平的表达,表达的非融合蛋白相对分子质量分别为31000和21000,非融合蛋白浓度约占16％,纯度达96％。Western印迹和ELISA分析,非融合蛋白能分别与HBVpreS2／S抗原单抗、C抗原单抗及慢性乙型肝炎患者血清发生反应,而与对照的甲型肝炎（HAV）患者血清、丙型肝炎（HCV）患者血清及正常血清之间无交叉反应。结论中国云南少数民族地区慢性乙型肝炎患者HBV preS2／S和C基因在大肠杆菌TOP10中有稳定性和高水平的表达,表达的非融合蛋白具有抗原性。这些发现为创制新型疫苗具有潜在应用价值。     

恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎合并脂肪肝临床疗效观察

目的观察恩替卡韦治疗慢性乙型肝炎合并脂肪肝疗效。方法回顾分析272例使用恩替卡韦抗乙型肝炎病毒治疗的慢性乙型肝炎患者,经超声诊断分为慢性乙型肝炎合并脂肪肝组58倒;单纯慢性乙肝组214例。均给予恩替卡韦0．5mg空腹口服1次／d,抗病毒治疗,疗程48周,比较二组患者治疗结束时病毒学应答和生化学应答的差异。结果慢性乙型肝炎舍并脂肪肝58例患者有40例（68．97％）出现病毒学应答,单纯慢性乙型肝炎214例患者有177例出现病毒学应答（82．71％）。二组病毒学应答率分别为68．97％（40／58）和82．71％（177／214）（Х^2=5．344,P〈0．05）,差异有统计学意义。ALT复常率分别为60．34％（35／58）和73．83％（158／214）（Х^2=4．028,P〈0．05）,存在肝细胞脂肪变性的慢性乙型肝炎患者对于恩替卡韦抗乙型肝炎病毒的ALT复常率和HBV—DNA转阴率下降。结论肝细胞脂肪变性是影响恩替卡韦抗病毒疗效的重要因素之一。     

自然发生和拉米夫定诱导的乙型肝炎病毒逆转录酶区序列变异的特征

目的 研究慢性乙型肝炎（CHB）患者在自然状态或在拉米夫定（LVD）长期治疗过程中乙型肝炎病毒（HBV）逆转录酶区（RT）序列变异出现的时机和特点。方法 120例CHB患者按测序时机分3组：Ⅰ组初治患者25例，Ⅱ组病毒学突破患者74例，Ⅲ组病毒学部分应答患者21例。所有患者留血清标本，提取血清HBV—DNA，应用PCR扩增，直接测序HBV RT区，Chromas2．0软件分析HBVP基因RT区变异，同时使用Clustalxl．81．msw进行基因型分析。结果 120例CHB患者中，B型34例（28.3％），C型85例（70．8％），B／C型1例（0．8％）。Ⅰ组患者中，2例（8．0％）出现rt变异原发性LVD耐药（LVDr），其中1例为rtM204V＋rtL180M变异，另1例为rtL180M变异与野毒株并存；Ⅱ组患者中，67例（90．5％）出现继发性LVDr变异，rt变异位点为rtM204V／I、rtL180M、rtV173L／M、rtV207M/L/I、rtA181T,rtM250L；Ⅲ组患者中，出现rtV1911、rtF221Y变异各1例，没有出现LVDr相关的变异。结论 CHB患者在自然状态下和病毒学突破时HBV可出现LVDr变异，治疗前后对HBV逆转录酶区（RT）序列分析可指导临床抗HBV药物的选择。     

α－2 b普通干扰素治疗不同基因型HBeAg阳性慢性乙型肝炎的临床疗效观察

目的：初步探讨α－2b普通干扰素治疗不同基因型HBeAg阳性慢性乙型肝炎临床疗效。方法：选择HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者71例,采用荧光定量PCR法测定HBV基因型,并作治疗前临床资料及治疗后疗效进行统计学分析。结果：71例病例中,基因B型20例（28％）,C型51例（72％）,B、C基因型在ALT、HBV DNA上无统计学意义（P＞0．05）,α－2b普通干扰素治疗中,B、C基因组完全应答率有统计学差异（P＜0．05）。结论：α－干扰素治疗HBeAg慢性乙型肝炎,B基因型效果优于C基因型患者,乙肝病毒基因型是预测干扰素治疗疗效的重要因素。     

