实时定量PCR检测人全血标本中烟曲霉基因组载量的方法及临床应用

目的建立实时定量PCR（RQ-PCR）快速检测人全血标本中烟曲霉基因组载量的方法及进行初步临床应用。方法基于烟曲霉多拷贝基因ITSl-5．8S基因设计引物和TaqMan探针,用QIAamp^DNA Blood Mini Kit提取烟曲霉基因组DNA,建立20μlRQ-PCR反应体系,对含有不同载量烟曲霉基因组的模拟人全血标本和66份外科发热患者全血标本进行烟曲霉基因组的定量检测。结果检测限为10^-1基因组／μl上机待测液（即约78CFU／ml全血）;检测特异度和灵敏度分别为94．25％和99．04％,阳性预告值和阴性预告值分别为97．63％和97．62％;测定结果的平均相对误差为（3．67±13．19）％;批内及批间平均重复性变异系数分别为（12．38±1．53）％和（16．27±2．72）％;人血标本中烟曲霉基因组平均回收率为（107．81±25．92）％,回收率平均变异系数为（26．24±5．62）％。66份外科发热患者血标本中未检测出烟曲霉基因组。结论RQ-PCR可以快速、特异、灵敏地定量检测人血标本中烟曲霉基因组的载量,且有着较好的准确度与精密度。本研究外科发热患者血中未检测到烟曲霉基因组。     

实时定量PCR快速检测外科发热患者血中白念珠菌载量的方法

目的 建立实时定量PCR(RQ-PCR)快速检测血中自念珠菌(Gandiad albicans)载量的方法,并对可能存在肠屏障损伤和肠道菌移位的外科发热患者标本进行检测.方法 基于白念珠菌基因组单拷贝基因NAG1设计引物和探针;构建并制备质粒做标准品;用QIAamp(R) DNA Blood Mini Kit试剂盒提取白念珠菌基因组DNA;建立20μl TaqMan探针RQ-PCR反应体系;对74份外科发热患者临床标本进行定量检测.结果 引物和探针特异性好;标准曲线R2 值0.9918～0.9985,扩增效率0.88～1.027,检测限为100 拷贝/μl上机检测液(即约1.1×103 cfu/ml全血),仪器检测灵敏度为97.46%,特异度为100%,平均准确性为(99.64±2.08)%,批内及批间重复性的平均变异系数分别为(14.76±2.64)%和(17.85±3.53)%;血标本中白念珠菌基因组平均提取效率为(88.60±5.73)%,提取效率平均变异系数为(11.70±5.36)%;标本于-20℃存放3、6个月后和0时间点定量结果比较,差异无显著性(P=0.267);74份外科发热患者血中白念珠菌的阳性率为2.7%,最高含量约为4.42×103 cfu/ml.结论 RQ-PCR可以快速、灵敏、特异地定量检测血标本中白念珠菌,重复性好,适用于临床日常检验.少数外科发热患者周围血中存在白念珠菌.     

实时定量PCR检测人全血标本中烟曲霉基因组载量的方法及临床应用

目的 建立实时定量PCR(RQ-PCR)快速检测人全血标本中烟曲霉基因组载量的方法及进行初步临床应用.方法 基于烟曲霉多拷贝基因ITS1-5.8S基因设计引物和TaqMan探针,用QIAamp(R)DNA Blood Mini Kit提取烟曲霉基因组DNA,建立20μl RQ-PCR反应体系,对含有不同载量烟曲霉基因组的模拟人全血标本和66份外科发热患者全血标本进行烟曲霉基因组的定量检测.结果 检测限为10-1基因组/μl上机待测液(即约78 CFU/ml全血);检测特异度和灵敏度分别为94.25%和99.04%,阳性预告值和阴件预告值分别为97.63%和97.62%;测定结果的平均相对误差为(3.67±13.19)%;批内及批间平均重复性变异系数分别为(12.38±1.53)%和(16.27±2.72)%;人血标本中烟曲霉基因组平均回收率为(107.81±25.92)%,回收率平均变异系数为(26.24±5.62)%.66份外科发热患者血标本中未检测出烟曲霉基因组.结论 RQ-PCR可以快速、特异、灵敏地定量检测人血标本中烟曲霉基因组的载量,且有着较好的准确度与精密度.本研究外科发热患者血中未检测到烟曲霉基因组.

