湖北省首例输入性疟疾混合感染的实验室诊断分析

目的应用多重巢式PCR技术对一例输入性疟疾混合感染病例进行诊断和鉴定。方法采集镜检初诊为输入性卵形疟患者血样,进行疟疾快速诊断试剂检测、显微镜镜检复核、多重巢式PCR检测及测序分析。结果该患者经快速诊断试剂检测结果为非恶性疟原虫阳性;镜检复核查见寄生于红细胞内的疟原虫环状体、大滋养体和配子体,根据形态鉴定为卵形疟;多重巢式PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,在760bp和205bp处有特异性扩增条带,测序后经Blast比对,分别与Gen Bank数据库中卵形疟原虫变异亚种和恶性疟原虫部分序列的一致性为99.00%。结论该患者经多重巢式PCR和序列分析确诊为湖北省首例输入性卵形疟原虫变异亚种与恶性疟原虫混合感染病例。     

疟疾四重巢式PCR检测方法的建立

目的建立一种能同时检测4种疟疾的多重巢式PCR检测方法。方法以4种疟原虫为研究对象,提取全血样本核酸,采用疟原虫18SSU r RNA作为分子标记,合成通用引物和4种疟原虫特异性引物,建立和优化四重巢式PCR反应体系。结果建立的方法在原虫之间无交叉反应,检测敏感性可达102copies/μl,经对随机选取的口岸发热样本进行检测,35份血液样本中,检出恶性疟13例、间日疟7例、卵形疟1例、以及恶性疟和间日疟的混合感染2例,阳性率为65.7%;比镜检的阳性率54.3%高,尤其是检出混合感染病例比例高,并对检测结果进行测序验证。结论建立的四重巢式PCR能同时检测4种不同疟原虫引发的疟疾,具有较高的特异性和敏感度,适合于口岸输入性疟疾的快速检测。     

太原市1例输入性卵形疟的处置及分析

目的 对太原市1例输入性卵形疟病例进行流行病学调查、处置和分析，探讨赴疟疾流行区的出入境重点人群疟疾防控策略，为口岸疟疾防控工作提供参考。方法 对1例疑似疟疾病例进行流行病学调查，采集外周血制作血涂片镜检和血常规检测，用快速检测试剂条检测疟原虫抗原，实时荧光PCR方法对样本中疟原虫进行分型。结果 该病例有低热、头痛症状，有高疟区工作、多次罹患疟疾流行病学史，血涂片镜检可见疟原虫配子体、环状体，疟原虫抗原快速检测为阳性，荧光定量PCR检测结果为卵形疟。根据WS 259—2015《疟疾的诊断》，诊断为输入性卵形疟。结论新冠肺炎疫情常态化背景下，须重视疟疾高流行区出入境重点人群的疟疾防控与宣教工作，加强口岸多病共防，巩固消除疟疾成果，防止输入再传播。     

国境口岸疟疾快速联合检测方法应用评估

目的对疟疾快速检测方法的联合应用进行评价,探索适用于口岸的疟疾快速检测方法。方法选取来源于中国科学院寄生虫病研究所的疟原虫镜检阳性滤纸血样本,其中30例恶性疟,28例间日疟和20例正常人对照样本;同时使用检测疟疾的实时荧光PCR方法、交叉引物恒温扩增方法、胶体金技术对其进行检测;分析各方法检测的敏感性和特异性。结果实时荧光PCR法检测恶性疟原虫的灵敏度高于交叉引物恒温扩增法和胶体金法(P值分别为0.019、0.043,P<0.05);对低原虫密度的恶性疟样本(原虫密度10～100及101～1000个/μl),实时荧光PCR法检测的灵敏度较高,交叉引物恒温扩增法和胶体金法对于低原虫密度的恶性疟样本检测灵敏度显著低于PCR法;交叉引物恒温扩增和胶体金法联合检测在恶性疟各原虫密度下的灵敏度均高于使用单一方法的灵敏度,与实时荧光PCR法的灵敏度比较,差异无统计学意义(各原虫密度下,两者比较的P值分别为0.29、0.302、1.000、1.000,P>0.05)。实时荧光PCR法对间日疟样本检测灵敏度较高,交叉引物恒温扩增和胶体金法的灵敏度显著低于实时荧光PCR法,两者共检能提高检测的灵敏度。结论交叉引物恒温扩增法和胶体金法联合检测,可以较好地筛选出各种原虫密度的感染者,该联合检测方法的灵敏度和特异性与实时荧光PCR法相当,适合国境口岸对疟疾现场快速检测的要求。     