聚乙二醇干扰素治疗慢性乙型肝炎的临床疗效及影响因素分析

目的：观察聚乙二醇干扰素（PEGIFN）治疗慢性乙型肝炎（CHB）的效果及疗效的影响因素。方法入选55例CHB患者给予PEGIFN抗病毒治疗,疗程48周,随访48周。患者入组和治疗前检测血清乙型肝炎病毒（HBV）DNA载量,HBV基因分型及前C区突变情况;治疗开始后每个月1次,连续3个月,3个月后改为每3个月1次检测血清HBVDNA载量;以病毒学应答作为疗效的主要评价指标。观察不同的基因型别,HBVDNA载量的高低及前C区有无突变对疗效的影响。结果55例患者基线时低病毒载量组较高病毒载量组持续应答（SVR）获得率高（P＜0．01）,两组早期病毒学应答（EVR）获得率差异无统计学意义（P＞0．05）;C基因型无突变组,B基因型无突变组和C基因型有突变组3组SVR获得率差异具有统计学意义,且依次降低,分别为63．6％,53．8％和40．0％,3组EVR获得率差异无统计学意义（P＞0．05）。结论HBVDNA载量基线水平联合HBV前C区突变情况可能成为一个有效的预测指标,对优化PEGIFN治疗CHB的疗效有一定的指示意义。     

广西河池地区不同类型乙型肝炎患者HBV基因分型研究

目的：了解河池地区乙型肝炎病毒基因型分布特征,探讨HBV各基因型与血清HBV DNA水平之间的关系。方法：采用实时PCR技术,对广西河池地区140份乙型肝炎患者血清中的HBV DNA进行基因分型和定量检测。结果：140例血清中,C型94例（67．2％）,B型32例（22．9％）,B、C混合型7例（5．1％）,A型1例（1．0％）,D型1例（1．0％）。B型、C型与B、C混合型患者在HBV DNA水平上没有显著差异（P〉0．05）。C型在慢性乙型肝炎患者中的所占比例（72．3%）比在急性乙型肝炎、肝硬化和肝癌患者中所占的比例较高,但差异无统计学意义。结论：河池地区HBV基因型以C型为主、B次之,B、C混合型较少,A型、D型极少;各基因型患者在HBV DNA水平上没有显著差异。     

慢性肝病患者HBV复制与IL-18水平变化的意义

目的为探讨慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化患者HBV复制对血清中细胞因子IL-18水平变化的影响及其临床意义。方法HBV复制应用聚合酶链；IL-18水平应用ELISA等方法对慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化患者外周血中的HBV—DNA、IL-18水平进行了平行测定，比较HBV复制与慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化患者IL-18水平的相关关系。结果慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化患者组的IL-18含量与正常健康对照组比较均明显升高（P〈0．05）。慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化患者HBV—DNA高复制组（HBV—DNA含量〉10）IL-18含量明显高于HBV—DNA阴性组（P〈0．05）；慢性乙型肝炎与肝炎肝硬化患者组之间IL-18含量比较无显著性差异（P〉0．05）。结论细胞因子IL-18活性在慢性乙型肝炎与肝炎肝硬化发生发展中具有一定作用；慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化患者HBV复制与血清中细胞因子IL-18水平变化具有一定的相关关系。因此，在临床上慢性乙型肝炎、肝炎肝硬化患者检测外周血中HBV—DNA、IL-18水平对判断患者病情的发展变化、预后及指导治疗具有一定意义。     

慢性乙型肝炎病毒C区基因突变株对干扰素治疗的应答反应

[目的 ]探讨慢性乙型肝炎病毒C区基因突变株对干扰素治疗的应答反应 .[方法 ]对 5 8例慢性乙型肝炎患者用重组干扰素 α(总用量 5 2 2× 10 6U)治疗 .前C区基因停止密码 2 8的突变株由限定酶断片长短的多形性测定 .C区基因的变异是用增殖各患者的 5种乙型肝炎病毒DNA克隆的方法检测 .[结果 ]干扰素疗程结束 6个月后 ,前C区变异株 2 3例中 14例 (6 0 % )乙型肝炎病毒e抗原阴转 ,无变异的野生型 35例中 15例 (4 3 % )乙型肝炎病毒e抗原阴转 ,二组无显著性差异 ,而前C区野生型 35例中C区基因 5个克隆全变异组 (2 4例 )的乙型肝炎病毒e抗原阴转率高于C区基因 5克隆中至少 1个克隆未变异组 (11例 ) (5 8%与 9% ) .[结论 ]感染乙型肝炎病毒变异株的乙型肝炎病毒e抗原阳性患者对干扰素应答良好 ,但这种变异株并不一定非在前C区 ,而C区基因的变异株亦可通过干扰乙型肝炎病毒e抗原的合成和分泌 ,从而影响干扰素的应答反应     

