65株解脲支原体的耐药性检验

为指导临床合理用药 ,提高疗效 ,将6 5株解脲支原体 (Ｕｕ)临床分离株对 10种抗菌药物的敏感性进行测定。各取 0 1ｍｌ培养Ｕｕ的培养液于 96孔聚苯乙烯板中 ,用倍比稀释法将每种抗菌药物分别配制成 12 8～ 0 0 6 12 5ｍｇ/Ｌ。然后 ,每孔分别接种Ｕｕ培养物 (含菌量约为 10 8ＣＣＵ/Ｌ) 0 .1ｍｌ。设不含药物的培养液为对照。轻轻摇匀后 ,置 37℃5 %ＣＯ2 培养箱中培养 48ｈ。根据培养基的颜色判断结果。培养基中的酚红指示剂由橘黄色变成粉红色为Ｕｕ生长 ,表示所加的药物对Ｕｕ无抑制作用。以 48ｈ仍不出现颜色变化的最小药物浓度为最…     

内毒素对肺动脉内皮细胞的损伤及产生前列环素的影响

内毒素在革兰氏阴性杆菌感染引起休克的发生发展过程中起重要作用,而肺组织的瘀血、水肿并发展为呼吸窘迫综合征是休克病人难以救治的重要原因。因此,内毒素对肺血管内皮的损伤及产生前列环素的影响是一个值得研究的问题,本实验用培养的牛肺动脉内皮细胞进行,24孔板内每孔细胞数约2×10~5个,每孔加铬酸钠~(51)Cr 2μCi,37℃孵育40分钟,弃上清,冲洗后加入含内毒素50μg/ml的培养基,37℃孵育30分钟,取上清在γ计     

肾上腺髓质素加强高糖对自发性高血压大鼠胰岛β细胞的毒性作用

探讨高糖是否对自发性高血压大鼠 (SHR)和 Wistar- Kyoto(WKY)鼠胰岛 β细胞分泌功能具有抑制作用 ,肾上腺髓质素 (adrenomedullin,AM)能否加强此抑制作用。选取 6周龄 SHR鼠及 10周龄 WKY鼠各 10只 ,分离胰岛放入 12孔培养板内 (90个胰岛 /孔 )培养。先以含 5 .6 m mol/ L(m M)葡萄糖的 RPMI16 4 0培养基培养 1h,取出培养液。然后用含 2 0 m M葡萄糖及不同浓度 AM(分别是 0 ,10 - 8,10 - 7,10 - 6 M)的 RPMI 16 4 0培养基培养 1小时 ,取出培养液 ,放射免疫分析 (RIA)方法测定两次培养液的胰岛素含量。 SHR鼠的胰岛细胞经用不加 AM含 2 0m M葡萄糖的 16 4 0培养基培养 1h后 ,与用含 5 .6 m M葡萄糖的 16 4 0培养基培养 1h相比 ,其培养液中胰岛素含量明显降低 (分别是 19.9± 6 .6 vs6 0 .9± 33.6 m U/ L,P<0 .0 5 )。当用含 2 0 m M葡萄糖及不同浓度 AM的 16 4 0培养基培养时 ,随着 AM浓度的增加 ,培养液中的胰岛素含量进一步减少 (19.9± 6 .6 vs2 2 .2± 8.0 vs2 1.5± 5 .6 vs17.9± 3.6 m U/ L)。对照组 WKY鼠的胰岛细胞经上述相同方法处理后得出相似的结果。但 WKY鼠与 SHR鼠相比 ,其胰岛细胞经用含 5 .6 m M及 2 0 m M葡萄糖培养基培养后培养液中的胰岛素含量较高 (P<0 .0 1)。用高糖培养基培养     

