TLR4胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及鉴定

目的：构建谷胱甘肽转硫酶-TLR4融合蛋白表达载体，并研究其编码的蛋白质在大肠杆菌中的表达。方法：利用PCR从含TLR4全长cDNA序列的质粒中扩增其胞外段，约1800bp，然后将其克隆入pMD18-T载体中。测序确证后重组入谷胱甘肽转硫酶融合表达载体pGEX-4T-1中，并用IPTG诱导其在大肠杆菌中表达。结果：PCR扩增的TLR4胞外区基因序列与GenBank数据库中的序列一致。重组质粒经酶切鉴定及测序证实，TLR4基因已正确插入到pGEX-4T-1中。重组表达质粒转化感受态大肠杆菌HBl01后用IPTG诱导，获得Mr92 000的GST-TLR4融合蛋白；37℃，O.2mmol／L IPTG诱导4h，SDS-PAGE电泳后，经薄层凝胶扫描分析该融合蛋白占菌体蛋白总量34．25％，部分以包涵体存在，可溶性蛋白约占27．84％；亲和层析纯化后纯度大于90％。Western-blot证实GST-TLR4融合蛋白能与TLR4单抗特异性结合。结论：成功地构建融合蛋白表达载体pGEX-TLR4，并在大肠杆菌中获得有效表达，获得了纯度大于90％的可溶性GSI-TLR4融合蛋白，为进一步研究其功能及制备TLR4单克隆抗体奠定了基础。     

人体铜伴侣蛋白Atox1在大肠杆菌中的表达

利用PCR技术扩增出人体转铜伴侣蛋白Atox1和cDNA片段,直接克隆到PCRⅡ载体上,经DNA序列测定后,再插入到谷胱甘肽巯基转移酶（GST）融合表达载体PGEX－6p-2上,构成重组表达质粒PGEA,将此质粒导入大肠杆菌,经IPTG诱导后获得PGEA融合蛋白的表达。表达的融合蛋白经亲和层析、位点特异性蛋白酶切得到纯化的Atox1蛋白。     

人CD154-GST融合蛋白基因在大肠杆菌中的表达

目的:为制备重组人CD154-谷胱甘肽巯基转移酶(GST)融合蛋白(hCD154-GST),用于人CD154单克隆抗体研制。方法:根据人CD154基因序列设计合成特异性引物,RT-PCR扩增人CD154基因,并插入融合蛋白原核表达载体pGEX-4T-1中,得到重组表达质粒pGEX-4T-1/CD154;用此重组质粒转化大肠杆菌BL21细胞,转化菌落经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切鉴定。IPTG诱导大肠杆菌表达人CD154蛋白,SDS-PAGE电泳鉴定表达产物。结果:从人外周血淋巴细胞扩增出820bp的hCD154cDNA;将其克隆至pGEX-4T-1质粒中,经双酶切鉴定及DNA序列分析证实含有目的基因;IPTG诱导后的大肠杆菌经SDS-PAGE电泳鉴定出现明显的55kD蛋白带。结论:成功构建了人CD154-GST原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达出人CD154-GST融合蛋白,为人CD154单克隆抗体的研制及进一步抗排斥反应的研究打下了基础。     

人β防御素4基因原核表达载体的构建及其表达

人β防御素4（Humanpdefensin4，HBB4）是一种具有广谱抗微生物活性的抗菌肽。在人体先天免疫尤其上皮及黏膜防御中起重要作用。本研究用重叠延伸PCR扩增合成HBD4cDNA全长，并克隆人pMD18-T载体，用PCR法扩增HBIM成熟肽mamreHBD4，mHB4）编码序列并克隆入表达载体pGEX-4T-2中，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropy-β-D-thiogalactoside，IPTG）诱导下，表达HBD4与谷胱甘肽S转移酶（glutathione S-transferase，GST）的融合多肽。用酶切鉴定、核酸测序、十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳等进行鉴定。结果表明：我们成功合成了HBD4全长编码基因，构建了克隆载体pMD18-T／HBIN和原核表达载体pGEX-4T-2／mHBD4，并在大肠杆菌中成功表达融合蛋白GST—HBD4。     

