含胎牛血清胶原酶消化法培养兔成骨细胞(英文)

背景:成骨细胞原代培养技术已经很成熟,然而各种消化酶单纯作用于原代组织时对成骨细胞膜蛋白有一定影响。目的:为尽可能避免酶对细胞的损害,用含胎牛血清的胶原酶消化胎兔颅盖骨骨组织,进行体外成骨细胞培养,观察加入胎牛血清后胶原酶对成骨细胞消化的效果。设计:对照实验。单位:华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科研究室。材料:实验于2004-03/12在华中科技大学同济医学院附属同济医院骨外科研究室完成。妊娠28d日本大耳白种孕兔2只。方法:将同一个批号的Ⅰ型胶原酶分别用含体积分数为0.15胎牛血清的培养基和DMEM溶液配制成0.1%的含胎牛血清的胶原酶和0.1%不含血清的胶原酶,分别作为实验组和对照组的酶消化液A液和B液。妊娠28d的孕兔,无菌条件下剖腹取出胎兔,然后取胎兔的颅盖骨,剔净、漂洗、剪碎。实验组和对照组分别加5mL37℃的A液和B液消化,两组均用含体积分数为0.15胎牛血清的培养液分别成梯度稀释为0倍、1倍、2倍和4倍后继续消化-培养成骨细胞。锥虫蓝染色测定细胞的存活率,细胞内碱性磷酸酶染色鉴定和测定成骨细胞的纯度,显微镜下观察细胞生长情况。主要观察指标:①用锥虫蓝染色来检测两组细胞的存活率。②以细胞内碱性磷酸酶染色来检测两组细胞的纯度。③用显微镜观察细胞形态来区别两组细胞的生长情况。结果:①细胞锥虫蓝染色结果:通过记数计算,实验组拒染率高达98%,细胞存活率高;对照组拒染率也高达95%,细胞存活率也较高。②细胞内碱性磷酸酶染色结果:实验组碱性磷酸酶染色阳性区域不少于95%,细胞纯度高;但对照组碱性磷酸酶染色阳性区域不超过75%细胞纯度较低。③显微镜下观察结果:实验组细胞饱满凸起,有立体感,细胞生长旺盛,营养充足;而对照组细胞凸起不明显,立体感较差,细胞生长营养较?     

乳兔成骨细胞原代培养与鉴定：改良胶原酶与胰酶的分段消化

背景：成骨细胞获取的方法较多,如何简便而迅速的获得高纯度的成骨细胞成为研究的热点。目的：比较组织块法、胶原酶消化法、改良胶原酶和胰酶分段消化法体外培养纯化乳兔颅骨来源的成骨细胞结果及其细胞的生物学特点。方法：取新生24 h内新西兰大白兔乳兔颅盖骨,采用组织块法、胶原酶消化法和改良胶原酶和胰酶分段消化法分离获取兔原代成骨细胞,并进行传代培养。通过倒置显微镜下形态学观察、锥虫蓝排斥法计数活细胞率及MTT法绘制细胞生长曲线、茜素红染色、细胞培养上清液碱性磷酸酶和骨钙素检测、Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原免疫组织化学法和RT-PCR检测骨钙素和Ⅰ型胶原mRNA的表达等对成骨细胞进行鉴定。结果与结论：分离培养的成骨细胞均一性好、增殖能力强,具备成骨细胞的典型特征,茜素红染色阳性,Ⅰ型胶原免疫组织化学染色阳性,Ⅲ型胶原免疫组织化学染色阴性,细胞培养上清液碱性磷酸酶、骨钙素均有表达,PT-PCR结果有Ⅰ型胶原蛋白和骨钙素mRNA表达。改良胶原酶和胰酶分段消化法较传统胶原酶消化法有更高的细胞获取率,更好的细胞活性,且比传统胶原酶消化法耗时短（P〈0.05）;组织块法操作方法最为简单,细胞活性最高,但是细胞产出率最低、耗时最长,不适合用于成骨细胞大规模培养。用改良的胶原酶和胰酶分段消化法可获得数量较多且纯度较高的成骨细胞,可以成为一种相对可靠、有效的原代成骨细胞的体外培养方法。     

