来自肺炎克雷伯菌的SHV型β-内酰胺酶基因的克隆、表达与纯化

为研究先前筛得的可抑制TEM-1型β-内酰胺酶的多肽SIPIS-04-01对SHV型β-内酰胺酶的结合能力,从一株临床耐β-内酰胺类抗生素的肺炎克雷伯菌10032克隆了SHV型β-内酰胺酶基因,并替换质粒pUC18上原有的bla基因,转化大肠杆菌DH5α后表明该基因使宿主菌具有抗氨苄青霉素的能力。进一步将其克隆到一个高效表达载体pLY-5中,优化表达和纯化条件获得了SHV型β-内酰胺酶。体外试验证明该酶能降解氨苄青霉素,重组多肽SIPIS-04-01对此降解有所抑制。     

液化沙雷菌超广谱β-内酰胺酶的特性研究

目的研究液化沙雷菌超广谱β-内酰胺酶的特性。方法超声破碎法提取临床分离液化沙雷菌CR04的β-内酰胺酶，等电聚焦（IEF）测定其等电点（pI）；硫酸铵反抽提、Sephadex G-75凝胶过滤和DE-52阴离子交换层析进行酶的纯化；SDS—PAGE法测定分子量和紫外分光光度法测定酶动力学参数。结果液化沙雷菌超广谱β-内酰胺酶的pI为7．5，分子量为28．77ku，动力学分析显示，该酶能水解头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南，对舒巴坦（IC50为77nmol／L）和三唑巴坦（IC50为17nmol／L）敏感。结论液化沙雷菌产生的超广谱β-内酰胺酶对酶抑制剂敏感。     

TEM-1型β-内酰胺酶基因的克隆、表达及酶的纯化

开发专一性β-内酰胺酶抑制剂,对解决细菌耐药性问题具有重要意义.这项研究需要用到纯度较高的β-内酰胺酶.我们将TEM-1型β-内酰胺酶基因克隆到一个高表达载体中,研究了该酶在大肠杆菌中的高表达条件及分离纯化方法,最终获得的酶纯度大于90%.     

临床分离耐药摩氏摩根菌的β-内酰胺酶表型和基因型分析

目的探讨临床分离耐药摩氏摩根菌3-87耐药的分子机制。方法采用常规琼脂二倍稀释法对摩氏摩根菌3-87进行15种抗菌药的MIC测定；超声破碎法提取β-内酰胺酶；并用nitrocefin做定性检测，用紫外分光光度计检测酶活性；超薄层等电聚焦测定β-内酰胺酶等电点和酶抑制实验；ESBLs表型鉴定；AmpC酶的检测；纸片协同法筛选产金属β-内酰胺酶菌株；以摩氏摩根菌3—87质粒DNA为模板扩增blaSHV、blaTEM和blaCTX-M基因，以基因组DNA为模板扩增ampC结构基因；ampC结构基因扩增产物的DNA序列测定及同源性分析。结果摩氏摩根菌3—87对10种β-内酰胺类抗生素、2种氟喹诺酮类抗菌药耐药，对哌拉西林／三唑巴坦和头孢哌酮／舒巴坦、氨基糖苷类抗生素阿米卡星敏感。产酶活性为3727．5U的β-内酰胺酶。产生的p17．3、8．2及9．6的三种β-内酰胺酶分别能被氯唑西林、克拉维酸、EDTA部分抑制。β-内酰胺酶表型鉴定试验结果显示菌株产ESBLs、AmpC酶及金属β-内酰胺酶三种β-内酰胺酶。blaCTX-M基因引物扩增出阳性扩增条带。ampC结构基因引物扩增阳性扩增带，对扩增产物进行序列分析与已报道的摩氏摩根菌ampC结构基因的核苷酸序列高度同源，推导的氨基酸序列发生了1个氨基酸残基的变异。结论临床分离耐药摩氏摩根菌3—87呈多重耐药，其对β-内酰胺类抗生素耐药的机制是产生了ESBLs、AmpC酶及金属β-内酰胺酶。     

利用酵母双杂交系统筛选β-内酰胺酶的结合肽

构建了含有来自于质粒pBR322的β-内酰胺酶基因的诱饵质粒,利用酵母双杂交系统从随机序列八肽库中进行筛选,通过初筛、复筛验证获得了1个阳性转化子.DNA序列测定结果表明其编码了1段八肽,体内显示具有结合β-内酰胺酶的能力.     

