人Elf5基因真核表达质粒的构建及其亚细胞定位

目的：构建人Elf5真核细胞表达质粒,并研究其在乳腺癌MCF7细胞中的亚细胞定位。方法：PCR扩增人Elf5基因,将其克隆入真核表达载体pEGFP-C1中,构建含人Elf5基因的真核表达质粒pEGFP-hElf5。利用酶切鉴定,DNA测序,免疫印迹及免疫荧光方法鉴定Elf5真核表达质粒及Elf5蛋白的亚细胞定位。结果：经酶切鉴定、DNA测序、免疫印迹方法确认Elf5基因成功导入真核表达载体pEGFP-C1。瞬时转染MCF7细胞,Elf5蛋白表达在细胞核中。结论：pEGFP-Elf5真核表达质粒构建成功,Elf5定位在细胞核中。     

人截短型线粒体凋亡诱导因子蛋白的克隆、表达及诱导肝癌细胞凋亡的活性鉴定

背景与目的:线粒体在细胞凋亡中扮演关键的角色,线粒体凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor,AIF)是定位于线粒体中的一种重要的凋亡蛋白,对线粒体蛋白质的研究可深入阐明线粒体在凋亡中的作用.本研究的目的在于克隆、表达重组的人截短型AIF,并对其诱导肿瘤细胞核凋亡的生物学活性进行鉴定.方法:采用RT-PCR技术从人肝癌细胞SMMC-7721中扩增出剪切掉线粒体定位信号的人AIF基因片段,并按阅读框克隆到原核表达载体pET32a( )中.进行酶切与测序鉴定后,以构建的正确重组质粒pET32a-AIF转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下表达AIF蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Western blot检测;采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白;采用凝胶滞后实验(EMSA)与Hoechst 33258染色检测AIF蛋白的生物学活性.结果:获得了去掉线粒体定位信号的AIF基因,并克隆到pET32a( )载体中,经酶切与测序鉴定完全正确.此重组质粒转化人大肠杆菌,经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量约Mr 70 000的目的蛋白;表达量约占菌体蛋白总量的11%,表达的目的蛋白与抗His标签抗体与抗人的AIF蛋白具有良好的反应性;纯化后,AIF的纯度达到95%.经EMSA与Hoechst 33258染色实验证实:获得的AIF蛋白具有良好地与DNA结合并可诱导肿瘤细胞核凋亡的能力,凋亡率为37%.结论:人AIF基因在PET表达系统中得到有效表达:蛋白复性后能有效地在体外与DNA结合,并可诱导细胞凋亡.     

T淋巴瘤TOCRVβ核酸疫苗的构建和生物学活性的初步检测

T淋巴瘤是某种重排的T细胞恶性增殖的结果,这种恶性增殖T细胞上特异的TCR可以看作肿瘤特异性或相关抗原.本研究目的是制备T淋巴瘤TCRVβ核酸疫苗,诱导机体产生针对恶性增殖的T细胞克隆的免疫反应.从人T淋巴瘤细胞Jurkat中提取总RNA.合成cDNA.根据Jurkat细胞TCRVβ的基因序列设计引物,用PCR扩增TCRVβ的基因片段.PCR产物和表达载体pcDNA3经KpnⅠ和BamHⅠ双酶切后,回收酶切片段,用T_4 DNA连接酶连接.连接产物转化E.Coli DH5a,筛选阳性克隆,提取质粒,进行双酶切鉴定.大量提取双酶 切鉴定为正确的重组载体pcDNA3-TCRVβ,PEC法纯化后测序.用磷酸钙沉淀法将重组载体转染SP2/0细胞,24h后加200μg/ml G418筛选培养,挑取阳性克隆扩     

pcDNA3.1(+)-Hsp70144-517As重组质粒构建及其转染Bcap-37细胞后细胞凋亡的研究

目的构建人反义Hsp70重组质粒[pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As]并观察其对乳腺癌Bcap-37细胞凋亡特性的影响。方法依照人hsp70mRNA全长序列，通过计算机分析，设计一对引物，在上游引物中带有1个BamHⅠ位点，经RT—PCR扩增、电泳、回收和纯化hsp70144—517片段，通过T—A克隆到pGEM—TEasy原核表达质粒中，经DNA测序和EcoRⅠ酶切图谱鉴定；EcoRⅠ酶切产物回收后亚克隆到pcDNA3．1（＋）质粒中EcoRⅠ位点之间，利用BamHⅠ酶切图谱筛选反向插入重组质粒，经DNA测序得到pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As重组质粒。以脂质体介导法将pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As转染列乳腺癌Bcap-37细胞中并克隆培养建株得到AsHsp—Bcap细胞。以DNA琼脂糖凝胶电泳及流式细胞周期分析观察转染细胞的凋亡特性。结果本研究成功构建人反义hsp70重组质粒[pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As]；转染到乳腺癌Bcap-37细胞后在DNA琼脂糖凝胶电泳上观察到细胞凋亡特征性DNA Ladder及流式细胞周期分析发现G1峰前有1个特征性Ap峰（亚二倍体峰）。结论构建人反义重组质粒pcDNA3．1（＋）-Hsp70^144-517As对乳腺癌Bcap-37细胞有促进细胞凋亡的作用。     