降钙素基因相关肽诱导藻酸钙凝胶复合脂肪干细胞的成骨细胞分化

背景：降钙素基因相关肽已被证实具有诱导成骨细胞分化作用,但其是否可使三维培养下的脂肪干细胞向成骨细胞分化构建组织工程骨的相关报道少见。
　　目的：探讨外源性降钙素基因相关肽诱导兔脂肪干细胞复合藻酸钙凝胶三维培养成骨分化的可行性。
　　方法：取新西兰兔双侧腹股沟区皮下脂肪垫,Ⅰ型胶原酶消化离心贴壁法分离培养脂肪干细胞,取第3代与海藻酸钠混合制备凝胶,于24孔板分组培养：对照组加入含10-2 mol/Lβ-甘油磷酸钠、10-7 mol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸、体积分数10%胎牛血清的DMEM/F-12骨诱导培养基,实验组在此基础上再加入1.5μg/L降钙素基因相关肽进行诱导培养。于诱导不同时间点MTT法检测细胞增殖,RT-PCR法检测诱导细胞Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA的表达,并检测碱性磷酸酶及钙离子浓度。
　　结果与结论：兔脂肪干细胞的增殖曲线呈“S”型,实验组诱导1,3,5,7,14,21 d 的 A 值高于对照组(P<0.05);诱导2周后两组细胞碱性磷酸酶、茜素红染色均阳性,但实验组钙结节较对照组明显增多。实验组诱导7,14 d的Ⅰ型胶原和骨钙素mRNA表达均强于对照组。实验组诱导1,2,3,4周的碱性磷酸酶活性及钙离子浓度均高于对照组(P<0.05)。结果表明降钙素基因相关肽能诱导复合藻酸钙凝胶的脂肪干细胞向成骨细胞分化。     

改良酶消化联合植块法培养兔骨膜成骨细胞

背景:骨膜成骨细胞具有很强的增殖能力和分化成骨潜能,而且取材方便,但以往常规培养方法时间较长,如伺能够缩短培养时间,是骨膜源性成骨细胞成为理想种子细胞的关键之一.目的:应用改良酶消化法培养兔骨膜原代成骨细胞,观察其在喷砂钛片上的黏附及增殖情况.方法:切取雄性日本大耳白兔胫骨近端前内侧面骨膜0.5～1.0 cm~2:①常规方法:以0.25%胰蛋白酶在37℃消化30 min后,用0.1%Ⅰ型胶原酶在37℃消化30 min,不断振荡,弃掉胰蛋白酶后植入培养瓶,干涸培养2 h,加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM完全培养基培养.②改良方法:将Ⅰ型胶原酶消化时间由30 min改为1 h.碱性磷酸酶染色、钙结节染色鉴定成骨细胞.将原代培养成骨细胞与喷砂钛片联合培养,采用扫描电镜、MTT法检测不同时间点成骨细胞在喷砂处理钛片上的黏附及增殖情况.结果与结论:培养第5天,改良法培养的骨膜成骨细胞从组织块周围爬出,第25天细胞汇聚成单层,细胞呈三角形或多角形;传代培养1个月后,可见细胞成复层生长,并有黑色钙结节生成,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、钙结节染色呈阳性.常规法培养的细胞爬满单层时间推迟12 d左右.在喷砂处理的钛片表面上成骨细胞立体感强,有伪足伸出,伪足嵌入小的孔洞内,细胞表面有基质分泌.两种方法培养的成骨细胞在钛片表面的黏附及增殖差异无显著性意义.提示改良消化法可明显缩短成骨细胞培养时间,对成骨细胞的黏附及增殖能力无影响.     

脱蛋白骨为支架材料的体外细胞相容性特点

目的:前期实验应用过氧化氢-乙醚法已成功将天然骨制成脱蛋白骨支架材料,进一步观察脱蛋白骨支架材料与成骨细胞在体外的生物相容性,旨在为组织工程骨构建提供良好的支架材料。方法:实验于2003-01/2005-12在重庆医科大学实验动物中心进行。①酶消化-组织块联合培养法体外培养胎兔颅骨成骨细胞:取新西兰大白兔胎兔颅骨骨块,制成2mm×2mm骨块,Ⅰ型胶原酶室温下消化。再制成1mm×1mm骨块并孵育,待细胞爬满骨块间隙后传代,行细胞形态学观察、碱性磷酸酶染色、钙化结节染色等方法行鉴定。将第3代成骨细胞复苏培养,制成2×1010L-1的细胞悬液备用。②将成年兔干骺端松质骨用过氧化氢-乙醚法制成脱蛋白骨。将备用细胞悬液均匀浸滴在脱蛋白骨上,使细胞悬液渗入材料孔隙内,并行体外复合培养。通过酶消化法、倒置显微镜及扫描电镜了解脱蛋白骨的细胞相容性。结果:①酶消化-组织块联合培养法成功获得胎兔颅骨成骨细胞:倒置显微镜观察示原代细胞呈不规则多边形,传代细胞均为长梭状或长不规则多边型,碱性磷酸酶化学染色示大多数细胞染色呈黑色阳性,钙结节染色示大量黑色的矿化结节分布在细胞外基质。②成骨细胞与脱蛋白骨材料体外复合培养后第3日进入对数生长期;倒置相差显微镜可见复合培养后第7日成骨细胞数量有明显增加,部分细胞出现连接生长;扫描电镜证实复合培养后第7日可见连接成片生长的成骨细胞。结论:过氧化氢-乙醚法制备的脱蛋白骨具有良好的细胞相容性,可作为组织工程骨的支架材料。     