小鼠IL-17A-GST融合蛋白的克隆表达

目的: 构建含有小鼠IL-17A(mIL-17A)基因的重组原核表达载体,获得高效表达mIL-17A 的基因工程菌,以及较高产量的mIL-17A蛋白.方法:以PMA 活化后小鼠脾脏单个核细胞的总RNA 逆转录合成的cDNA为模板,PCR 法扩增mIL-17A的编码序列,并分别亚克隆至pMD18-T 载体和原核表达载体pGEX-4T-1 中,经酶切和DNA测序鉴定后,转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶切鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出可溶性IL-17A-GST融合蛋白. E3),IPTG诱导表达,产物经SDS-PAGE及Western blot鉴定.结果:PCR 产物大小及其双酶 鉴定均证明所克隆的基因是mIL-17A,DNA 序列测定进一步证实与GenBank 报道的序列完全一致成功构建了重组原核表达载体pGEX-4T-1/mIL-17A,并在大肠杆菌中高效表达出相对分子质量(Mr)约40 000的具有可溶性的融合蛋白,且Western blot证实确为目的蛋白结论: 成功构建了基因重组体pGEX-4T-1/mIL-17A;并制备出     

TRAIL胸外段基因克隆及其表达与纯化

目的；克隆TNF相关的诱导凋亡配体胞膜外段基因（the extracellular region of the human TRAIL cDNA,TPAILex），构建表达载体并在大肠杆菌DH5α中高效表达有生物学活性的TRAIL蛋白胞膜外段。方法：抗CD3McAb刺激正常人外周血淋巴细胞，用RT－PCR、巢式－PCR方法从活化的淋巴细胞中获得人TRAIL基因及其胞膜外段cDNA，并克隆到pGEM-T Easy载体中，DNA测序鉴定，将TRAIL的胞膜外段基因插入表达载体pGEX-2T，构建重组表达质粒pGEX/TRAILex，用IPTG诱导表达TRAIL蛋白的胞膜外段，GST－Agarose 4B层析柱纯化GST－TRAILex融合蛋白，Western-blot鉴定纯化产物。结果：抗CD3 McAb能诱导正常人外周血核细胞TRAIL的高表达，成功地克隆了TRAIL胞膜外段基因，构建了重组表达载体pGEX/TRAILex，IPTG诱导后得到高效表达的TRAIL蛋白胞膜外段，经12％SDS－PAGE分析，可观察到一分子量和理论值相符（约54kD）的诱导表达。Kodak软件分析表达GST－TRAIL胞膜外段融合蛋白的表达量占菌体蛋白总量的28％，进一步分析证实TRAIL蛋白的胞膜外段主要以可溶性的形式表达，用GST－Agarose 4B层析柱纯化超声破菌后的上清，每升细菌培养液可得到9.8mg纯度的95％以上的GST－Tex。Western-blot结果证实54kD的表达带可与鼠抗TRAIL McAb起特异性反应。结论：成功地克隆了人TRAIL基因，并应用基因工程技术在大肠杆菌中高效表达人TRAIL蛋白的胞膜外段，为进一步研究TRAIL的功能及其在肿瘤生物治疗中的应用奠定了基础。     

