Becker/Duchenne肌营养不良患儿临床表型与基因关联性预测分析

目的 探讨Becker/Duchenne肌营养不良（BMD/DMD）患儿的临床表型与基因型的关联性，为疾病的管理、基因治疗及产前诊断提供理论依据。方法 回顾性分析52例患儿的临床资料及基因检测结果，对52例患儿均采用多重连接探针扩增（MLPA）的方法检测DMD基因，对MLPA检测未发现基因异常的患儿采用外显子芯片捕获结合高通量测序技术（NGS）进行筛查；并对20例先证者的母亲进行了测序验证。结果 结合MLPA和NGS测序技术检测到50例患儿携带BMD/DMD致病基因，检出率为96%。其中，基因缺失36例（69%）、重复7例（13%）、微小突变7例（13%）。在43例存在基因缺失/重复的患儿中，DMD 32例，BMD 11例；37例（86%）符合阅读框架原则，其中DMD 27例（96%），BMD 10例（67%）。7例微小突变均为DMD。结论 阅读框架原则对DMD有极高预测价值，对BMD预测有限。     

Ion Torrent PGMTM平台在儿童遗传性疾病诊断中应用初探

目的:在PCR产物定量混合构建文库方法的基础上,探讨Ion Torrent PGMTM平台二代测序应用于儿科常见遗传性疾病诊断的价值。方法:采集临床诊断的2例肌营养不良、1例胆汁酸合成障碍和1例甲基丙二酸血症患儿的外周血,提取基因组DNA,分别针对DMD基因、HSD3B7 基因、AMACR基因及MUT基因采用PCR反应进行编码区扩增,扩增产物定量混合制备成文库,在PGM上完成测序。使用NextGENe软件进行数据分析。同时采用Sanger测序方法,对上述基因进行全基因测序;肌营养不良病例采用多重连接探针扩增（MLPA ）进行基因外显子拷贝数变异的检测。结果:例1 肌营养不良患儿DMD基因检测到6个变异,其中c.998C>A,p.333S>X为已知致病突变位点,4个为SNP（rs228406、rs1801187、rs1801188、rs1800280）。PGM检测到1个假阳性,为6个连续的T后面插入了1个T。例2 肌营养不良患儿检测到DMD基因 g.2788933943-2790543577共5个外显子的缺失,MLPA检测结果与二代测序结果相符合。例3 胆汁酸合成障碍患儿HSD3B7 基因和AMACR基因共检测到7个变异,其中HSD3B7 基因复合杂合突变c.45-46delAG,FS;c.262G>G/C,p. 88G>RG,5个为SNP（rs9938550、rs3195676、rs10941112、rs2278008、rs2287939）。例4 甲基丙二酸血症患儿MUT基因检测到3个变异,1个为已知致病突变位点杂合突变c.728-729het-insTT,FS;2个为SNP（ rs2229384、rs8589）。PGM检测到2个假阳性。结论:基于PGMTM平台、采用PCR产物定量混合构建文库测序的方法,具有低成本、高通量、高灵敏度以及可灵活设计的特点,适合用于儿科临床常见遗传性疾病的检测。但由于二代测序技术可能带来的假阳性,对于检测到的变异需要Sanger直接测序法进一步验证。     

分子诊断在性别发育异常诊断中的应用

目的 性发育异常是一组多基因介导的遗传性疾病,其遗传学病因异常复杂,但临床表型的多样化,导致临床实践中诊断比较困难.近年来,基因测序技术广泛应用于多种先天性疾病的诊断领域,本研究利用基因测序和基因芯片技术对临床诊断为性发育异常患儿进行基因检测,初步探讨性发育异常的分子病因,探索分子诊断技术用于性发育异常诊断的可能性.方法 22例患儿临床诊断为性发育异常,取全血2 ml并获取DNA.其中5例采用基因芯片技术检测已知的性发育异常相关基因,另17例采用全外显子测序技术检测可能的基因变化.检测结果再采用一代的Sanger测序进行验证.对于阳性发现患儿,取其父、母全血各2 ml,采用Sanger测序探究基因变化来源.结果 5例基因芯片检测患儿中,1例卵睾型性发育异常存在17号染色体中SOX9基因重复(Chr17:70,117,161-70,122,560).其余行全外显子测序17例患儿中5例发现阳性基因变化.这5例致病性基因变化分别为:1例肾上腺发育不良存在DAX1基因错义突变(c.871T＞G,p.W291G),1例肾上腺皮质增生为CYP21A2基因中2个致病性无义突变(c.292+ 1G＞A,c.293-13 A/C＞G),1例Charge综合征为CDH7基因移码突变(c.2916_2917delGT;p.Gln972HisfsX22),2例雄激素不敏感综合征患儿分别存在AR基因错义突变(c.2612C＞T;p.Ala871Val) AR基因错义突变(c.528C＞A;p.Ser176Arg).结论 二代测序技术及基因芯片发现可导致性发育异常的基因突变,可帮助明确病因,提高了诊断精准度.分子诊断技术在性发育异常诊断中的作用已初步显现.     