新生大鼠成骨细胞原代培养与鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞是骨组织工程的重要种子细胞之一。但是成骨细胞培养难度大,不同培养方法得到的成骨细胞数量、纯度、增殖及分化活性各有区别。目的：验证及比较成骨细胞原代培养常用的3种方法,探索一种操作简便,既经济又高效的原代培养成骨细胞的方法,为进一步的实验研究奠定基础。方法：取新出生72 h 内SD大鼠乳鼠颅骨,以胶原酶消化法、分段胶原酶消化法及组织块法分离成骨细胞,进行细胞形态观察、细胞化学染色、CCK-8法绘制生长曲线及锥虫蓝排斥法计数活细胞率。结果与结论：分离培养的成骨细胞增殖良好,具备典型成骨细胞特性,细胞化学染色结果明显。胶原酶消化法比分段胶原酶消化法提取的成骨细胞数量多,细胞存活率高(P<0.05);且比分段胶原酶消化法操作简单,耗时短。组织块法操作最为简单,对细胞损伤较小,但是细胞数量低、耗时长,很难用于大规模成骨细胞培养。胶原酶消化法是一种方便、高效、理想的原代成骨细胞分离培养方法。     

新生大鼠心肌细胞原代培养方法的改良

目的探讨酶法分离新生大鼠心肌细胞,提高心肌原代细胞存活率及纯度。方法应用0.1%的Ⅱ型胶原酶消化出生第1d乳鼠的心肌组织,收集的细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基中和,加入DNA酶消化一次,用差速贴壁分离法分离。结果在分离培养新生大鼠心肌细胞过程中,胶原酶和DNA酶的组合使用,并改变差速贴壁时间,可得到高存活率和高纯度的心肌细胞,细胞搏动率高,持续时间久。结论本研究应用改良的新生乳鼠心肌细胞培养方法,心肌细胞存活率高,纯度高,且操作简便,重复性好,是一种较为理想的心肌细胞原代培养方法,可满足实验要求。     

大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景:组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。目的:建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。方法:采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。结果与结论:二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Vonkossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

兔骨髓间充质干细胞向成骨细胞诱导分化的不同培养方法

背景：目前传统骨髓间充质干细胞的培养方法是应用异种血清为培养基，但其存在种间疾病传播、潜在免疫排斥反应甚至是伦理学争议等问题；且与卫生部公布的《组织工程化组织移植治疗技术管理规范》的要求相违背。自体富血小板血浆是生物自体的全血提取物，内含多种且含量丰富的生长因子。
　　目的：使用自体富血小板血浆替代传统异种血清，探讨其对兔骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的影响，方法：从兔髂后上棘穿刺抽出8 mL骨髓并加肝素抗凝，密度梯度离心富集骨髓间充质干细胞，分为自体富血小板血浆组、胎牛血清组，分别加入含10%自体富血小板血浆、体积分数10%胎牛血清。在传至4代时将自体富血小板血浆组和胎牛血清组细胞各自分为实验组和对照组，实验组对培养及成分进行改变；对照组培养基不变。通过生长曲线测定各代细胞的增殖情况；通过对各组细胞进行碱性磷酸酶活性测定，判断其成骨分化状况。
　　结果与结论：骨髓间充质干细胞生长曲线可见各代细胞增殖良好。对第4代各组细胞进行碱性磷酸酶活性检测，培养第12天，第4代自体富血小板血浆实验组及胎牛血清实验组的碱性磷酸酶活性均显著高于其相应对照组；自体富血小板血浆组对照组、实验组碱性磷酸酶活性显著高于胎牛血清组的对照组、实验组，差异有显著性意义(P<0.01)。提示使用自体富血小板血浆替代异种血清培养骨髓间充质干细胞是一种安全可靠、操作简单、纯度活性高的诱导骨髓间充质干细胞的成骨分化方法。     