携带凋亡素基因重组腺病毒的制备及诱导结肠癌细胞凋亡的实验研究

摘 要：［目的］ 利用细菌内同源重组法构建携带凋亡素VP3基因的重组腺病毒并观察其体外诱导结肠癌细胞凋亡的作用。［方法］ 设计VP3 cDNA扩增引物,从PET15b-VP3质粒中扩增VP3的DNA序列,与线性pShuttle-IRES-hrGFP连接构建pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒,PCR和EcoR Ⅴ酶切电泳鉴定;重组穿梭质粒经Pmel酶切线性化后,转化含pAdeasy-1的超感受态BJ5183大肠杆菌,细菌内同源重组法构建重组腺病毒质粒pAd-VP3-hrGFP,PCR、PacI酶切电泳及测序鉴定;线性化重组腺病毒质粒经脂质体转染AD293细胞进行pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒的包装和扩增,CsCI密度梯度离心法进行病毒浓缩和纯化并将其作用人结肠癌SW480细胞,观察其对细胞凋亡及周期分布的影响。［结果］ pShuttle-VP3-hrGFP重组穿梭质粒构建成功;pAd-VP3-hrGFP重组腺病毒质粒经酶切获得一大于23kb的大片段和4.5kb的片段,PCR反应扩增出402bp的片段,测序证实VP3-hrGFP编码区成功克隆入腺病毒pAd中,且其序列与GeneBank中VP3序列完全一致;成功包装出携带VP3基因的腺病毒,滴度为1.738×1012opu/ml,重组腺病毒可阻滞结肠癌细胞周期于G0/G1期,诱导细胞凋亡,MOI值越大作用效应越显著(P<0.05,P<0.01)。［结论］ 细菌内同源重组法可快速、高效制备携带凋亡素基因的重组腺病毒,并具有较强的抗肿瘤作用,为深入研究VP3基因功能提供了选择。     

白细胞介素1β转换酶基因转导人肝癌细胞株的建立及其生物学特性研究

应用基因重组技术构建了人细胞凋亡基因白介素iβ转换酶(ICE)重组逆转录病毒载体pLXSN-hICE,采用电穿孔法将其与空载体pLXSN导入包装细胞系PA317,筛选G418抗性克隆,并将其病毒上清转入人肝癌细胞株SMMC7721,经G418筛选分别获得阳性克隆SMMC7721-hICE及SMMC7721-neo.RT-PCR分析证实目的基因已整合在SMMC7721-hICE细胞基因组中.细胞生长曲线测定及裸鼠致瘤性分析表明SMMC7721-hICE体外生长速度明显低于对照细胞SMMC7721及SMMC7721-neo,而且在裸鼠体内成瘤性降低(前者3/6,后者6/6),肿瘤发生延缓,肿瘤重量明显减轻.以上结果表明,逆转录病毒介导的人ICE基因转染使肝癌细胞恶性增殖明显受抑,为开展人ICE基因治疗提供了实验基础.     

TRAIL真核表达治疗肝细胞癌作用的研究

目的：构建鼠源TRAIL（mTRAIL）真核表达质粒。研究其体内、外表达对肝癌细胞的诱导凋亡作用，抑制肝癌生长作用及与重组人FN多肽真核表达质粒pCH510协同抑制肝癌生长作用。方法：采用RTPCR及重组DNA技术构建mTRAIL真核表达质粒；体内、外进行基因转染；用流式细胞仪检测肝癌细胞凋亡率，用TdTmediated dUTP nick end labeling (TUNEL)法及免疫组织化学技术检测肝癌细胞凋亡；小鼠实体瘤块模型研究基因转染抑制肝癌生长作用。结果：用RTPCR方法自小鼠脾细胞RNA扩增出TRAIL基因的全长cDNA，并克隆至真核表达载体pcDNA3.1中获重组质粒pX1；以pX1转染BHK细胞株后攻击肝癌细胞株H22细胞，可检测到肝癌细胞凋亡；肌肉内注射转染质粒DNA pX1，通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肝癌生长；pX1与FN多肽真核表达质粒pCH510有协同抑制肝癌生长作用。结论：质粒pX1可在细胞及小鼠体内表达；体内、外表达可诱导肝癌细胞凋亡并可通过该机制抑制肝癌生长；与FN多肽真核表达质粒pCH510有协同抑制肝癌生长作用。     