1例输入性卵形疟原虫实验室检测

目的对1例输人性疑似疟疾患者的血样进行实验室确诊。方法首先制备血涂片,吉姆萨染色后镜检疟原虫;其次对血样进行RDT检测;最后利用疟原虫属特异性（通用型）和4种疟原虫种特异性的巢式PCR和多重PCR检测方法,对该血样进行分子生物学检测及分型。结合分子生物学检测结果,再对血片进行镜检复核。结果初次镜检结果为间日疟原虫,RDT结果为阴性。巢式PCR检测结果,仅扩增出预期大小约800bp的卵形疟条带;多重PCR（Pf／Pv）检测无特异性条带产生。重新对薄血膜复核镜检,改判为卵形疟原虫。结论综合巢式PCR、多重PCR、RDT和镜检等检测结果,确诊该患者为卵形疟原虫感染。     

疟疾的实时荧光PCR快速检测方法

目的:建立疟疾的实时荧光PCR检测方法并用于疟疾的快速检测。方法:设计了疟原虫通用型实时荧光PCR检测的引物和探针,建立了疟疾的实时荧光PCR检测方法。对40份疟疾镜检阳性样本和20份镜检阴性样本进行实时荧光PCR检测,并和巢式PCR方法检测结果进行了比较。结果:疟疾实时荧光PCR检测速度快,20分钟即可完成。40份镜检阳性样本的荧光PCR检测均为阳性,2份样本的巢式PCR结果为阴性;20份镜检阴性样本中有3份样本为实时荧光PCR阳性,其余17份样本为实时荧光PCR阴性,与疟疾巢式PCR检测结果相同。结论:该实时荧光PCR方法检测速度快,特异性强,准确性高,阳性率高,不易漏检,适用于疟疾的快速检验,这对防止该病在国境口岸的传入提供了技术依据。     

基因扩增检测四种感染人的疟原虫种类、数量的方法

目的建立对四种感染人的疟原虫种类、数量进行基因检测的方法。方法根据恶性疟、三日疟、卵形疟、间日疟的18SrRNA基因序列,设计属、种特异性引物和TaqMan探针,用荧光定量扩增反应确定标本中的基因拷贝数,用电泳区别各种疟原虫,并对2份疟疾血样进行检测。结果建立的检测方法对疟疾血样进行检测,荧光定量PCR具有良好的反应性,通过电泳能区分检测标本中的疟原虫株。结论建立的方法能够特异而灵敏地检测出标本中疟原虫的种类、数量,适合疟疾防治检测的需要。     

逆转录聚合酶链反应检测疟原虫混合感染的研究

〔目的〕建立在同一反应体系中能同时检测和鉴定恶性疟、间日疟的一步逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测方法,并用于国境口岸归国劳务人员的疟疾检测。〔方法〕以疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计恶性疟原虫和间日疟原虫的上游通用引物和各自的下游特异性引物,在同一反应体系中同时扩增恶性疟原虫和间日疟原虫的特异片段,对疟疾患者的PCR产物进行序列测定和分析。〔结果〕用建立的RT-PCR检测方法对广东口岸回国劳务人员中发现的2名疟疾患者的不同采样时间的全血进行检测,2006年10月和2007年1月采集的样本被分别扩增出预期大小为360bp和450bp特异扩增带,推测2名患者为恶性疟原虫和间日疟原虫的混合感染,其在入境时处于恶性疟的发作期和间日疟的潜伏期,均属于典型的集体输入性疟疾案例。〔结论〕RT-PCR检测疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,对国境口岸疟疾诊断、镜检质量控制和流行病学研究具有较大的实用价值。     