Abstract：

Objective To establish a real-time quantitative polymerase chain reaction (RQ-PCR) assay for fast detection of Aspergillus fumigatus genome in human whole blood samples and explore its clinical application.Methods The primers and the TaqMan-probe were designed on the basis of the multi-copy ITS1-5. 8S region of the rDNA of Aspergillus fumigatus. The Aspergillus fumigatus genomic DNA were extracted with QIAamp(R) DNA Blood Mini Kit.A 20 μl RQ-PCR amplification system was established, and the simulated blood samples containing various given load of Aspergillus fumigatus genome and the 66 whole blood samples of the surgical febrile patients were examined. Results The detection limit of the RQ-PCR instrument is 10-1 genomes/μl DNA sample,namely 78 CFU/ml whole blood. The specificity and the sensitivity were 94. 25% and 99. 04% respectively; and the positive predictive value and negative predictive value were 97. 63% and 97. 62% respectively. The average relative error of the quantitative results was (3. 67 ±13. 19)%, and the intra- and the inter-assay average coefficients of variation were (12.38 ± 1. 53)% and (16. 27 ±2. 72)% , respectively. The average recovery rate of Aspergillus fumigatus genomic DNA in human whole blood samples was (107. 81 ±25. 92)% , and the average coefficient of variation of the average recovery rate was (26. 24 ± 5.62) % . No Aspergillus fumigatus genomic DNA was detected among the 66 blood samples of the surgical febrile patients. Conclusions The RQ-PCR assay for fast quantitative detection of Aspergillus fumigatus genome in human whole blood samples is of high sensitivity, specificity,accuracy and precision. The Aspergillus fumigatus genome was not detected in this group of surgical febrile patients.     

多重实时定量PCR同时检测人全血中大肠杆菌与白念珠菌基因方法的建立

目的 建立多重实时定量PCR (MRQ-PCR)同时快速检测血中大肠杆菌与白念珠菌DNA的方法,以评估肠屏障损伤可能导致的移位微生物的种类和程度并提供针对性用药的建议.方法 选择大肠杆菌β-右旋半乳糖苷酶基因作为检测大肠杆菌的靶基因设计引物和探针,选择白念珠菌ITS2基因设计引物和探针.采用QIAamp(R) DNA Blood Mini Kit试剂盒提取大肠杆菌与白念珠菌基因组DNA;建立25 μl TaqMan探针MRQ-PCR反应体系;对18份模拟血标本及10份外科发热患者临床标本进行MRQ-PCR检测.结果 引物和探针特异性好,大肠杆菌与白念珠菌标准曲线相关系数分别在0.994～0.999和0.994～0.998,扩增效率分别为0.894～1.022和0.905 ～1.028.标准样品检测限分别为大肠杆菌13.9拷贝/μl和白念珠菌0.8 cfu/μl,两种菌的检测灵敏度分别为100％和99.69％,特异度分别为100％和94.73％,标准品中大肠杆菌与白念珠菌特异基因平均回收率分别为(101.89±5.69)％和(103.74±4.64)％,两种菌基因检测的批内变异系数分别为(13.14±10.27)％和(19.18±8.54)％,批间变异系数分别为(14.35 ±9.34)％和(18.31 ±10.25)％.全血标本中大肠杆菌与白念珠菌特异基因的检出限分别为12 455.2拷贝/ml和800.3 cfu/ml,平均回收率分别为(111.60±11.06)％和(99.96 ±6.16)％,两种菌基因检测的批内变异系数分别为(11.02±5.65)％和(8.14±7.29)％,平均批间变异系数分别为(12.88±7.59)％和(18.62±9.14)％.结论 多重实时定量PCR可以同时快速、灵敏、特异地定量检测人全血标本中大肠杆菌与白念珠菌基因,准确度高、重复性好、节省血标本用量及检测成本、总检测时间缩短,在临床全血标本的真菌与细菌快速鉴别检测、抗微生物药物的针对性应用及疗效评估、肠屏障损伤后果及疗效的评估中有较实用的推广前景.     

