人神经系统特异表达RNA结合蛋白HuC cDNA的克隆、表达及纯化

目的克隆人神经系统表达RNA结合蛋白HuC的cDNA并原核表达纯化。方法提取人神经母细胞瘤SHSY5Y细胞株总RNA,经RT-PCR扩增得到人HuC全长cDNA的克隆。将HuC cDNA克隆到原核表达载体pGEX4T-3载体中,并转化到大肠杆菌中,在获得高效表达后,利用GST纯化系统,对HuC重组蛋白进行纯化。结果经过表达及纯化条件的摸索,最终获得重组HuC蛋白。结论HuC蛋白是一种神经系统表达RNA结合蛋白,重组HuC蛋白的获得为HuC抗体的制备及进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。     

HRV 14 3C蛋白酶在大肠杆菌的融合表达及活性检测

目的人鼻病毒3C蛋白酶具有酶切物异性强且在低温下仍保持较强酶活性的特点而被用作工具酶。为大量获得3C蛋白酶，以融合形式在大肠杆菌中高效表达3C蛋白酶。方法将编码HRV143C蛋白酶的cDNA克隆到pGEX4T-1载体，在大肠杆菌B121（DE3）中表达，经一步GST亲和层析纯化获得GST-3C，再通过体外酶切实验对GST-3C和Thrombin的酶切活性进行比较。结果每升培养产物可获得纯度≥90％的重组融合蛋白约50mg，重组GST-3C在4℃低温下具有比Thrombin更高的酶活性。结论GST-3C蛋白酶不仅可以应用于融合蛋白的酶切，而且为引入3C蛋白酶识别位点的串联亲和纯化（TAP）系统提供又一种酶切工具。     

串联亲和纯化技术:一种极具潜力的分离、鉴定蛋白复合体的工具

大多数细胞的生物学功能都是由蛋白复合体而非单一蛋白来完成的,所以识别和分析蛋白复合体的组分是研究蛋白功能所必需的。串联亲和纯化技术(TAP)能在生理条件下有效地分离、鉴定蛋白复合体,而无需知道复合体的组成或功能,目前已成功地应用于酵母及其他生物体中的蛋白复合体的成分分析。与质谱技术联合应用可以识别与目的蛋白相互作用的蛋白,进而揭示蛋白质相互作用网络及其功能。