人Leptin的高效表达、纯化及生物学活性研究

将人Leptin表达质粒pBV200-OB转化宿主菌E.coli JM109,热诱导获得目的蛋白的表达.经SDS-PAGE鉴定分析,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的40%以上,且以包涵体的形式表达.通过包涵体分离,Sephacryl S200HR凝胶和DEAE52离子交换层析及Hypersil C18柱反相色谱纯化,获得纯度在95%以上,内毒素含量小于10EU/Mg的高纯度的重组人Leptin.Western-blot鉴定表明,纯化表达产物能和抗Leptin抗体特异结合;蛋白质N端15个氨基酸序列分析结果和预期的序列一致.纯化产物经复性处理,其分子中Cys96和Cys146形成二硫键.体内活性检测显示,纯化和复性的rh-Leptin明显抑制BALB/c小鼠的进食和体重增长,提示其具有明显的生物学活性.     

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA．并构建成pBV220-survivin原核表达质粒，将其导入Ecoli Bl21(Gold)中，诱导表达survivin蛋白。通过DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱和Sephacryl S-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Western blotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致，表达质粒在E-coli Bl21(Gold)中得到高效表达，表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30％以上，表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白，其纯度达到95％以上。Western blotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白。为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

猪干扰素-γ基因表达产物的纯化与复性研究

目的：纯化、复性猪干扰素-γ基因（poIFN-γ）表达产物并分析其抗病毒活性。方法：用异丙基-β—D-硫代半乳糖苷（Isopropylthio—β—D—galactoside,IPTG）诱导原核表达载体pQE30／poIFN-γ,超声裂解包涵体,尿素溶解、Ni—NTA纯化和透析复性后,对所得的蛋白进行抗病毒活性检测。结果：经复性纯化的目的蛋白纯度达95％以上,在PK15细胞上抗滤泡性口炎病毒比活性为6．2×10^5u／mg。结论：获得PoIFN-γ活性蛋白,为进一步研究应用奠定基础。     

黄牛朊蛋白原核表达产物的复性与活性分析

目的复性黄牛朊蛋白原核表达产物,分析复性蛋白的活性,以获得有活性的牛重组朊蛋白。方法构建并诱导表达黄牛朊蛋白基因重组菌,复性其包涵体裂解物,对GST-BoPrP（93～241）（Q234R）复性产物进行GSTrap FF柱层析纯化,通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹观察其提纯和复性效果。结果重组菌可表达分子质量约为42.4 ku的目的蛋白,包涵体裂解物经过透析复性后,可获得较高纯度的复性目的蛋白。各复性产物和纯化的GST-BoPrP（93～241）（Q234R）蛋白经免疫印迹鉴定,发现仅分子质量约为42.4 ku的条带与单抗4C11结合。结论获得高纯度复性黄牛朊蛋白原核表达蛋白,具有良好的免疫反应活性。     

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的 建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法 将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH／pGEX—4T—1转化到宿主菌BL21，该GDH／GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达，经SDS—PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂／去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8mol／L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性，并通过浊度分析、非还原SDS—PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH／GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果 经SDS—PAGE分析表明，GDH／GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25％左右；浊度分析表明：稀释复性法优于其它两种方法，同时20mmol／L，Tris—HCI、1mmoH，EDTA、pH8．5及GSSG／GSH=1：10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件，其复性回收率可达90％以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论 通过稀释复性，二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH／GST融合蛋白。     

人survivin的克隆、在大肠杆菌中的表达及活性鉴定

目的在原核中高效表达及活性鉴定重组人survivin蛋白分子。方法应用RT-PCR的方法得到survivin的cDNA,并构建成pBV220-survivin原核表达质粒,将其导入E.coliBl21(Gold)中,诱导表达survivin蛋白。通过DEAESepharoseFastFlow离子交换柱和SephacrylS-200分子筛二步柱纯化以获取目的蛋白。用Westernblotting检测表达产物。结果PT-PCR产物经测序分析与预期结果完全一致,表达质粒在E.coliBl21(Gold)中得到高效表达,表达的survivin蛋白占总蛋白含量的30%以上,表达产物以包涵体的形式存在。通过离子交换柱和分子筛二步柱纯化及复性后获得的目的蛋白,其纯度达到95%以上。Westernblotting证明表达产物具有特异性。结论获得了较高纯度的survivin蛋白,为进一步深入研究该蛋白的细胞凋亡调控功能提供了工具。     