安徽部分医院HBV基因型的分布及其临床意义

目的了解安徽省部分医院乙型肝炎病毒（HBV）基因型的分布及其与临床的相关性。方法选择安徽部分医院HBV DNA阳性的HBV感染者196例,其中急性黄疸型肝炎3例,慢性乙型肝炎107例,肝炎后肝硬化59例,原发性肝癌6例,慢性重型肝炎20例,亚急性重型肝炎1例,采用Caliper-1000微流芯片分析仪分析检测HBV DNA和基因型。结果196份HBV DNA阳性血清标本中,B基因型126例（64．3％）,C基因型59例（30．1％）,BC混合型11例（5．6％）,未发现其他基因型。江淮之间以B基因型占优势,淮河以北以C基因型占优势,分别为68．8％和66、7％;HBVB基因型感染的临床疾病谱以慢性乙型肝炎为主,占62．7％（P〈0．01）,C基因型感染者以肝硬化为主,占44．1％（P〈0．01）,差异有显著性;检测出的HBV基因型与病毒载量、HBeAg阳性表达差异均无显著性;肝硬化患者HBV C基因型的HBeAg阳性表达（68．4％）明显高于B基因型（31．6％）和BC混合型（0）。结论安徽省部分医院HBV基因型存在B、C和BC混合型,B型为该地区的优势基因型。HBVB基因型感染的临床疾病谱以慢性乙型肝炎为主,而HBV C基因型感染以肝硬化为主。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及表达

目的构建含乙型肝炎病毒（hepatitis Bvirus，HBV）X基因的真核表达载体，为探讨HBVX基因与慢性乙型肝炎及肝癌发生的关系提供实验依据。方法用PCR方法扩增含EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点的X基因序列，对pcDNA3．1（＋）载体及X基因PCR产物双酶切，用连接酶将两者连接并转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性克隆，并对其进行双酶切和测序鉴定，构建HBVX基因真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx。用梭华-Sofast^TM基因转染试剂将其质粒转染THP-1巨噬细胞，细胞裂解液经SDS-PAGE及转硝酸纤维素膜后做Western blotting，鉴定目的蛋白。结果双酶切pcDNA3．1（＋）-HBx后，琼脂糖电泳可分别见到大小约为5．4kb和465bp片断，说明X亚克隆入pcDNA3．1（＋），经序列测定其含有完整的X基因片段；Western blotting结果显示pcDNA3．1（＋）-HBx能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。结论成功构建了真核表达载体pcDNA3．1（＋）-HBx，并能在THP-1巨噬细胞中表达X蛋白。     

乙型肝炎病毒基因型及其血清学标志物关系的研究

目的进一步探讨乙型肝炎病毒（HBV）基因型与血清学标志物及与HBV DNA病毒复制载量的关系。方法研究病例为170例，其中急性乙型肝炎14例、慢性乙型肝炎88例、肝硬化24例、重型肝炎18例、肝细胞癌2例和慢性无症状携带者24例。抽取其外周血，用酶免疫法（EIA法）测定其基因型，同时检测HBV血清标志物和HBV DNA病毒复制载量，分析相互之间的关系。结果检出C基因型105例（61．76％），B基因型59例（34．71％），D基因型3例（1．76％），B＋C基因型1例（0．59％）和基因型未明2例（1．18％）。B、C基因型在慢性肝炎、肝硬化、重型肝炎和肝细胞癌病人中分布存在差异（分别为22．94％、52．35％），C基因型病人的HBeAg阳性率与B基因型的HBeAg阳性率无明显差异（P〉0．05）。C基因型病人的HBV DNA病毒复制水平高于B基因型病人的HBV DNA病毒复制水平（P〈0．01）．结论C基因型的血清HBV DNA病毒复制水平高于B基因型，病毒复制活跃，C基因型与较重的肝脏损害有一定关系。     