实时定量PCR检测人全血中金黄色葡萄球菌DNA方法的建立

目的建立实时定量PCR（RQ—PCR）快速检测人全血中金黄色葡萄球菌DNA的方法,以便早期定量评估肠屏障损伤所致肠道内细菌移位引起或加重的全身感染。方法对15份模拟全血标本及26份外科发热患者全血标本进行RQ—PCR检测。选择金黄色葡萄球菌高度保守的看家基因femA基因作为靶基因设计引物和Taqman探针,建立20ul的RQ—PCR反应体系,采用含靶基因扩增片段的重组质粒建立标准曲线,提取血标本中的细菌基因组DNA。结果引物和探针特异性好,检测限为10^0拷贝／ul（10^3CFU／ml）,灵敏度为99．7％,特异度为94．6％。标准曲线线性关系好,R。在0．9918—0．9997。不同浓度的金黄色葡萄球菌样本检测的平均准确性为（96．25±2．26）％,批内及批间重复性的平均变异系数分别为（8．06±0．07）％和（10．01±4．40）％。全血标本中金黄色葡萄球菌DNA平均回收率为（111．72±20．72）％。临床血标本RQ-PCR检测阳性率为15．4％（4／26）,血培养结果皆为金黄色葡萄球菌阴性。结论RQ—PCR可用于定量检测全血标本中的金黄色葡萄球菌DNA含量,具有快速、灵敏、特异性强、重复性好的优点。     

实时定量PCR检测外科发热患者静脉血中大肠杆菌DNA的方法

目的建立实时定量PCR(RQPCR)检测大肠杆菌DNA的方法,评估临床标本检测效果。方法选择大肠杆菌β右旋半乳糖苷酶基因作为检测靶基因设计引物和探针,采用HighPurePCRTemplatePreparationKit提取基因组DNA,建立20μlTaqMan探针RQPCR反应体系。对26份外科发热患者标本(血标本20份,腹腔引流液3份,胸水2份,胆汁1份)进行荧光RQPCR检测。结果引物和探针特异性好,标准曲线相关系数在0.991～0.999之间。在最低检测限(102拷贝/反应体系)以上,仪器对不同含量大肠杆菌样本检测的平均准确性为(112.19±7.48)%;批内及批间重复性平均变异系数(CV)分别为(16.33±4.80)%和(16.03±7.80)%。血标本中大肠杆菌DNA平均提取效率为(38.40±14.05)%,提取效率平均CV为(20.57±16.92)%。含有同等量大肠杆菌模拟标本存放在-20℃或-70℃6个月内,大肠杆菌DNA拷贝数差异无显著性(P=0.130)。外科发热患者血中大肠杆菌阳性率高达30%,最高含量约为1.24×106个/ml;另外在胆汁及腹腔引流液标本中检测出的大肠杆菌DNA含量明显高于相同患者血中含量。结论RQPCR是一种快速、灵敏、特异、重复性好、能定量起始模板拷贝数的检测大肠杆菌DNA方法,可用于定量检测全血及其他体液标本中大肠杆菌含量。     

临床体液标本侵袭性真菌感染的早期分子学诊断研究

目的 探讨采用PCR方法检测临床体液标本真菌感染的可行性.方法 对60例可疑侵袭性真菌感染者无污染体液标本进行真菌直接镜检及培养,同时应用真菌通用引物ITS4和ITS86对临床体液标本进行PCR检测,分析二者检测结果的差异.结果 临床含真菌体液标本直接进行PCR扩增的片段大小均与阳性对照DNA扩增结果一致.且PCR扩增的阳性率与真菌直接镜检、培养方法阳性率相近[38.3％ (23/60) vs 33.3％ (20/60),P＞0.05].结论 侵袭性真菌感染采用真菌ITS通用引物进行PCR扩增,能准确、快速地检测出致病真菌,其方法对侵袭性真菌感染的早期诊断与预后具有指导意义.     