人胱抑素C的原核表达纯化鉴定及抗血清的制备

目的 构建人胱抑素C(cystatin C, Cys C)的原核表达载体,并用纯化的Cys C重组蛋白免疫家兔,制备Cys C抗血清. 方法 从HL-60细胞中提取总RNA,RT-PCR扩增Cys C基因,将测序正确的目的基因克隆至pET32 (a)表达载体中,并诱导其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达;所获得的包涵体蛋白经亲和层析纯化、透析复性、Western blot鉴定后,免疫家兔制备抗血清,抗体效价和特异性分别采用ELISA、Western blot进行检测.结果 测序证实克隆的基因序列与GeneBank中的Cys C序列相符;SDS-PAGE、Western blot结果证实获得相对分子质量为35×103的Cys C 融合蛋白,其表达形式为不溶性包涵体;此包涵体蛋白经Ni2 亲和层析能有效纯化,以该蛋白免疫家兔制备抗血清,抗体效价为1∶8 000,Western blot检测证实该抗体能与目的蛋白发生特异性结合. 结论 获得了Cys C重组蛋白及特异性多克隆抗体.     

趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的：构建趋化因子受体5（CCR5）胞外段重组蛋白（命名为：rCCR5）原核表达载体，并进行诱导表达．对表达产物进行纯化和鉴定．方法：截取CCR5胞外结构4个片段N-Term，ECL1，ECL2和ECL3的氨基酸序列，应用柔性linker分别串联，模拟CCR5胞外结构，依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因．运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达。表达产物经纯化、复性后进行Westernblot鉴定．结果：目的蛋白以包涵体形式存在，经包涵体洗涤、变性溶解，SephacrylS-300凝胶过滤层析及SephacrylS-100凝胶柱复性获得了纯化的蛋白质，目的蛋白能与CCR5 mAb特异性结合．结论：获得了大量纯化的rCCR5重组蛋白，可作为研制CCR5自体蛋白疫苗以阻断HIV-1感染的候选抗原蛋白。     

Balb/Cdx鼠甘露聚糖结合凝集素-A糖识别域的原核表达

目的 获取具有生物学活性的Balb/C小鼠血清型甘露聚糖结合凝集素(MBL-A)糖识别域(CRD)蛋白.方法 应用PCR从含Balb/C小鼠MBL广A基因的质粒pmMBL-A中扩增目的 基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的 蛋白.表达产物(包涵体)经洗涤和复性处理后,利用GST柱纯化,以SDS-PAGE、Western blotting和ELISA进行分析鉴定.结果 从pmMBL-A中扩增到约450 bp的DNA片段,构建重组载体pET41a-mMBL-A-CRD,经酶切和测序鉴定后,将其导人大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约47 000.包涵体经洗涤及复性处理,GST柱纯化后,融合蛋白的纯度达90%以上.Westemblotting显示重组融合蛋白与抗GST抗体特异性反应,糖结合试验表明表达产物具有生物学活性.结论 成功获得了具有生物学活性的Balb/C小鼠MBL-A CRD蛋白,为MBL-A分子的研究奠定了一定基础.     

Balb/C小鼠甘露聚糖结合凝集素-A糖识别域的原核表达

目的 获取具有生物学活性的Balb/C小鼠血清型甘露聚糖结合凝集素(MBL-A)糖识别域(CRD)蛋白.方法 应用PCR从含Balb/C小鼠MBL广A基因的质粒pmMBL-A中扩增目的 基因片段,将其克隆至原核表达载体pET41a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达目的 蛋白.表达产物(包涵体)经洗涤和复性处理后,利用GST柱纯化,以SDS-PAGE、Western blotting和ELISA进行分析鉴定.结果 从pmMBL-A中扩增到约450 bp的DNA片段,构建重组载体pET41a-mMBL-A-CRD,经酶切和测序鉴定后,将其导人大肠杆菌BL21(DE3)中表达,表达产物主要以包涵体形式存在,其相对分子质量约47 000.包涵体经洗涤及复性处理,GST柱纯化后,融合蛋白的纯度达90%以上.Westemblotting显示重组融合蛋白与抗GST抗体特异性反应,糖结合试验表明表达产物具有生物学活性.结论 成功获得了具有生物学活性的Balb/C小鼠MBL-A CRD蛋白,为MBL-A分子的研究奠定了一定基础.     