耐头孢哌酮对头孢哌酮/舒巴坦敏感的革兰阴性杆菌β-内酰胺酶分析

目的分析对头孢哌酮耐药但对头孢哌酮／舒巴坦敏感的革兰阴性杆菌β-内酰胺酶。方法用PCR方法扩增62株临床分离菌TEM型及SHV型β-内酰胺酶耐药基因并对从65株临床分离的革兰阴性杆菌及7株铜绿假单胞菌中分离提取的β-内酰胺酶进行等电点测定。结果62株临床分离菌PCR扩增结果表明，58．1％（36／62）对头孢哌酮耐药但对头孢哌酮／舒巴坦敏感的革兰阴性杆菌含有TEM型β-内酰胺酶；32．3％（20／62）含有SHV型β-内酰胺酶。65株临床分离的革兰阴性杆菌产生的β-内酰胺酶等电点的测定结果表明36．9％（24／65）的革兰阴性杆菌产生一种β-内酰胺酶，29．2％的革兰阴性杆菌产生2种β-内酰胺酶，13．8％的革兰阴性杆菌产生3种β-内酰胺酶，10．7％的革兰阴性杆菌产生4种β-内酰胺酶，6．1％的革兰阴性杆菌产生5种β-内酰胺酶。6株铜绿假单胞菌产生1种β-内酰胺酶，1株铜绿假单胞菌产生2种β-内酰胺酶。β-内酰胺酶的等电点介于4．95—9．36之间。72株临床分离菌共产生160种β-内酰胺酶。全部β-内酰胺酶能够水解头孢哌酮，而舒巴坦可以抑制酶的活性。β-内酰胺酶对头孢哌酮／舒巴坦（1：1）的水解率与头孢他啶相似，但低于对阿莫西林／克拉维酸（1：5）和哌啦西林／三唑巴坦（1：8）的水解率。包括7株铜绿假单胞菌在内的72株产生β-内酰胺酶的革兰阴性杆菌对头孢哌酮／舒巴坦敏感。结论大部分对头孢哌酮耐药但对头孢哌酮／舒巴坦敏感的革兰阴性杆菌产生TEM型β-内酰胺酶，舒巴坦可以增强头孢哌酮对包括铜绿假单胞菌在内的产酶革兰阴性杆菌的抗菌活性。     

β-内酰胺酶测定及耐药性监测

目的 研究我院肠杆菌科细菌产β-内酰胺酶及其耐药性分析。方法 收集本院2000年8月-2002年7月分离的202株肠杆菌科细菌，用microscan autoscan-4型全自动细菌鉴定分析仪作细菌鉴定和药敏试验，同时用复合纸片法鉴定超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)，用头孢西丁三维试验法检测AmpC β-内酰胺酶(AmpC—BLA)。结果 202株肠杆菌科细菌中，高产ESBLs的细菌74株占36．6％，产AmpC—BLA的细菌39株占19．3％；产β-内酰胺酶对18种常用抗菌药物耐药率明显高于非产酶菌株。结论 这两种β-内酰胺酶的耐药性非常严重且各具特点，各临床实验室应重视β-内酰胺酶的检测，这对指导临床合理使用抗生素具有十分重要的意义。     