GST-GP302融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其抗血清的制备

目的 :在大肠杆菌中表达血小板糖蛋白GPIbα之vWF结合区(GP30 2 )与谷胱甘肽S 转移酶GST的融合蛋白并制备其抗血清。方法 :将GP30 2片断插入GST融合表达载体 pGEX 4T 1,重组载体酶切鉴定后 ,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达获得GST GP30 2融合蛋白 ,SDS PAGE分析表达产物。包涵体经变性复性后免疫新西兰白兔 ,制备抗血清 ,ELISA、Westernblot检测重组抗原的免疫活性。结果 :重组质粒酶切鉴定表明 ,GP30 2基因已正确插入到 pGEX 4T 1中 ,经IPTG诱导后 ,表达出相对分子质量 (Mr)约为 5 90 0 0的融合蛋白 ,获得了ELISA效价为 1× 10 -5的多克隆抗体。Westernblot证明所制备的多抗可以与血小板糖蛋白特异性结合。结论 :GP30 2片断在大肠杆菌中的成功表达及制备得到的多克隆抗体 ,为检测血小板糖蛋白GPIbα及其在其他体系中的表达提供了一种检测途径     

肿瘤抗原MAGE-3基因的克隆与原核表达

目的 克隆肿瘤抗原MAGE-3基因3’端657bp片段，对其编码的蛋白羧基端97-314aa进行原核表达。方法 从含人MAGE-3基因全长cDNA的pUC19／MAGE-3质粒中经聚合酶链式反应(PCR)扩增3’端657bp片段，并克隆入pGEX-4T-1载体，构建重组原核表达质粒pGEX／MAGE-3，对含有该质粒的大肠杆菌DH5α进行诱导表达。结果 从pUC19／MAGE-3重组质粒中扩增获得一条约660bp的条带，测序结果表明与GenBank公布的MAGE-3序列一致，成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，含有该质粒的大肠杆菌DH5α经异丙基-β-半乳糖苷(Isopropyl—beta—D—thiogalactopyranoside，IPTG)诱导后表达Mr为54000的谷胱甘肽巯基转移酶(Glutathione S-transferse，GST)融合蛋白。表达的融合蛋白约占菌体蛋白总量的28％。结论 成功地构建了pGEX／MAGE-3原核表达质粒，获得了MAGE-3蛋白羧基端97～314aa融合蛋白，为该蛋白应用于肿瘤免疫治疗奠定了基础。     

巨噬细胞移动抑制因子基因的克隆和原核表达

目的：扩增、克隆人巨噬细胞移动抑制因子（MIF）基因，并在大肠杆菌中表达出具有生物活性的重组MIF蛋白。方法：根据人MIF基因序列，设计、合成PCR引物，利用RT-PCR技术从人T淋巴细胞mRNA中扩增MIF基因。将MIF定向插入原核表达载体pGEX-4T-1，并将构建正确的重组表达载体pGEX-4T-MIF转化工程菌BL21(DE3)，用异丙基硫代-β-D-半乳糖（IPTG）诱导表达重组MIF蛋白。用GSTrap亲合柱纯化表达产物GST-MIF，行柱上凝血酶消化，洗脱获得MIF蛋白。用巨噬细胞移动抑制试验（MMI）鉴定MIF蛋白的生物活性。结果：限制性内切酶分析和DNA测序结果表明，成功构建了重组质粒pGEX-4T-MIF，人MIF cDNA长348 bp，编码115个氨基酸。经IPTG诱导，高效表达出可溶的GST-MIF蛋白。SDS-PAGE 和 Western blotting分析显示，GST-MIF经凝血酶消化，获得13 kU的MIF蛋白。MIF蛋白对巨噬细胞移动的抑制率达30%，具有生物活性。结论：克隆、测定了人MIF基因，在大肠杆菌表达出具有生物活性的MIF蛋白。     

TRPM2蛋白在大肠杆菌的表达纯化和多克隆抗体制备

目的 获得人瞬时受体电位M2(TRPM2)离子通道蛋白N末端的原核表达融合蛋白,制备兔抗人TRPM2多克隆抗体.方法 采用PCR扩增编码人TRPM2蛋白N末端l～334位氨基酸残基(在人与小鼠中高度保守)的cDNA序列,将其克隆至谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-3上.将原核表达重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导GST-TRPM2N融合蛋白的表达,并纯化获得相对分子质量(Mr)约70 000的GST-TRPM2融合蛋白.将此融合蛋白与弗氏完全佐剂混合后采用经典的4次免疫法免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,用Western blot法对该抗体进行鉴定.结果 通过PCR扩增获得编码TRPM2蛋白N末端的cDNA片段并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T3中,采用IPTG诱导、蛋白质的变性与复性纯化获得融合蛋白GST-TRPM2N,将纯化的融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备获得特异性抗TRPM2蛋白的多克隆抗体.结论 成功制备了特异性抗人TRPM2蛋白的多克隆抗体.     