4种疟原虫核酸通用型微滴式数字PCR检测方法的建立

目的建立疟原虫微滴式数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)检测方法。方法根据疟原虫18S rRNA基因保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,用于ddPCR方法建立。优化dd PCR的退火温度、引物和探针浓度后,比较ddPCR和实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)灵敏度和重复性,并对4种疟原虫阳性样本进行检测。结果建立的ddPCR方法特异性良好,灵敏度可达到2.3拷贝/μl,重复性良好。13份经qPCR检测的阳性样本,ddPCR检测也均为阳性,正确率达100%;5份经一个疗程青蒿素为基础的联合疗法治疗后的疟疾病人样本,qPCR检测均为阴性,dd PCR检测发现其中1份阳性(3.8拷贝/μl)。结论建立的ddPCR能够高度敏感、特异地检测人类4种疟原虫核酸。     

1例输入性三日疟原虫病例实验室检测

目的:对1例输入性疑似疟疾患者的血样进行实验室检测。方法:首先制备血涂片,吉姆萨染色后镜检疟原虫;其次对血样进行RDT检测;最后利用疟原虫属特异性(通用型)和4种疟原虫种特异性的巢式PCR,对该血样进行分子生物学检测及分型。结果:镜检结果为三日疟原虫,RDT结果为非恶性疟感染。巢式PCR检测结果,仅扩增出预期大小约140 bp的三日疟条带。结论:综合巢式PCR、RDT和镜检等检测结果,确诊该患者为三日疟原虫感染。     

口岸适用性登革病毒检测模式的建立

目的优化我国口岸登革热检测模式。方法考核登革热快速检测试剂(胶体金法)和实时荧光定量PCR试剂(通用型及分型)的检测性能,再将两种方法联合应用于口岸登革热检测,在口岸现场完成胶体金快速筛查,在实验室完成确认。结果利用8份不同亚型的登革病毒阳性血清进行考核,胶体金法和实时荧光定量PCR的检测灵敏度均为100.00%。2019年1-6个月,在厦门口岸收集了108份入境发热旅客的血液样本,用实时荧光定量PCR方法从中检出25份登革病毒阳性,用胶体金法检出24份;胶体金法漏检1份,符合率为96.00%。结论初筛和确认相结合的检测方法能提高登革热疫情时登革病毒的检测效率,满足口岸登革病毒快速筛查的需求。     

西湖区首例输入性卵形疟病例诊疗分析

目的分析杭州市西湖区首例输入性卵形疟病例诊疗过程。方法收集病例资料和流行病学资料,采集患者抗凝血样,结合镜检和巢式PCR检测结果确诊后规范治疗。结果该患者曾在非洲尼日利亚务工6年,有疟疾发作史,回国后30 d出现发热等症状,经外周血涂片镜检和PCR检测诊断为卵形疟,随后给予磷酸氯喹片3 d加磷酸伯氨喹片8 d疗法治疗后,患者痊愈。结论根据镜检和PCR检测结果,确诊该病例为卵形疟原虫感染。     

大连口岸首例输入性基孔肯雅热病例的实验室检测和确认

目的对大连口岸1名入境发热者的血液样本进行检测和确认,为输入性基孔肯雅热疫情的处置提供技术支撑。方法利用核酸检测方法对入境旅客血液样本进行基孔肯雅病毒、登革病毒、寨卡病毒、黄热病毒及疟原虫等虫媒传染病病原体进行筛查。结果经检测确认,该样本基孔肯雅病毒核酸阳性,特异性引物扩增获得序列与已知基孔肯雅病毒核酸序列同源性达99.61%。结论大连口岸存在基孔肯雅热输入风险,应加强国境口岸基孔肯雅热防控。     