人瘦素基因的原核表达载体构建及其蛋白结构分析

目的 克隆人源Leptin的成熟肽编码序列后基因并构建其原核重组表达菌株,对其产物进行纯化鉴定;生物信息学分析其蛋白质结构并预测功能.方法 提取人脂肪干细胞中的总RNA,经RT-PCR反转录获得cDNA序列,PCR扩增Leptin基因并将其克隆入表达载体pET-28a(+)原核质粒,构建该基因的重组原核表达载体pET-28a-Leptin.随后进行双酶切和测序鉴定.在E.coli BL21(DE3)中诱导表达目的蛋白,通过WB检测Leptin蛋白的表达;利用在线网络生物信息学相关数据库和分析软件对测序结果进行分析,并对重组蛋白结构及功能等进行验证和预测.结果 PCR扩增得到Leptin目标DNA片段;成功构建重组表达质粒pET-28a-Leptin,经IPTG诱导表达后,目的蛋白在宿主E.coli BL21 (DE3)中高效表达Leptin融合蛋白,相对分子质量18000.生物信息学检索该基因编码蛋白的氨基酸序列与理化参数显示,蛋白无跨膜区,有6个Ser、1个Thr可能为蛋白激酶磷酸化位点,第1～21位可能为信号肽区域.在Leptin氨基酸序列中:α-螺旋93处,无规则卷曲43处,延伸链17处,β-转角14处,分别占总二级结构的55.69％、25.75％、10.18％和8.38％.结论 成功克隆了人的Leptin基因.利用原核载体表达系统成功表达并进一步纯化的Leptin蛋白具有免疫原性.其生物信息学分析及结合蛋白质结构与功能预测结果可为深入研究Leptin蛋白的活性作用提供有益借鉴.     

抗人结肠癌单链抗体CL-3在大肠杆菌中的表达、复性和纯化

目的:为得到单链抗体高效表达,我们对抗人结肠癌单链抗体 CL-3 在大肠杆菌中的表达、复性和纯化进行了研究.方法:以重组质粒表达载体 pJW2-CL-3 转化大肠杆菌DH5α,重组克隆在培基中温控诱导,以包涵体形式表达单链抗体.包涵体经溶解、复性、纯化后,以SDS-PAGE及Western Blot鉴定表达蛋白,ELISA法鉴定单链抗体的免疫活性.结果:42 ℃诱导 5 h 蛋白表达量占菌体蛋白的 30%. 8 mol/L 尿素可将包涵体大部分溶解,稀释于复性缓冲液中静置 10 ℃ 48 h 以上可使包涵体蛋白复性.纯化峰经鉴定, 27 KD 处表达之蛋白为带有E-tag的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,并证明其具有与抗原CEA特异性结合的功能,免疫活性与亲代抗体 CL-3 相似.结论:本研究获得的以包涵体形式在大肠杆菌中表达的抗人结肠癌单链抗体 CL-3,具有与亲代抗体相似的免疫活性,为高效表达单链抗体,用于肿瘤的诊断和治疗提供了依据.     