埃尔托型霍乱弧菌分型噬菌体VP5受体与35kDa外膜蛋白有关

噬菌体 -生物分型将埃尔托 (El Tor)霍乱弧菌分成具有流行潜力和致病性的流行株以及无流行潜力的非流行株。研究霍乱弧菌分型噬菌体的受体 ,为分析菌株感染差异及分型分子基础的作用提供依据。分型噬菌体VP5的宿主菌是埃尔托霍乱弧菌 2 4 77,它的受体是含量丰富的外膜蛋白。取一定浓度的外膜蛋白 ,分别于 37℃、5 0℃、6 0℃、70℃、80℃、90℃、10 0℃作用 5min ,与 10 5PFUVP5混匀 ,37℃温育 15min ,剧烈振荡 10min ,噬斑计数。吸附率分别为 10 0 %、10 0 %、基金项目 :国家重大基础研究发展规划(973计划 )项目 (G19990 5 410 2 )作者…     

ox-LDL诱导巨噬细胞TNF-α的时序表达

目的 :细胞因子在动脉粥样硬化发生发展过程中扮演重要角色。本课题旨在研究氧化型低密度脂蛋白 (ox -LDL)致巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α(Tumornecrosisfactor,TNF -α)的表达时序 ,以探讨TNF -α可能在动脉粥样硬化发生过程中的作用。方法 :人巨噬细胞株 2 8SC(由ATCC提供 )。用含有 10 0mg/L青霉素、10 0mg/L链霉素和 10 %胎牛血清的RPMI 16 4 0培养基于37℃ ,5 %的CO2 中培养。在培养基中加入终浓度为 15 0mg/L的ox-LDL ,37℃共育后 ,分别于 0h、3h、6h、12h、2 4h、36h收集细胞 ,分别为对照组、ox -LDL 3、ox -LDL 6、ox …     

罗红霉素对中国仓鼠HGPRT位点突变V_(79)细胞基因突变试验

鉴定V_(79)细胞株克隆形成率、群体倍增时间、自发突变频度和无微生物及技原体污染。中国仓鼠肺V_(79)细胞在50ml培养瓶中接种1×10cell/5ml,37℃ 5％CO_2培养4h。加入不同浓度罗红霉素,终浓度为160、80、40、20、10、5和25μg/ml,培养5h后,换新鲜1640完全培养液(小牛血清10％),继续培养19h,接种于24孔细胞培养饭200cell/1ml/孔,37℃5％CO_2培养7天,     

乳酸菌的黏液黏附特性及其影响因素

食物源乳酸菌发挥有益作用的前提是能在胃肠道定植。定植可能和乳酸菌细胞表面性质有关。用大鼠或鸡小肠黏液作为黏附基质，研究了10株乳酸菌的黏附性和细胞表面性质。处死的大鼠或鸡小肠立即用PBST（含0．05％Tween 20，pH7．3）轻洗，刮取黏液，匀浆。两倍体积无水乙醇沉淀黏蛋白，冻干。以1mg/ml溶解于碳酸钠．碳酸氢钠缓冲液（pH9．6），5000g离心15min，分装澄清的上清液。取150μl包被于96孔板微孔。细菌培养过夜（37℃）后离心收集，用PBS洗2次。悬浮于含1％ Tween20的PBS（细菌浓度为10^8CFU/ml），     

变形链球菌耐酸性缺陷株的构建

变形链球菌 (简称变链菌 )是主要的致龋菌 ,耐酸性是其关键的毒力因子 ,但对其基因调控机制并未明了。本实验欲用转座子Tn917随机诱变变链菌野生株UA15 9,筛选耐酸性变异的突变株 ,以便于找到一个与耐酸性相关的调控基因。本实验所用转座子Tn917的载体为pTV1 OK ,试验流程如下 :将pTV1 OK转化入变链菌野生株UA15 9中 ,转化子在含红霉素和卡那霉素的THYE液体培养基中 2 8℃培养 4 8h后 ,饱和菌液 1∶10 0或 1∶2 0 0稀释于新鲜预热的THYE培养基中 ,4 2℃水浴中培养过夜后 ,含质粒的转化子有 3种转归 :(1)质粒丢失而未发生转座 ,恢复…     