一例输入性恶性疟和卵形疟混合感染病例调查

目的调查黄岩区一例输入性恶性疟和卵形疟混合感染病例,为疟疾防控提供参考。方法收集病例诊治和流行病学调查资料,采集病例抗凝血作镜检和巢式PCR检测。结果该病例在赤道几内亚务工期间有疟疾发作史和治疗史,在回国后第1天即出现寒战、发热、头痛等疟疾典型临床症状,镜检确诊为恶性疟;给予青蒿琥酯针剂和双氢青蒿素哌喹片治疗后,症状消失。此后在距上次发作的第110天又再次发病,疟疾快速诊断试纸(RDT)检测阴性,镜检误诊为间日疟;后经浙江省疾病预防控制中心巢式PCR检测,判定前后两次发病分别为恶性疟原虫和卵形疟原虫感染。结论该病例是一例输入性恶性疟和卵形疟混合感染病例,今后应加强疟疾类型的鉴别诊断能力,防止漏诊误诊。     

快速检测试剂条、镜检和PCR在疟疾诊断中的应用研究

目的采用快速检测试剂条（rapiddiagnostictest,RDT）、镜检及聚合酶链反应（polymerasechainreac-tion,PCR）,3种检测方法进行疟原虫检测,比较3种方法在疟疾诊断中的敏感性、特异性,为科学分析检测结果和探究RDT能否在基层替代疟原虫镜检提供依据。方法收集安徽省2012年1月～2013年3月确诊以及疑似病例抗凝血148份,血片148张,采用RDT进行检测,并与镜检法和PCR的结果对比分析其敏感性与特异性。结果148份血样采用RDT、镜检和PCR3种方法检测结果阳性率分别为43．24％、36．49％、37．84％,经配对x2检验RDT阳性率高于镜检和PCR;镜检和PCR均检出2例卵形疟,而RDT结果为阴性;以镜检为标准,对间日疟和恶性疟进行分析得出,RDT的敏感度为100％,特异度87％,阳性预测值81％,阴性预测值100％;以PCR为标准,对间日疟和恶性疟进行分析得出,RDT的灵敏度为100％,特异度89％,阳性预测值84％,阴性预测值100％。3种方法均检出间日疟16例,而对恶性疟分别为RDT检出48例,镜检检出36例,PCR检出38例。结论RDT对间日疟和恶性疟敏感性较高,可以覆盖全部阳性病例,在今后疟疾低流行时期RDT有望取代基层镜检对疟疾进行诊断。     

科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法的建立

目的建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法,并在广东口岸进行应用。方法分析埃博拉病毒基因组的同源性,设计3组引物和探针用于科特迪瓦型埃博拉病毒核酸检测。对不同浓度的科特迪瓦型埃博拉病毒体外转录RNA进行检测,确定最佳的引物和探针组合、用量,以及Mg~(2+)用量,建立科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR方法。对建立的方法进行灵敏度、特异性和灵敏度分析,并用于广东口岸非洲入境发热人员血清样本的筛查。结果经筛选,引物Ebv-C-3F/Ebv-C-3R和探针Ebv-C-3P对10~2~10~5拷贝/ml的阳性质粒的检出率为100.0%,是最佳的引物和探针组合。优化后的实时荧光PCR体系中引物和探针终浓度分别为400 nmol/L和80 nmol/L,Mg~(2+)终浓度为2 mmol/L。方法的灵敏度为50拷贝/ml,重复性好、特异性强,对扎伊尔型、苏丹型、本迪布焦型和莱斯顿型埃博拉病毒阳性对照样本、马尔堡病毒阳性对照样本和广东口岸非洲发热入境人员血清样本检测均为阴性。结论建立的科特迪瓦型埃博拉病毒实时荧光PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,对于境外输入性埃博拉病毒病病例的早期诊断和分型鉴别具有重要意义。     