TaqMan荧光定量PCR检测和鉴别不同血清群脑膜炎奈瑟菌方法的建立及应用

目的 建立TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于脑膜炎奈瑟菌不同血清群菌株的检测和鉴别.方法 设计合成7对引物和TaqMan探针,脑膜炎奈瑟菌种属特异性的基因为ctrA;不同血清群的脑膜炎奈瑟菌特异性基因分别为A群(sacB)、B群(siaD)、C群(siaD)、X群(xcbB)、Y群(synF)、W135群(synG).检测和确定不同探针和引物用于脑膜炎奈瑟菌荧光定量PCR检测的特异性、敏感性,并同时将荧光定量PCR和乳胶凝集方法应用于121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本的检测.结果 ctrA、sacB、siaD(B群)、siaD(C群)、xcbB、synF、synG等7对引物和探针能准确检测和鉴定79株不同血清群的脑膜炎奈瑟菌菌株,检测灵敏性比相应的普通PCR高101～103倍,每对引物和探针反应体系中,能检测的最低全基因组DNA拷贝数分别为8、8、80、8、8、80、8;检测121份疑似脑膜炎奈瑟菌感染患者的脑脊液标本,TaqMan荧光定量PCR检测11份阳性,乳胶凝集方法检测6份阳性.结论 TaqMan荧光定量PCR方法能特异地检测和鉴定不同血清群脑膜炎奈瑟菌,具有较高的灵敏性和快速检测的特点,能提高临床疑似脑膜炎奈瑟菌感染病例的阳性检出率.     

荧光定量RT-PCR检测血清标本中的肠道病毒RNA

[目的]建立一种快速,灵敏,易操作的通用肠道病毒荧光定量RT-PCR检测方法用于血清标本检测。[方法]在肠道病毒5'端的保守区域中选取所有型别肠道病毒一致的基因组序列设计通用引物及Taqman探针。优化反应体系,建立RT-PCR荧光定量检测系统,测定了TCID50(50%组织培养感染剂量/ml)的CoxB3病毒培养液进行10倍稀释以检测最低检测病毒量,用45份心肌炎患者血清标本和122例人群血清标本进行检测。[结果]荧光定量RT-PCR系统对于CoxB3病毒的最低检测量为0.01TCID50/ml并且可以检测到小于1000拷贝/ml的质粒DNA,定量线形范围达到5个数量级,相关系数达到0.993。45份病毒性心肌炎患者急性期血清临床标本中31份阳性,阳性率为68.9%。122份人群血清标本中肠道病毒阳性标本19份,阳性率15.6%。[结论]应用TaqMan荧光定量RT-PCR方法检测血清标本,为肠道病毒的临床诊断及流行病学调查提供了一种快速,高灵敏度的实用方法.     

Taqman MGB探针实时荧光定量PCR检测布鲁菌病的研究

目的 建立血液标本布鲁菌DNA荧光定量检测方法,探讨其临床应用价值.方法 用PUCm-T载体和PCR纯化产物连接,转染DH5a菌,筛选阳性菌落,提取质粒,制作外标准品；在布鲁菌基因组IS711序列设计一对引物和TaqMan MGB探针,严格优化反应物的组成和扩增条件,并对该方法进行评价.结果 建立的布鲁菌DNA荧光定量PCR方法最低检出率为400拷贝/ml；批内误差为1.8％～6.5％,批间误差为2.6％～9.1％；在4.0×102～4.0×108拷贝/ml之间与Ct值具有很好的线性(Ct =-1.391 1 Ln (x) +41.65,r=-0.995 8)；具有较好的稳定性.在布鲁菌临床监测中发现,157份血液标本,用荧光定量PCR检测与临床检查结果(临床阳性、慢性期患者、症状可疑、阳性畜周围人群与重点职业人群(重点人群)的阳性率和阴性对照的符合率分别为90.3％、40％、6.7％、12.2％和100％.结论 建立的荧光定量PCR检测方法能鉴定布鲁菌种属,具有良好的特异性、灵敏度和稳定性.在临床布鲁菌基因诊断方面具有重要意义.     