胰蛋白酶预消化后植块法分离培养人胚成骨细胞

目的:改良成骨细胞分离培养方法,为骨形成、骨代谢以及骨组织工程等基础研究提供种子细胞。方法:实验于2002-09/2005-09在陕西省干细胞工程技术研究中心完成。①无菌条件下取五六个月龄流产胎儿颅盖骨(家属知情同意),去除骨膜及周围结缔组织,然后用2.5g/L胰蛋白酶消化20min,终止消化后,去除骨缝组织,剪碎,将碎骨块接种于培养瓶中分离培养成骨细胞。②细胞纯化采用差速贴壁法。通过相差显微镜观察人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征。③用碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色等方法对所获得的成骨细胞进行鉴定。结果:①人胚成骨细胞原代和传代培养的生长特征:原代培养至第5天,骨块边缘出现零散的细胞,这些细胞的形态主要为梭形、三角形或多边形。原代培养第14天后,形成融合层,细胞呈圆形、卵圆形或方形紧密排列,叠层生长。传代细胞主要呈三角形或方形细胞,细胞排列无方向性,出现集落样生长趋势。②人胚成骨细胞的鉴定结果:90%以上分离获得细胞碱性磷酸酶染色和钙结节染色均呈阳性。结论:采用酶消化后植块的改良植块培养法可在较短时间内获得大量成骨细胞,这些细胞具有典型的成骨细胞形态和功能,是一种较好的分离培养人胚成骨细胞的方法。     

胶原酶二步消化法分离培养牛角膜基质成纤维细胞

背景：获得纯度高、活性强、生物学特性更接近体内状态的角膜基质成纤维细胞是角膜损伤后修复研究的基础。目的：探索体外培养牛角膜基质成纤维细胞的新方法。方法：用Ⅰ型胶原酶对牛角膜基质层进行二步消化分离后制成细胞悬液转入培养瓶中培养,取生长良好的细胞进行传代养。采用锥虫蓝染色检测消化分离后细胞即刻存活率;倒置相差显微镜动态观察细胞的生长状态;波形蛋白免疫组织化染色鉴定角膜成纤维细胞;MTT法检测细胞增殖情况;取处于对数生长期的细胞,绘制细胞生长曲线并计算细胞群倍增间。结果与结论：在体外成功分离培养牛角膜基质成纤维细胞,显微镜下观察及波形蛋白免疫组织化学染色后证实所培养的胞为角膜基质成纤维细胞。锥虫蓝染色,细胞即刻成活率达93.5%。细胞生长曲线近似＂S＂形,其群体倍增时间38.70h。说明二步消化法细胞培养技术简便、经济、高效,为原代培养角膜基质成纤维细胞提供了有效渠道。     

成人骨髓间充质干细胞向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的：研究体外培养的成人骨髓间充质干细胞（hMSCs）在特定的条件下定向诱导分化为成骨细胞,探讨其作为骨组织工程种子细胞的可行性.方法：从骨髓血中提取hMSCs,在含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中培养,以流式细胞仪检测hMSCs的表面抗原表达.传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,相差显微镜观察并绘制生长曲线.免疫组化检测Ⅰ型胶原、骨钙素.NAP法碱性磷酸酶染色、vonKossa法钙结节染色.结果：hMSCs增殖活跃,CD105、CD44表达阳性, CD14、CD34和CD45阴性.诱导培养后碱性磷酸酶、钙结节、Ⅰ型胶原和骨钙素染色阳性.结论：hMSCs取材方便,易诱导分化为成骨细胞,是研究骨组织工程的理想种子细胞.[     

珊瑚羟基磷灰石与成人骨髓源成骨细胞的相容性研究

背景传统的骨缺损修复方法,如自体骨移植、异体骨移植、人工合成替代品等,由于存在种种弊端,难以满足临床需要.组织工程学的建立和迅速发展为骨缺损的修复带来了新的希望,这一技术完全摆脱了以往的模式,通过体外构建、体内重组技术使传统的植骨术具有更广阔的前景.目的研究成人骨髓成骨细胞与珊瑚羟基磷灰石(carolline hydroxyap-atite,CHA)在体外培养条件下的生物相容性,为骨组织工程选择适宜的种子细胞载体.设计随机对照实验研究.地点、材料和干预本实验在解放军第一军医大学南方医院全军创伤骨科中心组织工程实验室进行.抽取健康成年志愿者骨髓组织,置于含100 g/L胎牛血清的DMEM培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium)中培养,传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,分为CHA复合细胞的实验组和单纯细胞的对照组,两组细胞用倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色及扫描电镜进行形态学观察,四甲基偶氮唑盐(MTT)法进行细胞增殖测定、考马斯亮蓝G250法进行细胞蛋白含量测定、碱性磷酸酶试剂盒进行细胞内碱性磷酸酶定量检测.主要观察指标成人骨髓成骨细胞体外培养时复合或不复合CHA的成骨细胞生长状况观察及复合培养细胞功能检测.结果实验组和对照组成人骨髓来源的成骨细胞体外培养时均生长良好,表现出典型成骨细胞的形态特征和生物学特性,CHA有利于细胞贴附、生长与增殖.不同时间点两组细胞的增殖情况、细胞蛋白含量和碱性磷酸酶活性差异无显著性意义(P＞0.05).结论CHA是较理想的骨组织工程支架材料;成骨细胞复合CHA可用于骨缺损的修复.     