弥勒市1例输入性间日疟的诊断与调查分析

目的 评价综合诊断技术对非典型形态疟原虫感染病例确诊、降低输入性病例误诊或漏诊率的重要性,巩固已取得的消除疟疾成果。方法 对2023年1月16日弥勒市某医院接诊1例间日疟患者进行流行病学调查;通过镜检、抗原胶体金法(RDT)和分子生物学方法(巢式PCR)检测,确诊为1例输入性间日疟感染病例。结果 该患者血涂片镜检厚血膜查见疟原虫,薄血膜中查见配子体皱缩成团,被寄生的红细胞不胀大甚至略缩小,颜色正常与周围正常红细胞一致,与WS 259—2015《疟疾的诊断》、《疟疾防治手册》中病原学检查描述间日疟形态不同。结论 用镜检、抗原胶体金法(RDT)和巢式PCR 3种方法,对非典型形态疟原虫感染病例进行确诊至关重要。     

逆转录聚合酶链反应用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 建立逆转录聚合酶链反应系统,用于检测恶性疟原虫感染。方法 以恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸基因为靶片段,设计一对特异引物,分别采用RT－PCR技术和PCR技术进行检测恶性疟原虫血样并比较两才检测的敏感性。结果 从培养的恶性疟原血样中扩增出359bp特定扩增带,而间日疟和健康人血样均未见扩增带。经限制性内切酶分析证实扩增产物为目的片段。检测系统初步显示可检出恶性疟血样中0．34个疟原虫所含的RNA模板。以RNA为检测对象的RT－PCR肉眼可见条带的检测水平较以DNA为检测对象的PCR扩增高。结论 RT－PCR检测恶性疟原虫方法具有敏感性高、特异性强的特点,有一定的应用价值。     

运用实时荧光RT-PCR方法检测疟原虫的研究

目的对比金标准的厚薄血膜显微镜检查法(以下简称"镜检法"),对国产疟原虫核酸实时荧光PCR检测试剂(以下简称"RT-PCR检测试剂")进行研究。方法首先提取全血样本的DNA,加入RT-PCR检测试剂进行荧光定量PCR检测,比较其相关指标。结果 2种方法经配对比较,RT-PCR检测试剂检测45份全血临床标本的总符合率达93.33%,经测序对3例不符样本进行复检,3例镜检法检测为阴性,经RT-PCR检测试剂检测为阳性的样本经测序结果显示均含有疟原虫核酸序列。结论 RT-PCR检测试剂与镜检方法在各项指标差异无统计学意义,甚至在样本处理的时效性和阳性率等方面更具有明显的优势,该实时荧光PCR试剂有良好的检测质量,特别适用于口岸、进出境等单位疟原虫DNA的检测。     

交叉引物等温扩增技术在恶性疟疾快速检测中的应用

目的 建立一种快速、敏感、特异检测恶性疟原虫的交叉引物等温扩增(cross priming amplification,CPA)技术.方法 根据疟原虫的18S rRNA基因保守序列,设计CPA引物和探针.分别用CPA法、吉氏染色镜检法检测78份发热患者血样,验证CPA法特异性和灵敏性.结果 采用CPA法对不同病原体核酸的检测结果显示,38份含有恶性疟原虫血样中检出37例阳性,其他病原体检测结果均为阴性,证明其特异性良好;该方法检测的灵敏度可达102拷贝/μl;与镜检法比较,其检测的灵敏度为97.37％,特异性为100％,准确度为98.72％.结论 用于检测恶性疟原虫的CPA检测体系具有简便、快速、灵敏、特异的优点,可用于临床、预防和出入境口岸现场疟疾的快速检测.