影响人α-突触核蛋白基因在原核细胞中表达因素的研究

目的　研究影响人α 突触核蛋白 (α synuclein)基因在原核细胞中表达的常见因素 ,以提高其在原核细胞中的表达量。　方法　将重组质粒ProEXNACP转化进入到DH5α 大肠杆菌体内 ,观察诱导剂IPTG浓度、诱导时间、诱导温度、诱导培养基、诱导初始菌浓度及诱导中pH值变化等因素对蛋白表达产量的影响 ,用SDS PAGE梯度胶电泳分析 ,考马斯亮蓝染色进行比较研究 ,同时检测pH值 ,观察其变化。　结果　诱导剂IPTG浓度对诱导蛋白产生的影响不大 ,诱导过程中pH值变化较小 ,而诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类对诱导产生α 突触核蛋白有较大影响。其中 ,以LB培养基 ,37℃ ,180r min诱导 1～ 2h产生α 突触核蛋白的量最大。　结论　诱导剂IPTG诱导ProEXNACP/DH5α大肠杆菌产生α 突触核蛋白的量与诱导时间、温度、初始菌浓度和培养基的种类有明显的关系。初始菌A590 =0 5～ 0 8,LB培养基 ,37℃ ,大通氧量 (180r min以上 ) ,1～ 2h诱导可作为大量提取、纯化α 突触核蛋白的首选条件。     

在半固体培养基上制备单克隆抗体

最近,我们在半固体培养基上成功地建成了抗人体绒毛膜促性腺激素(hCG)及抗人体黄体生成素(hLH)两种单克隆抗体细胞株,制备了相应的单克隆抗体。其要点是将融合细胞悬浮于15ml IMDM培养基(含53.3％胎牛血清、2.66％HAT、8×10~6胸腺细胞/ml、133μg/ml脂多糖)中,再与25ml含2％甲基纤维素的IMDM培养基充分混匀,分装至直径35mm的塑料平皿中,每皿1.5ml,37℃,CO_2孵箱内培养。1周后,即可在每个平皿上看到近百个细胞集落。将各细胞集落挑至96孔板中再培养,并用ELISA检测,就可筛选出阳性克隆,进而建立单抗细胞株。与目前沿用的有限稀释法比较,半固体培     

褪黑激素对17—β—雌二醇诱致的大鼠垂体催乳素瘤细胞增殖的抑制作用

观察不同浓度的褪黑激素 (Melatonin ,MLT)对原代培养的大鼠垂体催乳素瘤细胞增殖的影响。用 80～10 0g体重的雄性Sprague Dawley(SD)大鼠 ,皮下埋置雌二醇诱致垂体催乳素瘤 (prolactinoma)形成后 ,取出瘤体 ,经消化、过滤、离心 ,用SFFD培养基重悬细胞 ,得细胞悬液 ,浓度为 0 75× 10 6/mL ,转入 2 4孔培养板中并加入相应剂量的MLT使其终浓度 (mol/L)分别为 10 -5、10 -7、10 -9、10 -11和 10 -13 ,另设空白对照组 ,于 37℃、5 %CO2 条件下培养 1h ,再在每孔中加入 2 μCi [3H] TdR继续孵育 2 4h后测counts/min值。结果显示 ,在对照组和各剂量 (mol/L)MLT用药组 10 -5,10 -7,10 -9,10 -11和 10 -13 的 [3H]-TdR掺入率分别为 2 0 38 75± 186 84,142 1 75±6 4 49,12 38 2 5± 6 1 72 ,92 4 0 0± 6 4 44 ,10 33 2 5± 12 7 2 2和 110 3 2 5± 15 1 5 3counts/min。表明 10 -5～10 -13mol/L的MLT能有效抑制 [3H] TdR在原代培养的垂体催乳素瘤细胞中的掺入 ,P <0 0 0 1。其中 ,以 10 -9mol/L的MLT的抑制作用最强 ,达 5 4 6 8%。提示在培养条件下 ,10 -5～ 10 -13 mol/LMLT能有效地抑制E2 诱导的垂体催乳素瘤细胞的增殖。     

利用杂交瘤建立三株分泌抗破伤风类毒素单克隆抗体细胞的实验研究

以破伤风类毒素疫苗免疫Balb/c小鼠6次,每次间隔10—15天,末次免疫后三天取小鼠脾脏于铜网中研磨成单个细胞,按脾细胞与SP2/0瘤细胞的比值为10:1(脾细胞1.5×10~3,SP2/0瘤细胞为1.5×10~7)用50％PEG1000进行细胞融合,以Balb/c小鼠腹腔细胞为饲养细胞,于HAT培养液中将融合细胞分种于4块16孔大孔板(天津产)内,放入水封密闭的自制培养合中,充入5％Co_2混合气,37℃培养。培养5天后第一次换液,以后每3天观察换     