机械吹打法大鼠海马神经元原代培养的研究

目的：探讨建立简单、稳定的大鼠海马神经元体外原代培养方法。方法：分离出生24hr大鼠海马组织,采用机械吹打法或胰蛋白酶消化法制备单细胞悬液,以含10％胎牛血清的DMEM／F12培养基接种．24hr后更换含2％B27的DMEM／F12无血清培养基饲养,每3d全量换液,观察神经元形态．培养第7d检测神经元纯度,MTF法测定神经细胞活性,比较两种操作方法的培养效果。结果：机械吹打法可缩短实验操作时间．减少培养污染率,降低了操作难度,培养出的神经元纯度高、活性好。结论：机械吹打法操作简便．结果稳定．是大鼠海马神经元体外原代培养的好方法。     

创伤弧菌攻击对人脐静脉内皮细胞系的影响

背景:创伤弧菌感染后患者死亡率高达50%以上,且感染后大量创伤弧菌侵入血液之中,而血管内皮细胞是阻挡创伤弧菌进入血管的第一道屏障.目的:观察创伤弧菌对人脐静脉内皮细胞增殖能力和细胞形态的影响.方法:将对数生长期的人脐静脉内皮细胞消化后,调整细胞浓度至5×10~8 cfu/L,依培养基中创伤弧菌细菌浓度不同分为5个组:10~4,10~5,10~6,10~7 cfu/L创伤弧菌组和对照组.对照组不加创伤弧菌,仅用体积分数为10%胎牛血清DMEM培养基培养.锥虫蓝拒染法检测细胞存活率、MTT法观察创伤弧菌对人脐静脉内皮细胞增殖的影响,及光镜下观测细胞面积、周长、细胞核的面积、核浆比以及形状不规则指数.结果与结论:随着创伤弧菌作用浓度和时间的增加,人脐静脉内皮细胞的增殖能力逐渐减弱,攻击组细胞的面积和周长,细胞核的面积以及核浆比都比对照组明显增大,形状不规则指数比对照组更偏离.提示创伤弧菌对体外培养的人脐静脉内皮细胞系的增殖有明显的抑制作用,其抑制能力与创伤弧菌作用的浓度和时间有关.     

成人骨髓源成骨细胞体外培养条件下的生物学特性

背景骨髓基质干细胞作为种子细胞构建组织工程化骨组织,具有广泛的应用前景,可作为首选的骨组织工程种子细胞来源.尽管目前对于动物骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导分化的研究已不断深入,但对于成人骨髓基质干细胞大量诱导分化为成骨细胞的研究尚处于探索阶段.目的研究成人骨髓基质干细胞在体外培养条件下的生物学特性及成骨能力,探讨简便易行的成人成骨细胞体外培养方法,为骨组织工程选择理想的种子细胞来源.设计采用完全随机实验对照单盲设计进行横断面研究.地点和对象实验在解放军第一军医大学南方医院全军创伤骨科中心完成,对象为健康成年志愿者骨髓组织.干预抽取骨髓组织,在100 mL/L胎牛血清的DMEM培养基中,置于37℃,50 mL/L CO2湿化空气孵箱中培养,传代后改用含地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的条件培养基培养,用倒置相差显微镜、光镜(HE染色)、扫描与透射电镜观察细胞的形态特征和增殖分化情况,并测定培养细胞的生长曲线(MTT法)、碱性磷酸酶活性和钙结节形成能力.主要观察指标形态学观察和生物学特性检测.结果原代和传代培养的细胞具有活跃的增殖能力,诱导培养2周后,细胞呈多角形或梭形,具有多个突起可互相联结,透射电镜下观察细胞核较为幼稚,细胞器丰富.诱导分化后的细胞可分泌碱性磷酸酶,改良钙钴法染色阳性率可达74.2%,并可形成钙结节,具有与典型的成骨细胞相似的形态特征及生物学功能.结论成人骨髓基质干细胞取材安全方便,易于诱导分化为成骨细胞;本实验方法可作为骨组织工程种子细胞培养的常规方法.