β-内酰胺酶抑制肽的活性研究

目的 通过合成和筛选具有一定抑酶作用的β-内酰胺酶抑制肽,考察其抑制活性及抑制动力学生化特征,以用于产β-内酰胺酶耐药菌所致感染的临床治疗。方法 固相合成法在计算机上三维模拟设计合成β-内酰胺酶抑制肽。选取我院08年临床分离鉴定的产酶菌8株,测定临床常用抗生素对8株细菌的MIC值,采用试管稀释法进行β-内酰胺酶抑制肽活性初步筛选。分光光度法研究抑制肽对8株产酶菌所产β-内酰胺酶的抑酶效力,Dixon作图法求取抑制常数Ki,计算相关抑制动力学参数。结果 合成了6段系列短肽分子,筛选得到3段具有抑制活性的抑制肽,抑制底物动力学研究验证3段β-内酰胺酶抑制肽具有一定抑制活性,但抑制常数均较大,其抑制方式均为竞争性抑制。结论     

同时产CTX-M-22及TEM-1型β-内酰胺酶的阴沟肠杆菌耐药性分析

目的 了解临床分离阴沟肠杆菌株EC003产β-内酰胺酶的耐药特征和基因型。方法采用琼脂二倍稀释法对阴沟肠杆菌EC003进行MIC检测，酶提取物三维实验检测AmpC酶，双纸片法筛选及确证实验检测超广谱β-内酰胺酶（ESBLs），等电聚焦（IEF）电泳测定其等电点。以耐药质粒为模板进行PCR扩增，将β-内酰胺酶全编码基因克隆、表达，并对其扩增产物进行DNA序列测定和同源性分析。结果阴沟肠杆菌株EC003对所试多数β-内酰胺类抗生素耐药，表型检测AmpC酶为阴性。ESBLs阳性，IEF显示该菌产两种p1分别为8．7及5．4的β-内酰胺酶。PCR扩增产物DNA测序证实为CTX-M-22、TEM-1型β-内酰胺酶全编码基因，产TEM-1的克隆菌株仅对青霉素类耐药，产CTX—M-22的克隆菌株对所试多数β-内酰胺类抗生素耐药。对头孢噻肟的水解程度明显强于头孢他啶。结论临床分离阴沟肠杆菌株EC003同时产CTX—M-22和TEM-1型两种β-内酰胺酶，可导致对多数β-内酰胺类抗生素耐药。     

产ESBLs液化沙雷氏菌临床分离株的表型和基因型分析

目的 探索液化沙雷氏菌临床分离株CR04对第三代头孢菌素耐药的分子机制。方法 采用琼脂二倍稀释法对临床分离的液化沙雷氏菌CR04株进行MIC检测，提取耐药菌β-内酰胺酶，并测定其酶活性。双纸片法筛选及确证实验鉴别耐药菌的ESBLs表型．进行结合传递实验并提取耐药菌质粒．进一步根据常见的质粒介导的β-内酰胺酶基因序列设计两对寡核苷酸引物，以耐药质粒为模板进行PCR扩增，并对其扩增产物进行DNA序列测定和同源性分析。结果 头孢他啶对液化沙雷氏菌CR04株的MIC为512μg／ml，其酶活性为837．9U，双纸片法筛选及确证实验证明为产ESBLs耐药菌，结合传递实验表明产酶基因能传递给受体菌。从耐药菌中提取出大小约为10kb的质粒，以质粒DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物DNA测序结果进行分析表明，其核苷酸序列与已知的β-内酰胺酶blaSHV-5、blaSHV-1、bLaSHV-2、blaSHV-7、blaSHV-8、blaSHV-12、blaSHV-54、blaSHV-34基因高度同源，其所推导的氨基酸序列与已知的β-内酰胺酶blaSHV-5、blaSHV-1、blaSHV-2、blaSHV-7、blaSHV-11、blaSHV-12、blaSHV-24、blaSHV-34相比较至少有30个氨基酸残基的差异。结论 对临床分离的第三代头孢菌素耐药性液化沙雷氏菌CR04株进行详细的表型和基因型分析，为进一步通过反义核酸等技术抑制耐药基因表达从而系统研究细菌耐药机制奠定了基础。     

耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28V β-内酰胺酶的特性研究

目的 研究耐头孢他啶阴沟肠杆菌TEM-28Vβ-内酰胺酶的特性。方法用KB纸片扩散法和等电聚焦(IEF)对细菌β-内酰胺酶类型进行初步判断；碱裂解法提取质粒并进行PCR扩增测序；饱和硫酸铵反抽提，并经Sephadex G-75凝胶过滤和DE-52阴离子交换层析法纯化β-内酰胺酶；SDS-PAGE法测定分子量和紫外分光光度法测定酶动力学参数。结果6株临床分离菌均对头孢他啶耐药。IEF显示，每株菌产生一种或两种β-内酰胺酶，等电点(pI)分别为5．5、5．6和8．7。根据基因分析推测，pI为5．6的酶的氨基酸序列与TEM-2同源性为100％。pI为5．5的酶与TEM-28比较存在4个氨基酸突变，其分子量为28．77ku；酶动力学分析证实，TEM-28V能水解头孢他啶、头孢噻肟和氨曲南，不能水解亚胺培南，对舒巴坦和三唑巴坦的IC50分别为107和220nmol／L。结论TEM-28V可能为TEM-28变异型超广谱β-内酰胺酶。     

产金属β-内酰胺酶嗜麦芽寡养单胞菌的研究

目的 探讨嗜麦芽寡养单胞菌所产金属β-内酰胺酶的酶学特性及分子生物学特征。方法 采用纸片协同法筛选产金属β-内酰胺酶菌株；测定产酶株所产β-内酰胺酶对亚胺培南的稳定性和丝氨酸β-内酰胺酶、金属β-内酰胺酶抑制剂的抑酶保护效应；检测金属β-内酰胺酶的等电点；用PCR法检测金属β-内酰胺酶全基因，并测序。结果 纸片协同法筛选产金属β-内酰胺酶菌株4株，药敏试验显示对多种抗菌药物耐药。酶稳定性试验显示，4株产酶菌产碳青霉烯水解酶。酶抑制试验表明，克拉维酸对这4株菌所产酶无抑酶保护效应，而金属β-内酰胺酶抑制剂EDTA对4株菌所产酶有抑制作用，且酶活性能被ZnCl2复活。等电聚焦显示，2株菌(710、750)产的碳青霉烯水解酶pI为6．6，l株菌(603)的pI为6．2，EDTA抑制试验证实均为金属β-内酰胺酶。PCR结果显示，以4株细菌基因组DNA为模板，用所设计的金属β-内酰胺酶全基因引物进行PCR扩增，2株(750，7lO)扩增结果为阳性，进行序列分析，均为867bp。经GeneBank网上同源性比较．发现与金属酶Ll的编码基因blaS(注册号AJ291672．1)的核苷酸序列同源性均为99％。结论 嗜麦芽寡养单胞菌710和750号产Ll型金属β-内酰胺酶；603号可能产非Ll型金属β-内酰胺酶。     

临床分离嗜麦芽寡养单胞菌L1、L2酶基因克隆、测序及定位

目的了解临床分离嗜麦芽寡养单胞菌产LI、L2 β-内酰胺酶情况、酶基因定位及核苷酸序列进化和同源关系。方法PCR法扩增两种β-内酰胺酶基因，通过克隆、测序、序列比对确定其亚型、基因进化、同源关系和基因所在位置。结果细菌染色体DNA和质粒DNA扩增L1、L2酶基因阳性，其序列具有明显异质性。两种酶基因位于12kb大小的质粒上。结论嗜麦芽寡养单胞菌绝大多数产生两种β-内酰胺酶，酶基因变异和进化加速的驱动力部分可能与β-内酰胺类抗生素的长期使用有关。     