噻唑蓝代谢比色分析法用于存活心肌细胞的测定

应用培养的心肌细胞进行实验研究 ,常测损伤细胞释放的酶的活性作为观察指标。我们介绍用于存活心肌细胞测定的噻唑蓝代谢比色分析方法 ,并以酶测定法为对照用于维拉帕米 (ｖｅｒａ ｐａｍｉｌ,Ｖｅｒ)对心肌细胞作用研究 ,了解该方法是否可靠。1　方法1 1　比色分析　弃培养基后 2 4孔板每孔加 2 0 0 μｌ、2 5ｍｌ培养瓶加 1 6ｍｌ用ＰＢＳ配制的 2 %噻唑兰溶液 ,37℃静置4ｈ ,弃代谢后液体加二甲基亚砜每孔6 0 0 μｌ、每瓶 5 0ｍｌ,振荡显色后测495ｎｍ处吸光值 (Ａ4 95)。1 2　比色值与细胞数的关系　接种 2 ,4,6 ,8,10 ,12× 10 5个…     

NF-κB"decoy"寡核苷酸对LPS诱导巨噬细胞TNF-α和IL-6表达的影响

目的 :研究NF -κB“decoy”寡核苷酸 (ODNs)对LPS诱导小鼠巨噬细胞株J774 1细胞的TNF -α和IL - 6表达的影响 ,探讨F -κB“decoy”寡核苷酸防治LPS诱导急性炎性损伤的可行性。方法 :巨噬细胞株J774 1细胞接种于 6孔板中 ,4× 10 5个细胞/孔 ,37℃、5 %CO2 培养过夜 ,待细胞汇合至 80 % ,用无血清、无抗生素 16 4 0培养液洗涤细胞两次后随机分为 4组。内毒素刺激组 :用含 1mg/LLPS的培养液刺激 ,不加治疗 ;NODN治疗组 :用含 1mg/LLPS的培养液刺激 3h ,然后用脂质体介导 1μmol/L(终浓度 )NF -κB“decoy”ODNs治疗 ;SO…     

SARS冠状病毒在Vero-E6细胞中的生活周期分析

冠状病毒家族生活周期的基本程序包括 :病毒吸附 ,配体 受体分子介导的病毒包膜与宿主细胞膜的融合、脱壳 ,遗传物质的复制、转录、蛋白合成 ,病毒装配和释放。对病毒生活周期的了解 ,是开发抗病毒药物 ,研究药物作用机理的前提。我们通过病毒滴定、荧光定量PCR等方法 ,确定SARS CoV在Vero E6中的吸附、复制、释放的时间及对应的病毒量。把SARS冠状病毒毒株F 6 9稀释为10 0TCID50 / 10 0 μl,按照 10 0 μl/支接种到Vero E6细胞管中 ,营养液为含 10 %胎牛血清MEM ,分别在 33℃、35℃、37℃ ,5 %CO2 培养箱中培养 ;于 2、4、6、8…     

壳聚糖对幽门螺杆菌外膜屏障功能的影响

研究壳聚糖 (即脱乙酰壳聚糖 ,Chi tosan)对Hp外膜屏障功能的影响 ,以探讨壳聚糖抗Hp的作用机制 ,以 6种抑菌作用较好的壳聚糖溶液 ,3种 70 %脱乙酰、3种 88.5 %脱乙酰为试验材料。将Hp标准菌株SydneyStrain 1(SS1)、NCTC116 39、NCTC116 37加入上述壳聚糖溶液中 ,细菌浓度为 10 8CFU ml,将每种壳聚糖分别与Hp菌液加入 2 4孔加样板中 ,每孔 2ml,每种溶液做 5孔 ,在 37℃和微需氧条件下 ,12 0r min振荡 ,4 8h后取出孔内液 ,30 0 0r min离心 10min后 ,取上清液分别测葡萄糖含量、天门冬氨酸氨基转移酶 (AST)和γ 谷氨酰转肽酶(GGT)…     