人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化

目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化。方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆。将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化。结果经过表达及纯化条件的摸索,最终获得重组HuC蛋白。结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

EB病毒融合蛋白ZtaN-p23在大肠杆菌中的表达、纯化及活性鉴定

目的:克隆EB病毒立即早期蛋白ZtaN和衣壳蛋白p23,构建原核表达载体,并在大肠杆菌中表达融合蛋白,为后续利用蛋白进行疾病诊断奠定基础。方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术从B95-8细胞中分别扩增出目的基因BZLF1N和BLRF2,利用融合PCR法将两个基因进行连接,构建重组质粒pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。加入IPTG诱导表达融合蛋白ZtaN-p23,通过SDS-PAGE和Western blot确定蛋白表达量及活性鉴定。结果:重组质粒pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2经双酶切鉴定和序列分析正确,证实已成功构建原核表达载体;SDS-PAGE显示诱导的蛋白Mr约46 000,与预期值一致;对融合蛋白表达条件进行优化后,发现其主要以包涵体的形式存在于细胞中;亲和层析结果显示纯化后的ZtaN-p23纯度>95%;Westernblot显示ZtaN-p23具有良好的生物活性。结论:成功构建原核表达载体pGEX-4T-1-BZLF1N-BLRF2,并在大肠杆菌中进行了表达纯化,融合蛋白显示出良好的活性。     

人粘膜血管定居因子／GST融合基因表达载体的构建与表达

目的 构建hMAdCAM-1/GST融合基因表达载体并进行表达。方法 采用PCR技术扩增hMAdCAM-1cDNA5‘端615bp的基因片段,将其插入pGEM-T质国。经全自动序列分析仪测序证实后,再亚克隆至表达载体pGEX-2T,转化大肠杆攻DH5a。结果 SDS－PAGE检测显示,表达出相对分子量52000u的融合蛋白,占菌体总蛋白的31％左右。Westerm blot分析表明,表达蛋白能与抗hMAdCAM-1多抗特异性结合。结论 hMAdCAM-1/GST融合基因表达载体的构建和表达,为深入研究MAdCAM-1提供了材料。     

原核表达载体GST-RUNX3的构建及其在大肠杆菌表达

目的 构建GST/RUNX3融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达.方法 利用Kpn1和Xho1位点酶切pcDNA3.1-RUNX3质粒,将获得的1300bp RUNX3编码序列插入到pGEX-4T-2中,构建pGEX-4T-2-RUNX3质粒,并转化Ecoli DH5α,筛选阳性重组子,酶切鉴定和...     

GST-hVinexin融合蛋白表达载体的构建及其在原核细胞中的表达

目的构建GST-hVinexin融合蛋白表达载体,并在大肠埃希菌(E.coli)中诱导表达。方法从COS-7细胞中提取mRNA,反转录为cDNA。用PCR方法扩增出hVinexin基因全长,通过BamHI和SalI酶切位点将其定向插入pGEX-4T-2载体中,构建原核表达质粒pGEX-4T-2-hVinexin,并转化E.coli DH5α,通过限制性内切酶酶切电泳和DNA测序鉴定正确后,转入E.coli BL21中,经异丙基硫代β-D半乳糖苷大量诱导表达,SDS-PAGE电泳和Western blot鉴定。结果电泳后酶切结果证实hVinexin大小为990bp,测序证明成功构建了原核表达质粒GST-hVinexin,并诱导表达GST-hVinexin融合蛋白,进一步用Western blot方法验证了其融合蛋白的表达。结论成功构建了GST-hVinexin原核表达载体,并在原核细胞大肠埃希菌表达,为进一步纯化Vinexin及研究其结构与功能提供了前提基础。     