外科发热患者静脉血中大肠埃希菌DNA实时定量PCR检测与体征及血细胞计数的相关性

目的 定量检测外科发热患者静脉血中大肠埃希菌DNA含量，研究其与体征及皿细胞计数之间的相关性，并比较不同检测方法对血中大肠埃希菌的阳性检出率的差异。方法 以实时定量PCR（RQ-PCR）定量检测40份健康人静脉血标本，确定临床阳性检测限。31例发热患者共72份血标本同时进行常规细菌培养及大肠埃希菌DNA定量检测，比较两种检测方法对血中大肠埃希菌的阳性检出率的差异，两个取血时间点间大肠埃希菌DNA含量的变化，并计算大肠埃希菌DNA含量与体温、心率、白细胞计数、中性粒细胞及淋巴细胞百分比之间的相关性。结果 RQ-PCR定量检测大肠埃希菌DNA阳性率为52．78％（38／72），显著高于细菌培养阳性率2．78％（2／72）（P=0．000）。同一患者两个时间点血标本检测结果显示，静脉血中大肠埃希菌DNA在2～6小时内的升降变化达10～20倍。血中大肠埃希菌DNA含量与体温和心率之间均显著相关（P=0．000），相关程度中度密切（，值分别为0．565和0．546），与白细胞计数、中性粒细胞及淋巴细胞百分比之间无显著相关关系。结论 RQ-PCR检测外科发热患者静脉血中大肠埃希菌阳性率远高于血培养。血中大肠埃希菌DNA拷贝数变化速度较快。血细胞计数不能很好反映血中大肠埃希菌的含量，而体温心率的影响因素较多，因此RQ-PCR能更及时准确反映大肠埃希菌血症的严重程度，有助于对肠屏障损伤导致肠道细菌移位的动态程度或后果进行评估。     

国境口岸航空器医学真菌污染分析

目的对青岛国际机场的出入境航空器携带病原真菌污染分布进行分析及鉴定。方法在航空器不同部位采集样本,采用传统微生物学及分子生物学鉴定技术相结合的方法对航空器携带病原真菌进行鉴定分析。结果在出入境航空器中发现真菌258株,已鉴定出235株,共7个属种,分别属于青霉菌属（39．9％）,曲霉菌属（35．7％）,及其他检出率较低真菌（毛霉属、根霉属、枝孢菌、隐球菌属）。结论分析显示在机舱不同部位病原真菌检出率及类别有显著不同。     

经长期HAART治疗的中国HIV—AIDS患者外周血细胞内HIV-1前病毒DNA的检测及其意义

目的探索NK细胞是否是HIV-1病毒的储存库细胞之一,并观察在长期HAART治疗后,T淋巴细胞及单核细胞内是否仍有HIV-1前病毒DNA存在。方法对15例规范接受HAART治疗4～7年的HIV—AIDS患者采集血标本进行横断面研究。使用磁珠分选法从外周血单个核细胞（PBMC）中分离出T淋巴细胞、单核细胞和NK细胞,通过HIV实时荧光定量检测外周血HIV-1RNA病毒载量和NK细胞、单核细胞、T淋巴细胞内的HIV-1 DNA水平,流式细胞术检测外周CD4＋T细胞数量,对数据进行统计学处理。结果15例接受4～7年[平均（62．45±13．53）个月]HAART治疗的HIV／AIDS患者外周血HIV-1RNA均低于检测下限（〈50拷贝／ml）;T淋巴细胞、NK细胞中和单核细胞中HIV-1前病毒DNA的平均含量分别为2．03±0．48、1．82±0．32和1．754-0．19（10g10拷贝／10。个细胞）;3种细胞中HIV-1DNA阳性（〉50拷贝／m1）者比例分别为6／15、4／15、2／15。结论中国HIV-1感染者外周血中除了T淋巴细胞和单核细胞外,NK细胞也可能是HIV-1的病毒储存库之一。在长期HAART治疗（4～7年）后,尽管表现出明显的抗病毒效果和免疫重建效果,仍然未能彻底清除NK细胞、T淋巴细胞和单核细胞中的HIV-1前病毒DNA。     