血清β2-微球蛋白与慢性肝炎疾病程度和病毒复制之间的关系

目的探讨血清β2-微球蛋白（β2-MG）水平与慢性乙型肝炎血清HBV DNA滴度及临床类型之间的关系。方法对124例不同类型慢性乙型肝炎病人同时检测血清β2-MG和HBV DNA滴度，比较各临床类型和不同HBV DNA滴度的血清β2-MG水平。结果慢性乙型肝炎病人的血清β2-MG水平，慢性乙型肝炎重度〉中度〉轻度（P=0．000）；HBV DNA〉104拷贝／mL高于HBV DNA≤10^4拷贝／mL组（P=0．000）。结论慢性乙型肝炎病人血清β2-MG浓度水平能反映疾病的严重程度，并且和血清HBV DNA含量相关。     

381例HBV感染者HBV DNA前C区基因突变的研究

目的：研究乙肝病毒前C区基因变异株感染在乙肝病毒感染者中的分布情况,探讨其临床意义。方法：采用PCR－SSCP分析技术对381例HBV感染者进行HBV DNA前C区基因突变检测。结果：在不同临床类型的感染者中,检出率以肝癌患者最高（66．7％）,其次为慢重肝（50．00％）、肝硬化（43．75％）和慢性肝炎（35．35％）,它们与无症状HBV感染者和急性肝炎患者比较,差异均有显著性（P＜0．05）;在ALT明显升高的患者中,前C突变的检出率（34．86％）明显高于ALT正常者（21．71％）。结论：HBV DNA前C区基因突变可能与乙型肝炎病变的病程和严重程度有关;SSCP方法是检测HBV DNA前C区基因突变较为简便、快速、经济的方法,适合于对大样本进行研究。     

HBV基因型与核苷类似物抗病毒治疗关系的研究

目的研究延安地区B、C基因型慢性乙型肝炎患者与核苷类似物抗病毒治疗疗效的关系。方法用PCR法鉴定延安地区慢性乙型肝炎患者的HBV基因型,选定B型、C型慢性乙型肝炎患者各60和120例,分为拉米夫定组与阿德福韦酯组,分别给予拉米夫定、阿德福韦酯抗病毒治疗,观察其应用一年抗病毒药物的疗效,对治疗期间的临床资料进行回顾性研究。结果①B型基因与C型基因在拉米夫定抗病毒治疗疗效比较,6、12个月病毒学应答率、血清学应答率之间存在明显的差异,有统计学意义（P〈0.05）;而6、12个月的生化学应答率差异无统计学意义（P〉0.05）。②B型基因与C型基因在阿德福韦酯抗病毒治疗疗效比较：6、12个月生化学应答率、病毒学应答率、血清学应答率差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论延安地区慢性乙型肝炎患者中B基因型对拉米夫定的抗病毒疗效优于C基因型;B基因型、C基因型对于阿德福韦酯抗病毒疗效无区别,提示HBV基因型与核苷类似物抗病毒治疗有相关性。检测HBV基因型对于临床优化慢性乙型肝炎抗病毒治疗方案有一定的意义。     

慢性乙型肝炎患者体内乙型肝炎病毒DNA序列异质性及准种特点的研究

目的 以乙型肝炎病毒(HBV)基因异质性来探讨HBV准种群在慢性感染者中的存在状态。方法应用聚合酶链反应（PCR)法,自18例慢性患者血清中分别扩增前C／C基因、P基因逆转录酶区(RT)、HBV全S区、X基因和全基因组序列,克隆人pGEM Teasy质粒,挑选81克隆进行DNA测序以确定病毒的变异程度。结果除外大段缺失突变的克隆,来源于同一患者前C／C区、RT区、全S区、X区和全基因组不同克隆之间的碱基序列同源性分别为98．0％-99．1％、98．7％-99．3％、97．5％-100％、93．0％-98．20A,和96．6％-97．5％。前C区A83点突变、C抗原内部缺失较为常见,缺失突变、终止替换突变、短序列的插入或缺失突变造成的移框突变在各个区域中均可检出,X基因(核心蛋白启动子区,CP)内部缺失突变不仅导致X蛋白羧基端的多样性,而且调控HBeAg的表达。编码截短型表面抗原中蛋白和缺陷病毒基因亦在患者外周血中。结论 多区域测序结果提示HBV慢性患者体内HBV呈现准种群共存,X区(CP区)内存在热点缺失突变区,CP区的变异可能影响前C蛋白的表达,这些变异可能与患者不良预后有关。病毒蛋白的氨基酸的替换突变表现的个体特异性值得进一步研究。