屋尘螨变应原Der p 1基因原核表达产物的纯化及特性鉴定

目的建立屋尘螨主要变应原Derp1蛋白原核表达产物的纯化方法,获得理想的表达产物并鉴定其免疫原性。方法大量诱导表达含pET24a-Derp1质粒的BL21工程菌,表达产物以重组蛋白包涵体的形式存在,包涵体经洗涤与溶解后,使用结合6组氨酸的镍柱进行亲和层析纯化蛋白质,用稀释复性方法进行重组蛋白的复性,再用屋尘螨过敏性哮喘患者阳性血清经Dot-ELISA方法分析Derp1纯化蛋白的抗原活性。结果分步洗涤可有效去除重组蛋白包涵体沉淀中混杂的多数杂蛋白成分,亲和层析分离可获得高纯度重组变应原Derp1蛋白。Dot-ELISA法检测结果表明经复性并纯化的Derp1蛋白呈强阳性反应,最佳血清稀释度为1∶64,而重组蛋白与正常人血清呈阴性反应。结论纯化后的融合蛋白Derp1具有较高的纯度及较强的免疫活性,可望作为有效的屋尘螨变应原诊断试剂和疫苗的候选分子。     

人睫状神经营养因子基因的克隆、表达、纯化和生物活性鉴定

目的表达和纯化人睫状神经营养因子(CNTF)并观察其生物学活性。方法用PCR方法构建人CNTF的结构基因,并克隆于pLy4原核表达载体中。将重组表达质粒pLy4-CNTF转化大肠埃希菌JF1125,30℃培养至A600(nm)达到0.6时,迅速升温至42℃诱导目的蛋白的表达。细菌经超声破胞,包涵体经变性、复性、透析和阴离子交换层析,获得纯化的CNTF重组蛋白。然后,用鸡胚背根神经节神经元细胞存活实验观察其生物活性。结果42℃诱导后可以获得Mr≈22.9×103的目的蛋白,Western印迹结果进一步表明,其具有人CNTF的抗原性。表达蛋白主要以不溶形式存在,占菌体蛋白的35%以上,表达产物经变性、复性,纯化后可获得纯度90%以上的目的蛋白。该重组蛋白能够促进鸡胚背根神经节神经元细胞的存活。结论在大肠埃希菌JF1125中成功表达了人CNTF分子,经变性、复性,纯化后得到具有生物活性的蛋白。     

鼻咽癌人源抗独特型基因工程抗体的原核表达及鉴定

目的构建鼻咽癌人源抗独特型单链抗体原核表达载体，对其产物做初步鉴定，为鼻咽癌疫苗制备奠定基础。方法采用分子克隆技术，PCR扩增G22ScFv基因，并将其克隆到原核表达载体pET25b（＋）上，将重组子转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达后，表达的蛋白经His—tag纯化试剂盒纯化后复性。SDS—PAGE及Western blot分析融合蛋白。结果构建的原核表达载体pET25b（＋）－G22经测序检测，序列正确。在大肠杆菌中G22ScFv以包涵体形式获高效表达，SDS－PAGE及Western blot鉴定表达的目的蛋白Mr为25kD，同时证实载体构建及表达均正确。目的蛋白经试剂盒纯化后电泳分析纯度达95％以上。结论利用基因重组技术，在原核细胞中表达出重组G22ScFv并得到纯化，为研究鼻咽癌疫苗打下了基础。     

趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、纯化及鉴定

目的:构建趋化因子受体5(CCR5)胞外段重组蛋白(命名为:rCCR5)原核表达载体,并进行诱导表达.对表达产物进行纯化和鉴定.方法:截取CCR5胞外结构4个片段N-Term,ECL1, ECL2和ECL3的氨基酸序列,应用柔性linker分别串联,模拟CCR5胞外结构,依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因.运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达,表达产物经纯化、复性后进行Western blot鉴定.结果:目的蛋白以包涵体形式存在,经包涵体洗涤、变性溶解,SephacrylS-300凝胶过滤层析及SephacrylS-100凝胶柱复性获得了纯化的蛋白质,目的蛋白能与CCR5 mAb特异性结合.结论:获得了大量纯化的rCCR5重组蛋白,可作为研制CCR5自体蛋白疫苗以阻断HIV-1感染的候选抗原蛋白.     