泛耐药鲍曼不动杆菌β-内酰胺类耐药机制研究

目的调查泛耐药鲍曼不动杆菌(pandrug-resistant Acinetobacter baumannii,PDR-ABA菌)临床分离菌株中β-内酰胺酶基因和膜孔蛋白基因的存在和变异情况。方法收集2010年3月到2010年5月临床标本中分离的PDR-ABA菌20株,采用微量肉汤烯释法进行抗菌药物敏感性试验,聚合酶链反应(PCR)和基因测序方法分析36种β-内酰胺酶基因和carO膜孔蛋白基因。结果本组20株PDR-ABA菌TEM-1、ADC-30-1ike、OXA-23型3种β-内酰胺酶基因全部阳性,CARB-2和DHA-1型阳性率为5.0%。在鲍曼不动杆菌中发现CARB-2型为国内首次报道。膜孔蛋carO基因突变率达100.0%。结论本组PDR-ABA菌对多种β-内酰胺类药物耐药与产TEM、ADC-30-like、OXA-23、CARB-2、DHA-1型5种13-内酰胺酶相关外,还与膜孔蛋白编码基因carO突变有关。     

耐酶抑制剂β-内酰胺酶的研究现状

产β-内酰胺酶是细菌对β-内酰胺酶类抗生索耐药的一个重要机制，使用酶抑制剂抑制β．内酰胺酶是维持或／和增强β-内酰胺类抗菌活性的有效方法。耐酶抑制剂β-内酰胺酶的出现使酶抑制剂的抑制效力大为降低，抗菌治疗又面临着新的挑战。     

AmpC β-内酰胺酶的分子生物学研究进展

AmpCβ－内酰胺酶是属Bush功能分类I群，Ambler分子分类C类的头孢菌素酶，主要由染色体介导产生，不被克拉维酸抑制，能水解和三代头孢菌素，头霉素待广谱β－内酰胺类抗生素，AmpCβ-内酰胺酶的表面受amp复合操纵子调控，与肽聚糖合成密切相关，amp复合操纵子由ampC,ampR,ampD和ampG构成，分别编码AmpC-β内酰胺酶，转录调了因子AmPR,N-乙酰葡萄糖爱－L－丙氨酸酰胺酶AmpD和膜结合转运蛋白AmpG，其中AmpR与UDP－N－乙酰胞壁酰五肽结合可抑制ampC转录，与N－乙酰胞壁酰酐三肽结合可激活ampC转录，调控基因突变与β－内酰胺类抗生素的诱导作用均可使肽聚糖合成与水解反应失衡，导致N－乙酰胞壁酰肝肽积聚，从而使AmpCβ-内酰胺酶的产量提高，近年来，质粒编码的AmpCβ-内酰胺酶逐渐增多，源于肠杆菌科细菌，与染色体编码的AmpC-β内酰胺酶在分子结构上具有不同程度的同源性，AmpCβ-内酰胺酶的诱导产生及质粒编码的AmpC-β内酰胺酶的出现是细菌针对抗生素造成的选择压力而进化的结果，临床实践中必须慎用超广谱β－内酰胺类抗生素。     

大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌产β-内酰胺酶的底物动力学研究

目的:对大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌所产β-内酰胺酶进行底物动力学研究。方法:从我院2008年分离并经Nitrocefin鉴定的产β-内酰胺酶的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中各随机挑选4株,以Kirby-Bauer法进行药敏试验检测,采用L-B作图法得出Km和Vmax。结果:8株细菌对β-内酰胺类抗生素均耐药,而对碳青霉烯类抗生素高度敏感;所产β-内酰胺酶对青霉素均有较强的水解作用,对第1代头孢菌素头孢唑林及头孢噻吩也有一定的水解作用,对第2代头孢菌素头孢呋辛和第3代头孢菌素头孢他啶及头孢噻肟的水解活性差异较大。结论:产β-内酰胺酶菌株所致感染首选碳青霉烯类抗生素治疗,不同产酶菌株所产β-内酰胺酶水解底物轮廓有较大差异。     