宁夏地区苯丙酮尿症患儿苯丙氨酸羟化酶基因突变分析北大核心CSCD

目的：分析宁夏地区苯丙酮尿症（PKU）患者苯丙氨酸羟化酶（PAH）基因突变分布特征,了解其热点突变位点及区域。方法采用直接测序的方法,首先对30例宁夏地区 PKU 患者 PAH 基因6个热点突变外显子3,5,6,7,11,12进行测序,对未检出突变的患者再进行外显子1,2,4,8,9,10,13测序。采用多重连接探针扩增（MLPA）方法对于通过测序方法未能明确突变基因型的患者进行外显子大片段缺失突变检测。结果通过对30例患者进行全部外显子序列突变分析,在60个等位基因中明确了58个突变等位,检出率为96.7％。其中在外显子3、5、6、7、11、12检出了49个突变,检出率为81.6％。这58个突变等位分属于23个突变位点,包括错义突变9种、剪接突变9种、无义突变2种、微小缺失突变2种、大片段缺失突变1种。其中 R243Q 突变频率最高（18.3％）,其次是 IVS4-1G ﹥ A（11.7％）和 R111X（11.7％）。在外显子11的测序中发现了一个新的缺失突变 N393del。采用 MLPA 技术在3例患者中检测到了大片段缺失突变 c.-1932＋3402del,其中1例为纯合缺失,2例为杂合缺失突变。结论宁夏地区 PKU 患者 PAH 基因突变具有明显的热点突变和突变热点区域。宁夏地区 PKU 患者存在 PAH 基因大片段缺失突变,MLPA 技术是检测 PAH 基因大片段缺失的有效手段。     

应用DHPLC技术检测非缺失型DMD致病基因的新突变

目的建立检测Duchenne型肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy,DMD）致病基因dystrophin突变的快速、敏感的微小突变筛查系统。方法选择经多重PCR检测未发现dystrophin基因大尺度缺失的DMD患儿20例,年龄在2—10岁,以其基因组DNA为模板,通过PCR反应,分别扩增dystrophin基因外显子及侧翼序列,采用变性高效液相色谱（DHPLC）技术进行突变筛查,对DHPLC峰形变异的外显子片段行PCR产物直接测序,确定突变的具体位点和类型。结果筛查了包括2个缺失热点区dystrophin基因的68个外显子和3＇UTR部分片段,分别在4例患儿中检测出该基因的4种致病突变：c．6808_6811delTTHA,c．4959_4960insA,c．8656C〉T和c．8608C〉T。前两例引起移码突变分别导致p．ku2270Metfsx9和p．Ser1654LysfsX5,后两例为无义突变分别导致p．R2886X和p.R2870X。其中c．6808_6811delTTA,c．49594960insA和c．8656C〉T为文献未曾报道的新突变。结论DHPLC可以作为有效地筛查DMD微小突变的检测方法。     

血友病基因诊断的研究

目的对20名血友病甲患者和4例血友病乙患者进行基因诊断。方法 1血友病甲患者FⅧ基因检测:(1)内含子22倒位检测:首先采用长距离PCR(LD-PCR)对患者FⅧ基因内含子22倒位进行检测;(2)内含子1倒位检测:对内含子22倒位突变阴性患者,采用序列特异性PCR进行内含子1倒位突变检测;(3)点突变检测:对内含子22和1倒位突变阴性患者,针对FⅧ基因26个外显子和外显子-内含子交界区设计引物,采用PCR直接测序法检测点突变;(4)大片段缺失检测:对前三步检测阴性的患者,进一步采用多重连接探针扩增技术(MLPA)检测大片段缺失。2血友病乙患者FⅨ基因检测:(1)点突变检测:针对FⅨ基因的启动子、8个外显子和外显子-内含子交界区设计引物,采用PCR直接测序法检测点突变;(2)大片段缺失检测:对点突变检测阴性者,进一步采用MLPA检测大片段缺失。结果 20例血友病甲患者,共检出内含子22倒位8例,内含子1倒位1例,错义突变5例,插入突变1例,大片段缺失1例,剪切突变4例。4例血友病乙患者检测出错义突变2例,缺失伴插入突变1例,大片段缺失突变1例。其中新发现FⅧ基因突变3例(c.1009+2 CT,c.670+1 GC,c.4798delA),F9基因突变1例(c.938-939indelT)。结论本研究对血友病甲和血友病乙患者的基因诊断阳性率为100%。     