人GST-PTEN融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建人第10号染色体上磷酸酶和张力蛋白同源缺失的基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten,PTEN)原核表达质粒,使其在原核细胞中高效表达并进行纯化。方法将全长片段插入原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组子pGEX-4T-1-PTEN,转化BL-21感受态细胞。经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达PTEN融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析证实蛋白表达的特异性。并用谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-Stransferase,GST)亲和层析对融合蛋白进行纯化。结果成功构建了原核表达载体pGEX-4T-1-PTEN,并将PTEN融合蛋白的成功表达,通过SDS-PAGE电泳、Western印迹分析,证实了蛋白表达的特异性。并对蛋白进行了纯化,获得了GST-PTEN融合蛋白的纯品。结论成功表达、纯化了GST-PTEN融合蛋白,为进一步研究PTEN蛋白的功能及其与其它功能性蛋白的相互作用研究奠定了基础。     

人GRP78蛋白的原核表达、纯化及抗原活性鉴定

目的:构建原核表达质粒pGEX-4T-1 -GRP78,诱导表达、纯化后检测GRP78蛋白的抗原活性.方法:利用PCR方法从本实验室已构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)上扩增GRP78基因,将其克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建重组载体pGEX-4T-1 -GRP78.转化至大肠杆菌BL21( DE3)中诱导表达,再将所表达的融合蛋白进行纯化.经SDS-PAGE分析后,将所得产物用Thrombin切割;进一步包板后用ELISA法对其抗原活性进行评价.结果:酶切和测序结果均证实GRP78原核表达载体构建正确,可诱导表达;ELISA检测显示纯化后的人GRP78抗原具有免疫原性.结论:成功构建了人GRP78基因的原核表达载体,获得了纯化的GRP78蛋白,该蛋白具有良好的抗原活性,为进一步研究以GRP78为基础的肝细胞癌的血清学检测提供了抗原.     

人DOC-2氨基端PID结构域的克隆与原核表达

目的：克隆人DOC—2氨基端PID结构域(暂命名为nDOC-2)，并在原核细胞中表达。方法：用RT—PCR从正常人卵巢组织中扩增nDOC—2基因，并克隆到载体pUC—19中；经测序证实后，用Bam3HI／EcoRI双酶切，亚克隆到原核表达载体pGEx—4T—1，并转化E.coli DH5α菌株。取工程菌，用IPTG诱导表达，对表达产物进行SDS—PAGE鉴定。结果：①经RT—PCR、测序和酶切鉴定，成功地克隆了人nDOC—2基因。②经IPTG诱导的重组质粒pGEX—4T—nDOC—2表达出相对分子质量(Mt)约为5000的融合蛋白，与预期的结果相符。结论：成功克隆到人DOC—2氨基端PID结构域，并在E.coliDH5α中表达出GST-nDOC—2融合蛋白。     

铜绿假单胞菌外毒素衍生物PE38KDEL的原核表达载体构建及其鉴定

目的 构建铜绿假单胞菌外毒素衍生物(PE38KDEL)的原核表达载体并对其表达的蛋白进行鉴定.方法 采用PCR方法扩增本实验所需要的PE38KDEL基因片段,再通过酶切及连接反应构建原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL,重组载体经过限制性内切酶酶切、PCR扩增鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确后,转化感受态大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE电泳后及蛋白免疫印迹法分别测定其大小和特异性.结果 经鉴定证实原核表达载体pGEX-4T-1-PE38KDEL构建成功,且在大肠杆菌BL21中获得了PE38KDEL与GST的融合表达,且表达蛋白产物的分子质量大小与预期值一致,并可被PE的特异性抗体所识别.结论 PE38KDEL在大肠杆菌中获得了高效的融合表达,为下一步研究其功能奠定了基础.