rAAV-Slug-siRNA载体的构建及其抗胰腺 癌的实验

 目的构建并制备携带目的基因的rAAV-EGFP-Slug-siRNA（Slug-siRNA）病毒载体,探讨Slug干扰抗 胰腺癌作用。方法首先构建pDC316-EGFP-Slug-siRNA质粒,以PCR鉴定正确的pDC316-EGFP-Slug-siRNA克隆 为模板扩增EGFP-Slug-siRNA片段,EcoRⅠ和SalⅠ双酶切回收PCR产物; 酶切pSNAV2.0-lacz-α载体质粒, 并与上述产物进行连接;转化感受态大肠杆菌DH5α,得到重组质粒pSNAV2.0-EGFP-Slug-siRNA,酶切和测 序对其进行鉴定。建立载体细胞株BHK/Slug-siRNA, 大规模制备rAAV2-EGFP-Slug-siRAN并对其纯化、鉴 定和滴度测定。将体外培养的胰腺癌细胞株AsPC-1转染Slug-siRNA和pSNAV2.0-EGFP空载体。Western blot及RT-PCR方法鉴定转染前后AsPC-1细胞内PUMA及Slug蛋白及mRNA表达,MTT比色法检测细胞存活率, TUNEL检查细胞凋亡。结果携带编码靶向Slug的小发夹状干扰RNA序列的腺相关病毒载体质粒pSNAV2.0- EGFP-Slug-siRNA,经PCR、酶切和测序鉴定,质粒构建正确。将构建成功的载体质粒与重组Ⅰ型单纯疱疹 病毒HSV1-rc/ΔUL2共转染包装细胞BHK-2,成功复制和包装出重组腺相关病毒Slug-siRNA,经检测目的片 段插入成功,滴度为9.23×1010(puf)。Slug-siRNA有效抑制AsPC-1细胞内Slug表达,抑制体外细胞增殖 ,促进细胞凋亡,同时,伴随着Slug表达的下降,细胞内PUMA表达明显增加。结论成功制备出高滴度携带 目的基因的Slug-siRNA病毒载体。干扰Slug表达抑制胰腺癌细胞增殖,促进细胞凋亡,其机制可能通过解 除Slug对PUMA基因的抑制有关。     

人BDNF重组逆转录病毒载体的构建

目的 构建PLEGFP-BDNF真核表达重组逆转录病毒，为进一步在细胞中表达及移植治疗作准备。方法 按照hBDNF基因全长编码序列设计合成引物，从人基因组DNA中扩增出744bp的hBDNF基因片段，插入到PMD18-T载体上，转化DH5α大肠杆菌菌株，获得PMD18T-BDNF克隆，对该克隆进行限制性酶切分析和DNA序列测定；从阳性克隆中获取hBDNF全长编码片段，与真核表达载体PLEGFP质粒连接，构建PLEGFP-BDNF真核表达重组质粒。重组质粒转化大肠杆菌JMl09，再经氨苄LB培养基筛选，酶切，PCR与测序鉴定。结果PLEGFP-BDNF重组逆转录病毒构建成功。结论hBDNF在大肠杆菌中的成功表达在转基因治疗CNS病变方面具有潜在应用价值。     

抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因的克隆及其原核表达载体的构建

目的 克隆抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因(VH)，并构建其原核表达载体。方法从能分泌抗人膀胱癌单克隆抗体的杂交瘤细胞BDI-1中提取总RNA，通过RT-PCR扩增出VHcDNA。用HindⅢ和XhoⅠ酶切纯化的RT-PCR产物和原核表达载体pET28a( )，在T4DNA连接酶作用下室温连接。重组质粒经酶切鉴定，阳性克隆测序并进行序列分析。结果扩增出VHcDNA片段，大小约为370bp，重组质粒的酶切鉴定结果与预期一致。VH基因序列长度为366bp，编码122个氨基酸。VH基因属于鼠免疫球蛋白重链11亚类。结论成功克隆出抗人膀胱癌单克隆抗体重链可变区基因，并成功构建其原核表达载体。     