艾滋病患者深部真菌感染菌群分布及其耐药性

目的探讨医院住院艾滋病患者深部真菌感染的病原菌特性及其对常用抗真菌药物的敏感度,为临床治疗选用药物提供参考依据。方法采用Bact /ALERT 3D120血培养仪进行真菌培养和检测。根据菌落生长特征,用YBC鉴定卡进行菌种的鉴定与分析;ATB FUNGUS 3 试条进行真菌临床敏感性测定。结果从2 868份不同标本中培养分离出208株深部真菌,不同阳性标本分离菌株构成比依次为：痰34.13%（71株）,脑脊液27.40%（57株）,血12.50%（26株）,粪10.10%（21株）,骨髓7.21%（15株）,尿4.81%（10株）,其他部位标本3.85%（8株）。14例危重患者在多部位分离出2～3种不同种类真菌。208株真菌中,构成比居前5位者分别为：新生隐球菌34.13%（71株）,白假丝酵母菌33.65%（70株）,马内菲青霉菌14.90%（31株）,光滑假丝酵母菌5.77%（12株）,热带假丝酵母菌3.85%（8株）。新生隐球菌、白假丝酵母菌对两性霉素B及5氟胞嘧啶非常敏感（敏感率90.63%～100.00%）;白假丝酵母菌、光滑假丝酵母菌及热带假丝酵母菌对氟康唑与伏立康唑显示45.45%～57.82%的耐药。马内菲青霉菌对两性霉素B及伊曲康唑敏感,敏感率分别为95.80%、84.10%。结论艾滋病患者深部真菌感染病原菌较正常人群分布特殊,加强艾滋病患者不同部位病原标本的送检及监测,对临床合理使用抗真菌药物,减少耐药真菌的产生有特别意义。     

建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体

目的建立染料法荧光定量PCR检测恙虫病东方体。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计特异性引物,建立染料法(SYBR green I)实时荧光定量PCR,评估其灵敏性及特异性;并对恙虫病东方体鸡胚培养物、东方体感染小白鼠脏器标本以及恙虫病病人血样等多种样本进行检测。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r2=0.99),灵敏性评估显示20μl体系单PCR反应管靶基因大于28个拷贝即可被有效检测,最低检出浓度为2拷贝/μl,比普通PCR检测方法提高1~2个数量级,并且具有较好的重复性;建立的SYBR I染料法具有良好的特异性,与立氏立克次体R株等其他5种立克次体,以及被检测的其他几种病原菌DNA模板均不发生特异性扩增;用建立的染料法对东方体鸡胚培养物、东方体感染动物脏器,以及采集的现场恙虫病病人血样共59份标本进行检测,其中57份检出阳性。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肾脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体检出量最多,肝脏和肾脏次之,血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立荧光定量PCR方法均具有很高的特异性和敏感性,适合各种样本中东方体的快速检测,可用于实验室的快速诊断。     

经阴道子宫肌瘤剔除28例临床分析

目的：探讨经阴道子宫肌瘤剔除术的可行性。方法：回顾分析28例经阴道子宫肌瘤剔除术的临床资料。结果：28例患者手术成功。平均手术时间（68±31.5）min,平均出血量（176±168.5）ml,术后平均出院时间（8.6±4.7）d,术后排气恢复时间平均为（1.6±0.4）d,术后病率为28.6%。结论：经阴道子宫肌瘤剔除术具有手术创伤小、安全性好、术后恢复快、住院时间短等优点,是一种适用于基层医院推广应用的微创手术。