乳杆菌对肠上皮样细胞HT-29黏附的研究

乳杆菌是人和动物肠道内的重要的生理性有益菌 ,它具有维持胃肠道正常的微生态平衡的作用。本文采用体外细胞培养以及形态学观察的方法对乳杆菌的黏附特性进行研究 ,并将乳杆菌经过热、胰酶、蛋白酶及过碘酸钠等处理 ,以观察这些因素对乳杆菌黏附的影响。将HT 2 9细胞种于含 10 %新生牛血清的DMEM细胞培养液中 ,在 37℃ ,10 %CO2 培养箱中孵育 ,待长至单层后 ,细胞用灭菌的PBS(pH7.4 )漂洗 2次后在每孔中加入 1ml乳杆菌的菌悬液 (细菌浓度为 2～ 4× 10 8 ml)和 1ml新鲜的DMEM细胞培养液。于 37℃ ,10 %CO2 孵育1h ,用灭菌的PBS漂…     

幽门螺杆菌感染BALB/c小鼠模型的研究

随着对幽门螺杆菌 (Ｈ .ｐｙｌｏｒｉ)疫苗、致病机理、药物筛选等方面研究的深入 ,人们越来越多地需用动物模型。我们用含有ｃａｇＡ和ｖａｇＡ基因阳性的Ｈｐ株ｓｙｄ ｎｅｙｓｔｒａｉｎ1 (ＳＳ1 )感染ＢＡＬＢ ｃ小鼠 ,作Ｈｐ慢性感染小鼠的动物模型 ,试验用空肠弯曲菌琼脂基础培养基培养 ,微需氧条件下 37℃培养 3～ 5ｄ。ＳＰＦ级ＢＡＬＢ ｃ小鼠 40只 ,雌性 ,7～ 8周龄 ,重 17～ 2 0克 ,分实验组、对照组。实验组动物模型灌喂Ｈ .ｐｙｌｏｒｉ菌液 ,0 4ｍｌ 只 (每ｍｌ约含Ｈｐ 10 9条 ) ,连续 5次 ,10ｄ完成 ,对照组动物则不作相应…     

人腮腺细胞分离培养的初步观察

目的从人体腮腺组织分离培养获得具有体外增殖能力的涎腺细胞。方法取成人腮腺良性肿物切除的腮腺组织,将组织块在无菌条件下剪出小腺叶,剪成1 mm2大小碎块。用质量浓度10％的Ⅰ型胶原酶10 ml消化20 min,用质量浓度0．25％胰蛋白酶10 ml消化15 min。收集2次消化细胞悬液,离心获得细胞沉淀。以15 ml含用质量浓度10％胎牛血清、2 mmol／L L-谷胺酰胺、100μg／ml链霉素、100 U／ml青霉素、5μg／ml人胰岛素、5μg／ml氢化考的松、2μg／ml异丙肾上腺素的DMEM和F12培养基各占50％的培养液重悬细胞沉淀,计数细胞总量为2．5×105。在预先铺被鼠尾胶原的6孔板的3个孔中,每孔播种细胞悬液5 ml。培养板置37℃、体积分数5％CO2,饱和湿度条件培养箱中培养。     

蝌蚪提取液诱导HL-60细胞凋亡及相关基因的表达

以往实验证明蝌蚪提取液 (T871)具有抑制肿瘤细胞生长并诱导其分化的作用[1 ] 。为进一步探讨蝌蚪提取液的抗肿瘤作用 ,本实验观察了T871诱导人早幼粒白血病细胞系(HL 6 0 )细胞凋亡作用及其凋亡过程中相关癌基因的变化。1　材料和方法1 1　人早幼粒白血病细胞系 (HL 6 0 )细胞的培养 :用含 10 %胎牛血清的RPMI 16 4 0培养基培养 (含青霉素 10 5U L ,链霉素10 5U L ,L 谷氨酰胺 2mol L)。临用前用 8%NaHCO3调pH至7 0～ 7 2 ,37 0℃ ,饱和湿度 ,5 %CO2 条件下悬浮培养。1 2　蝌蚪提取液 (T871)的制备 :取池塘黑色有尾无腿活蝌蚪(经…