细胞周期蛋白C基因克隆与重组质粒pCMV-tag2B-CCNC的构建与鉴定

[目的]克隆人细胞周期蛋白C基因（human cvclin C，CCNC），构建真核表达载体，诱导并鉴定其表达。[方法]利用逆转录多聚酶链反应mT-PCR）法，以急性淋巴细胞性白血病细胞株6T-CEMmRNA为模板，扩增CCNC基因，将克隆获得的CCNC全长cDNA片段构建重组表达载体pCMV-tag 2B—CCNC，用脂质体Lifefectamine2000将重组质粒转染至6T-CEM细胞系，诱导其表达，Western Blot鉴定其表达。[结果]电泳获得944bp预期序列，pCMV-tag2B—CCNC经双酶切鉴定及序列分析证实为正确的有完整读码框的CCNC基因，将pCMv-tag2B_Sorcin导入6T-CEM细胞并成功表达，目的蛋白经Western blot鉴定具有生物学活性。[结论]经测序及酶切鉴定，成功克隆了CCNC的cDNA，并成功构建了CCNC真核表达质粒pCMV-tag2B—CCNC，重组质粒能表达具有生物学活性的CCNC蛋白，为研究CCNC的功能打下了基础．     

携带DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒包装质粒pSANV2.0的构建

[目的]构建携带DREAM基因小分子干扰RNA（siRNA）的腺相关病毒载体包装质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,为进一步研究DREAM基因在癌痛基因治疗中的作用奠定基础。[方法]设计并合成包含DREAM短发夹序列（shRNA）两条互补的寡核苷酸链,退火后插入到经过EcoRⅠ和SalⅠ双酶切的pDC316-EGFP-U6质粒的EcoRⅠ和SalⅠ位点,得到重组质粒pDC316-EGFP-DREAMshRNA-U6,然后以其为模板,通过PCR扩增DREAMshRNA-EGFP片段,并引入EcoRⅠ和SalⅠ位点,PCR产物与pSANV2.0经EcoRⅠ和SalⅠ酶切后连接得到重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP,转化入感受态大肠杆菌DH-5α,获得阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定。[结果]PCR、酶切鉴定以及测序结果证实,插入的片段序列和位点完全正确,重组质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP的构建成功。[结论]成功构建携带DREAM基因小分子干扰RNA重组腺相关病毒包装质粒pSANV2.0-DREAMshRNA-EGFP。     

GM-CSF-Survivin融合基因的构建及其在树突状细胞的表达

目的:构建以Survivin为肿瘤抗原,GM-CSF为基因佐剂的融合基因,并将该融合基因转入DC,研究DC疫苗抗肿瘤治疗的新方法。方法:参照GenBank收载的Survivin基因序列设计引物,提取HT-29肿瘤细胞中的mRNA,经RT-PCR反应获得野生型Survivin cDNA基因片段。人工合成GM-CSF、Survivin两端和中间连接接头引物。PCR反应获得GM-CSF、Survivin DNA片段。经BamHⅠ酶切,T4DNA连接酶连接获得GM-CSF-Survivin融合DNA。以此DNA为模板,用两端引物作PCR扩增以获得较纯的融合DNA片段。经EcoRⅠ、HindⅢ双酶切后与相同双酶切的pcDNA3.1(-)载体质粒混合,加入T4DNA连接酶,16℃连接20h。用连接物转化大肠杆菌DH5α,挑选克隆提取质粒。结果:经PCR和限制性内切酶酶切初步鉴定后,选取一株送样作DNA序列测定,结果与设计序列完全一致。质粒定名为pcGM-Sur,用jetPEITM-Macrophage转染体系,将构建的pcGM-Sur质粒转染DC。采用RT-PCR和Western blot检测到DC中的融合基因mRNA和表达的Survivin抗原。结论:质粒pcGM-Sur DNA序列与设计完全一致,转染DC后能转录出完整的融合基因mRNA并表达出具有Survivin抗原性的融合蛋白。     

Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的：扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法：以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果：成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论：Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

Survivin基因启动子调控的肿瘤特异性表达载体的构建

目的:扩增survivin基因启动子,构建survivin启动子调控的真核表达载体,验证其在肿瘤细胞的特异性表达。方法:以Hep-2细胞基因组DNA为模板,PCR扩增survivin启动子;利用核酸内切酶双酶切sur-vivin启动子基因片段和pShuttle质粒,构建载体pSurp,酶切和测序鉴定;分别双酶切pSurp载体和pEGFP-C1载体,构建survivin启动子调控的真核表达载体pSurp-EGFP,脂质体转染Hep-2细胞及血管内皮细胞ECV304,荧光显微镜下观察EGFP的表达,Western blot方法验证该基因的蛋白表达。结果:成功扩增survivin基因启动子并构建survivin基因启动子调控的pSurp-EGFP真核表达载体。脂质体法转染Hep-2细胞和血管内皮细胞ECV304,在荧光显微镜下见Hep-2细胞发出较强的绿色荧光,而ECV304细胞没有绿色荧光;Western blot的结果也确证了EGFP蛋白仅在Hep-2细胞表达。结论:Survivin启动子的成功克隆与其真核表达载体的构建,为肿瘤的特异性基因治疗奠定了实验基础。     