Duchenne肌营养不良家系临床表型及遗传学分析

目的 分析Duchenne肌营养不良（DMD）患儿家系临床表型与遗传学特点。方法 选择基因检测明确诊断为DMD的7例患儿（6个家系）为研究对象，总结家系临床特征、遗传学特点。结果 6个家系中新发突变2个，母源遗传性4个。家系1先证者同时存在DMD基因1处点突变和1处插入突变，均为新发突变；3个家系为DMD基因点突变，1个家系为DMD基因外显子大片段缺失，1个家系DMD基因外显子大片段重复。所有先证者均具有骨骼肌运动障碍和肌酶改变，最小发病年龄为6个月，临床表型轻重不一；所有先证者心脏彩超检查结果均正常；3例先证者伴有轻度智力障碍。仅家系6先证者母亲具有轻度临床表型。结论 基因检测可作为DMD确诊方法，智力障碍亦是DMD较多伴发的临床表型，早期心肌受累症状不显著，女性携带者可有轻度临床症状。     

一个EDA基因新突变导致的少汗性外胚层发育不良家系的遗传学分析

目的对一个临床诊断为少汗性外胚层发育不良患儿的外胚层发育不良候选基因进行二代测序,以期发现致病位点以明确诊断。方法对家系中一例患儿的少汗性外胚层发育不良的候选基因进行二代测序,并利用Sanger测序法对筛选出的可疑致病突变进行验证,同时在家系中其他成员和100例无关联健康个体中检测此突变。结果在患儿和其弟弟(亦为患者)中发现EDA c.300_301delCC(p.Pro101His fs*11)缺失移码突变,其母亲为该突变的携带者,其父亲和妹妹无突变。同时100例无关联正常个体均无此突变。结论EDA基因c.300_301delCC(p.Pro101His fs*11)缺失移码突变可能是该家系中2例患儿罹患少汗性外胚层发育不良的主要原因。     

30例杜氏肌营养不良家系临床表型及基因型分析

目的探讨杜氏肌营养不良(DMD)的临床特点及基因突变类型和分布。方法回顾分析2015年8月至2017年4月收治的30例DMD患儿家系的临床及基因检测资料。结果 30例DMD先证者均为男性;起病时的中位年龄4岁(0.17~9.5岁),确诊中位年龄5.2岁(0.25~10岁);4例(13.3%)有家族史,7例(23.3%)曾被误诊。所有患儿均起病隐匿;肌酸激酶显著升高,为正常上限的18.6~230.0倍。9例行肌电图检查,均提示肌源性损害;1例行肌活检,病理符合DMD改变。30例患儿均行DMD基因检测,异常检出率100%;其中17例(56.7%)为基因缺失突变,9例(30.0%)点突变,4例(13.3%)重复突变;缺失突变以48、49、50号外显子最常见;5例点突变未见文献报道;重复突变均为外显子大片段重复,重复区域包括7~19个外显子不等。30例DMD先证者家系中的49例家庭成员DMD基因检测结果显示,5例基因检测结果与先证者完全相同,也为DMD患者,包括有外公1例,哥哥1例,弟弟3例;21例家庭成员携带与先证者相同的突变基因,为携带者,包括母亲19例和姐姐2例。结论对不明原因肌酶谱升高的男性患儿,应高度警惕DMD,及早行肌电图、肌活检、基因检测确诊。     

30 例杜氏肌营养不良家系临床表型及基因型分析#br#

目的探讨杜氏肌营养不良(DMD)的临床特点及基因突变类型和分布。方法回顾分析2015年8月至2017年4月收治的30例DMD患儿家系的临床及基因检测资料。结果 30例DMD先证者均为男性;起病时的中位年龄4岁(0.17~9.5岁),确诊中位年龄5.2岁(0.25~10岁);4例(13.3%)有家族史,7例(23.3%)曾被误诊。所有患儿均起病隐匿;肌酸激酶显著升高,为正常上限的18.6~230.0倍。9例行肌电图检查,均提示肌源性损害;1例行肌活检,病理符合DMD改变。30例患儿均行DMD基因检测,异常检出率100%;其中17例(56.7%)为基因缺失突变,9例(30.0%)点突变,4例(13.3%)重复突变;缺失突变以48、49、50号外显子最常见;5例点突变未见文献报道;重复突变均为外显子大片段重复,重复区域包括7~19个外显子不等。30例DMD先证者家系中的49例家庭成员DMD基因检测结果显示,5例基因检测结果与先证者完全相同,也为DMD患者,包括有外公1例,哥哥1例,弟弟3例;21例家庭成员携带与先证者相同的突变基因,为携带者,包括母亲19例和姐姐2例。结论对不明原因肌酶谱升高的男性患儿,应高度警惕DMD,及早行肌电图、肌活检、基因检测确诊。     