亚胺培南耐药铜绿假单胞菌的金属β-内酰胺酶检测

目的:了解金属β-内酰胺酶在广州地区铜绿假单胞菌中的流行状况及其流行亚型,完善广州地区金属β-内酰胺酶的分子流行病学资料.方法:采用双纸片协同法和双纸片增效法对164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌筛选金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,采用PCR检测5类金属β-内酰胺酶的编码基因(IMP家族、VIM家族、GIM-1、SPM-1和SIM-1),利用生物信息学的方法对检测到的金属β-内酰胺酶亚型进行比对分析并制作分子进化树.结果:164株亚胺培南耐药的铜绿假单胞菌中筛选出22株金属β-内酰胺酶表型阳性的菌株,IMP阳性15株(9.1%),其中11株为IMP-9亚型,另外4株携带一个新的亚型,命名为IMP.25,VIMI阳性5株(3.0%),均为VIM-2亚型,未检测到GIM-1、SPM-1和SIM-1型金属β-内酰胺酶.结论:广州地区铜绿假单胞菌产金属β-内酰胺酶的基因型已经出现多型化的特征,同时存在IMP型和VIM型金属β-内酰胺酶的流行,本次研究发现了一个新的金属β-内酰胺酶亚型(IMP-25),为IMP家族金属p.内酰胺酶的多样性及其分子流行病学资料提供了新的信息.     

CEFTAZIDIME耐药细菌的β-内酰胺酶研究

应用药物梯度琼脂筛选法获得绿脓杆菌和阴沟杆菌的Ceftazidime耐药菌株(MIC≥64μg/ml)。采用紫外分光光度法检测了耐药菌的β-内酰胺酶活性,酶对12种β-内酰胺抗生素水解的“底物轮廓”以及抑酶活性;应用超薄层分析等电聚焦电泳技术检测了β-内酰胺酶的等电点(pI),并与标准产酶菌株的β-内酰胺酶进行了比较。结果提示:细菌对Ceftazidime耐药后,β-内酰胺酶活性增加13～107倍;这类β-内酰胺酶具有如下特点:(1)水解头孢菌素类强于水解青霉素类;(2)舒巴克坦(5μg/ml)对这类酶无抑制作用,而同等剂量的邻氯青霉素却能明显抑制,(3)pI均≥8.0,与标准质粒介导的β-内酰胺酶的性质不同,符合染色体介导的头孢菌素酶的性质。此外,作者发现pI为8.2或8.4的4株耐药菌的β-内酰胺酶尚未见文献报道。     

合肥市产超广谱β-内酰胺酶菌株的SHV型耐药基因分布和耐药性分析

目的了解1999～2000年合肥市临床分离的产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌中,SHV型β-内酰胺酶基因型分布情况和耐药性分析。方法标本为安徽省细菌耐药性监控中心所留取的1999年9月～2000年9月从合肥市4家大医院临床分离的、已被证实产ESBLs的98株肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌,采用聚合酶链反应(PCR)扩增产SHV型β-内酰胺酶菌株基因片段,克隆入pGEM-Teasy载体,双脱氧链终止法测定核苷酸序列以鉴定基因型。按照2005年CLSI推荐标准,用琼脂稀释法分别测定临床分离菌株和转移结合子对11种不同抗菌药物的MIC值,并比较分析两者的不同结果。结果98株产ESBLs菌株中有29株产SHV型β-内酰胺酶,其中SHV-1型8株,SHV-11型5株,SHV-12型11株,SHV-18型1株,SHV-28型1株,SHV-89型3株[序列号为(DQ193536)]。临床分离株的MIC结果显示对哌拉西林,头孢噻肟,头孢曲松的敏感率低;转移结合子的敏感性较临床分离菌株有所上升。结论合肥市部分医院产SHV型β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌检出率较高,我们在国内外首次报道了SHV-89;并且本地区产SHV型β-内酰胺酶菌株的耐药性较高。