凋亡素诱导人成骨肉瘤细胞多药耐药株凋亡的研究

目的:研究凋亡素对人成骨肉瘤细胞0S-732多药耐药株R-OS-732的作用.方法:凋亡素基因VP3经酶切后克隆入质粒pIRES1,获得重组质粒pIRVP3,通过脂质体法pIRVP3转染R-0S-732细胞,RT-PCR检测凋亡素在细胞中的表达;光镜及电镜下观察瘤细胞;提取瘤细胞基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳;流式细胞仪检测凋亡率.结果:凋亡素基因已在转录水平表达;光镜及电镜下两组细胞形态变化明显;电泳见转染组DNA呈梯状条带,对照组为单一条带;转染组凋亡率明显高于空白对照组(P＜0.01).结论:凋亡素可有效诱导R-OS-732细胞凋亡.     

p53基因诱导胱癌细胞HTB9凋亡及相关基因的表达

目的 研究野生型p53基因诱导膀胱癌细胞凋亡的作用,及其对凋亡相关基因bcl-2、bax和ICE表达的调控。方法 将野生型p53基因重组腺病毒载体转染人膀胱癌细胞HTB9,应用RT－PCR检测bax的mRNA表达水平,应用免疫组化法检测bcl-2、bax和ICE蛋白表达水平,以DNA琼脂糖凝胶电泳、脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口末端标记技术（TUNEL）和流式细胞仪检测细胞凋亡。结果 野生型p53基因导入可诱导HTB9细胞凋亡,凋亡细胞百分率可达50．4％;bax mRNA和蛋白水平增高,ICE和Bcl-2蛋白水平分别增高和下降。结论 野生型p53基因很可能是通过调控凋亡相关基因ICE、Bax和Bcl-2的表达来诱导细胞凋亡。     

人IL-2基因克隆及其重组腺病毒载体的构建

目的克隆人白细胞介素2基因（hIL-2），构建其重组穿梭载体pAdBM5-GFP—hIL-2。方法：应用PHA体外刺激培养的Jurkat细胞以促进hIL-2基因表达．设计特异性引物，应用RT—PCR法扩增hIL-2基因。将测序正确的片段用PmeⅠ和BglⅡ双酶切定向插入到pAdBM5-GFP穿梭载体中，酶切鉴定。结果：RT—PCR方法，成功克隆了hIL-2基因，并构建出pAdBM5-GFP-hIL-2真核表达载体．克隆的hIL-2序列全长528bp，含462个碱基开放读框．结论；构建含人白细胞介素2基因片段的重组腺病毒表达载体（pAdBM5-GFP—hIL-2），为下一步扩增重组腺病毒开展肝癌的免疫与基因治疗研究奠定基础．     

凋亡抑制蛋白Livin 两种异构体原核表达载体的构建及融合表达

 目的 构建凋亡抑制蛋白Livin两种异构体（Livinα和β）的原核细胞表达载体pET32a（＋）-livinα和pET32a（＋）-livinβ。方法 设计合成扩增Livin基因异构体全长cDNA序列的特异性PCR引物,以Hela细胞总RNA为模板,RT-PCR获得Livin基因异构体全长cDNA序列,用限制性内切酶BamHⅠ和HandⅢ双酶切取所需目的片段,并插入原核表达载体pET32a（＋）的多克隆位点,经酶切、PCR鉴定,并经过测序证实后,构建成为Livin基因异构体表达载体（pET32a（＋）-livinα、β）。将重组质粒转入表达菌株BL21,诱导表达收集菌液,超声碎菌,取其上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。结果 成功获得Livinα和β全长cDNA序列,并克隆到原核表达载体pET32a（＋）上;成功获得大小为55kd左右的融合蛋白。结论 Livin基因两种异构体原核表达载体的构建及其融合蛋白的制备,为进一步研究Livin异构体功能及在肿瘤细胞中的抗凋亡效应奠定了基础。此蛋白也可用于进一步抗体制备、免疫鉴定和诊断等研究。