1例常染色体隐性痉挛性截瘫55型的临床特点和C12orf65基因突变分析

该文报道1例常染色体隐性痉挛性截瘫55型患儿的临床特征及C12orf65基因突变特点。患儿女,8岁,5岁起病,以视神经萎缩为主要临床表现,伴有蹲起缓慢和轻度鸭形步态。提取患儿及其父母和哥哥外周血DNA标本,对患儿进行全外显子组和线粒体基因组测序,并进行Sanger测序验证。结果显示患儿C12orf65基因存在c.394C > T和c.447_449delGGAinsGT的复合杂合突变,前者来自父亲,为已知致病突变;后者来自母亲,是一个未见文献报道的新突变。该研究扩展了C12orf65基因突变谱,为患儿病因诊断及该家系的遗传咨询提供了分子依据。     

儿童铁粒幼红细胞贫血的临床特征及基因突变谱分析

目的 对铁粒幼红细胞贫血（SA）患儿的临床特征和基因突变谱进行分析，探讨目的基因捕获二代测序技术在SA患儿分子诊断中的临床应用价值，提高对SA的早期诊断和临床干预水平。方法 收集36例诊断为SA患儿的临床资料，采用目的基因捕获二代测序方法进行SA相关致病基因、与血红素合成及线粒体铁代谢有关的基因检测，分析基因型与临床表型的关系。结果 36例患儿中，32例为遗传性铁粒幼红细胞贫血（CSA），4例为骨髓增生异常综合征伴环形铁粒幼红细胞（MDS-RS）。共53%（19/36）患儿检测到CSA相关基因突变，其中ALAS2基因突变占47%（9/19），SLC25A38基因突变占21%（4/19），线粒体片段缺失占32%（6/19）。所有MDS-RS患儿均未检测到致病/可能致病性基因突变。89%（17/19）为已知致病突变，11%（2/19）为新变异。ALAS2基因新变异c.1153A > T （p.I385F）评级为"可能致病的"及SLC25A38基因新变异c.175C > T （p.Q59X）评级为"致病的"。结论 儿童CSA以ALAS2及SLC25A38基因突变为主，但线粒体基因片段缺失亦占有相当比例，对于婴儿期即出现的低增生性贫血，需考虑线粒体病的可能。     

进行性假性类风湿性发育不良症的临床诊断及WISP3基因突变分析

目的 从临床及影像学角度识别进行性假性类风湿性发育不良症(PPD);了解PPD的基因突变类型.方法 3例表现为关节疼痛、肿胀及运动障碍的患儿(9～16岁)纳入本研究.根据临床表现、骨骼影像学及实验室检查进行PPD的诊断;采用PCR及直接测序法对PPD家系进行WISP3基因突变分析.结果 3例患儿符合PPD的临床诊断:表现为非炎性的多关节(包括指趾关节)膨大,影像学表现为扁平椎、椎体前缘呈鸟嘴或子弹头样改变、股骨头及外周大小关节骨骺(干骺端)扩大等,血沉、C反应蛋白、类风湿因子等实验室指标正常;3例患儿中发现了3种未见报道的WISP3基因突变,突变类型分别为c.624_625insA/c.729_735delGAGAAAA、c.624_625insA/c.866_867insA及c.866_867 insA/c.866_867insA,均为插入或缺失突变,突变位于外显子4及外显子5,各占50%(3/6).结论 PPD临床特点是进行性、非炎性的多关节(包括指趾关节)膨大及运动障碍,类风湿因子等实验室指标正常;全身骨骼(包括脊柱)的影像学检查对诊断十分重要,主要特征为扁平椎、关节骨骺(干骺端)扩大及关节腔狭窄.发现了3种WISP3基因新变异.     