重组抑肽酶的生产工艺研究

目的：优化融合表达抑肽酶基因工程菌的发酵奈件，分离纯化抑肽酶。方法：设计3因素3水平的正交实验，考查玉米粉浓度、诱导时间和诱导剂乳糖浓度对菌体生长及蛋白表达的影响；在30L发酵罐中进行中试放大试验；菌体经超声破壁和离心得到融合蛋白包涵体，经Bio-gel P30凝胶过滤纯化复性，用FXa切割，回收目的蛋白，最后用Resouree RPC进行纯度验证。结果：融合蛋白的表达量为45％，包涵体复性率为70％以上，抑肽酶纯度为90％，总收率为32％，比活力为3．1EPU／mg。结论：实现了含抑肽酶融合蛋白的较高表达，复性率及纯度达到较高水平，活力与天然产物相当。     

人可溶性晚期糖基化终产物受体的原核表达及活性鉴定

目的构建人可溶性晚期糖基化终产物受体(hsRAGE)His融合蛋白表达载体并在原核细胞表达与纯化。方法PCR扩增hRAGE基因编码区的胞质外段，利用分子克隆技术将其重组于pET-14b载体中。利用酶切、序列分析鉴定克隆正确性转化大肠杆菌BL21(DE)3，用异丙基b—D硫代半乳糖(IPTG)诱导融合蛋白表达。以尿素对获得的包涵体进行处理，用金属螯合亲和层析的方法纯化融合蛋白并进行复性。以Western印迹和ELISA法对融合蛋白的免疫原性及与AGE的结合活性进行鉴定。结果克隆的hsRAGE完全正确．经过表达与纯化．获得了相对分子质量约45000的融合蛋白。纯化得到的变性蛋白经复性后可被相应抗体识别。所得到的hsRAGE具有与AGE相互结合的活性，并能够抑制AGE绣导的内皮细胞NF-κB的表达．结论成功地构建了hsRAGE融合蛋白原核表达载体且获得高效表达．得到大量的复性蛋白；该蛋白具有特异的免疫原性，保持与AGE的结合活性．并能够有效阻断AGE-RAGE相互作用。     

人脂联素球状结构域的表达、纯化和功能鉴定

目的表达和纯化人脂联素（adiponectin,APN）球状结构域并观察其生物学活性.方法用PCR方法复制人脂联素球状结构域（globular domain of adiponectin,gAPN）的cDNA,并克隆于pET28a（＋）原核表达载体中.将重组表达质粒pET28a（＋）-gAPN转化大肠埃希菌BL21（DE3）,37℃培养至A600达到0.6时,加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导目的蛋白的表达.细菌经超声破菌,得到粗提的包涵体洗涤变性后经镍柱亲和层析柱一步纯化,获得纯化的gAPN重组蛋白,复性后冻干保存.然后,用链佐星（streptozocin,STZ）诱导的小鼠高血糖模型检测其生物活性.结果IPTG诱导后有Mr约为17 000大小的目的蛋白表达,免疫印迹结果进一步表明,其具有人gAPN的抗原性.表达蛋白主要以包涵体形式存在,占菌体蛋白的30%以上,表达产物经变性、纯化、复性,可获得纯度90%以上的目的蛋白.该重组蛋白能够降低STZ诱导的小鼠高血糖模型的血糖水平.结论在大肠埃希菌BL21（DE3）中成功表达了人gAPN蛋白,经变性、纯化、复性后得到具有生物学活性的蛋白.     

卵巢癌抗独特型单链抗体6B11基因在大肠杆菌中的高效表达

目的制备在大肠杆菌中高效表达６Ｂ１１卵巢癌抗独特型单链抗体。方法采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）克隆技术,将６Ｂ１１ｓｃＦｖ基因克隆到原核高效表达载体ｐＫＰＬ３ａ上,重组子转化大肠杆菌ｐｏｐ２１３６,温度诱导表达;复性蛋白经二乙氨乙基琼脂糖快速离子交换层析纯化,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶鉴定蛋白纯度;直接法和竞争抑制法ＥＬＩＳＡ检测其活性。结果６Ｂ１１ｓｃＦｖ以包涵体形式表达获高效表达;包涵体经溶解复性纯化,纯度达９５％以上;表达蛋白能与卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６－９特异结合并能有效抑制卵巢癌抗原ＯＣ１６６－９与卵巢癌单抗ＣＯＣ１６６－９的特异结合。结论６Ｂ１１ｓｃＦｖ基因可在原核细胞中高效表达,表达产物经复性纯化后具有较好的免疫活性。