基于目的基因捕获的二代测序技术对质谱检测阳性患儿的分子诊断

目的运用基于目的基因捕获的二代测序技术,对质谱检测阳性的遗传代谢病疑似患儿进行基因检测,探讨二代测序技术在遗传代谢性疾病诊断的应用价值。方法回顾性收集复旦大学附属儿科医院遗传代谢专科门诊收治的、质谱检测阳性遗传代谢病疑似患儿的剩余干血滴滤纸片,行目的基因捕获的二代测序,行Sanger进行验证。结果 2013年6月至2014年5月共有48例质谱检测阳性的遗传代谢病疑似患儿纳入本文分析,40例完成二代测序,男性22例。40例测序标本中,29例(72.5%)检测到与临床症状相符的基因变异,包括甲基丙二酸血症6例,citrin缺陷病6例,高苯丙氨酸血症5例,戊二酸血症3例,其他遗传代谢病9例。2例疑似citrin缺陷病的标本在SLC25A13基因上仅检测到单个致病性突变,进一步行长片段PCR,检测到2例标本均存在3 kb的杂合插入突变。结论基于目的基因捕获的二代测序技术在对临床疑似遗传代谢病的检测中,有着较高的阳性诊断率,不仅能为临床医生提供可靠的分子诊断依据,而且可以根据致病基因对疾病分型,有效地为后续的临床治疗和遗传咨询提供依据。     

ANK1和SPTB基因突变致遗传性球形红细胞增多症的临床特点及遗传学分析

该研究对5例遗传性球形红细胞增多症（HS）患儿的临床特点及ANK1和SPTB基因突变特征进行分析。5例患儿均通过外周血基因检测确诊。5例患儿均表现为贫血、黄疸、脾肿大。红细胞渗透脆性试验显示3例增高;Coombs试验、葡萄糖6磷酸脱氢酶测定、蔗糖溶血试验、酸化血清溶血试验、地中海贫血基因检测均为阴性;外周血涂片球形红细胞计数仅1例增加。高通量测序发现病例1~3存在ANK1基因突变,分别为c.3398（exon29）delA、c.4306C > T以及c.957（exon9）_c.961（exon9）delAATCT,其中c.3398（exon29）delA未见报道;病例4的SPTB基因存在C.318delGExon3突变;病例5存在SPTB基因合并SLC4A1基因突变,其中SPTB基因c.3484delC为自发突变,SLCA4A1基因的突变位点来自父亲,为非致病基因。该研究提示,贫血、黄疸、脾肿大是HS患儿主要的临床表现;多数HS患儿外周血球形红细胞计数无明显异常;基因检测有助于HS的精准诊断。     

SRD5A2基因新型复合杂合突变致类固醇5-α还原酶2型缺乏症的遗传变异分析

该文报道1例类固醇5-α还原酶2型缺乏症患儿的临床特征及SRD5A2基因突变特点。患儿男性，2月龄，生后即出现尿道下裂及阴茎短小。提取患儿及父母外周血DNA，通过高通量测序技术对患儿DNA样本进行内分泌疾病相关基因的捕获测序，并对家系DNA样本进行Sanger测序验证。结果显示患儿SRD5A2基因存在c.680G > A（p.R227Q）和c.608G > A（p.G203D）复合杂合突变，其中c.680G > A来源于其父亲，为已知致病性突变，c.608G > A来源于其母亲，为新发现的突变。该研究为患儿病因诊断及该家系的遗传咨询提供了分子依据，并扩展了SRD5A2基因突变谱。     

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??Objective??To analyze the clinical and gene mutation characteristics of Duchenne progressive muscular dystrophy ??DMD????summarize the gene mutation hotspots in 97 cases and to explore the correlation between clinical manifestations and genotype. Methods??Totally 97 patients with DMD diagnosed by genetic examination from January 2014 to 2018 were collected and analyzed. The clinical manifestations??serum analyses and gene mutation results were analyzed. Results??The main clinical manifestations of 97 patients??96 boys?? were feeding difficulties?? increased muscle enzyme and limb weakness. Creatine kinase??CK???? lactate dehydrogenase??LDH?? and aspartate aminotransferase??AST?? muscle enzymes were significantly increased. By combining deep-sequencing technologies??the large deletions of DMD gene mutation was in 62 cases??63.92%????there were 11 cases??11.34%?? of large duplication mutation??and 24 cases??24.74%?? of point mutation. All of the mutations could occur in any position in the DMD gene??but there were two hot spots??45 cases were located in the central region gene exon 45??55??72.58% ????12 cases of deletion mutation were located in 5’exon end exon 2??19 area??19.35%??. Conclusion??The main clinical manifestations of the DMD children are feeding difficulty??increased muscle enzyme and limb weakness. The patients with significantly increased muscle enzyme should receive a timely defection of DMD gene.