低氧状态下红景天苷经HIF-1α信号通路调节人成骨样MG-63细胞表型表达的研究

目的研究低氧状态下红景天苷对成骨细胞表型表达的调控作用及其作用机制。方法 MTT法检测细胞增殖能力;采用Annexin V/PI双染法分析低氧诱导的细胞凋亡情况;磷酸苯二钠法检测成骨细胞分化的早期标志性基因碱性磷酸酶(ALP)活性;RT-PCR技术检测低氧诱导因子(HIF)-1α、血管内皮生长因子(VEGF)、抑癌基因VHL蛋白(p VHL)、骨钙素(OC)、成骨细胞特异性转录因子Runx2及Osterix mRNA表达水平;采用ELISA法检测VEGF及OC的蛋白表达水平和I型胶原的含量;Western blot技术检测HIF-1α、p VHL、Osterix、Runx2的蛋白表达水平;免疫荧光共聚焦显微镜技术观察HIF-1α的核转位情况;荧光素酶报告基因检测技术检测HIF-1α的转录活性。结果低氧状态下红景天苷促进MG-63细胞增殖,抑制由低氧诱导的MG-63细胞凋亡,促进Osterix、Runx2表达及通过增加ALP活性、Ⅰ型胶原和OC含量促进成骨细胞分化成熟。进一步研究发现,低氧状态红景天苷可下调HIF-1α的表达及核转位,而上调其转录活性及下游靶基因VEGF的表达。结论低氧状态下红景天苷通过调节HIF-1α/VEGF信号通路促进成骨细胞增殖和分化,同时抑制由低氧诱导的成骨细胞凋亡。     

蕲蛇酶对血管内皮细胞纤维蛋白溶解功能的影响

目的　研究蕲蛇酶对体外培养人脐静脉内皮细胞纤溶活性的影响 ,探讨其抗栓作用机制。方法　采用人脐带来源的脐静脉内皮细胞进行原代及传代培养 ,以光镜、电镜、第Ⅷ因子相关抗原免疫组化等方法鉴定内皮细胞 ,采用发色底物法 (S2 2 51 )测定内皮细胞培养液中组织型纤溶酶原激活剂(t PA)及组织型纤溶酶原激活剂抑制物 (PAI)的活性 ,ELISA法测定培养液中纤维蛋白降解产物的含量。结果　所培养的细胞具有特征性Weibel palade小体 ,第Ⅷ因子特异性抗原阳性。蕲蛇酶使细胞培养液中t PA活性升高 ,t PA/PAI比值升高 ,纤维蛋白降解产物明显增加。结论　蕲蛇酶具有促进血管内皮细胞释放t PA ,提高其纤溶活性的作用。     

血管内皮生长因子对兔肾血管内皮细胞体外培养的影响

目的 探索血管内皮生长因子（VEGF）对兔肾血管内皮细胞（MVECs）体外培养的影响。方法采用三步梯度筛网法，获得纯度较高的肾血管球，0．5％胶原酶Ⅳ37℃消化15～20min，离心沉淀获取血管内皮细胞，分加与不加VEGF培养。对培养的细胞用倒置显微镜观察常规形态，用免疫组化法进行第Ⅷ因子相关抗原鉴定，用透射电镜观察细胞浆Weibel-Palade小体，用间接免疫荧光法检测CD31、CD34及CD44的表达。结果加VEGF的MVECs原代3d铺满瓶底，3～4d传一代；不加VEGF的MVECs原代7～12d铺满瓶底，7～8d传一代。鉴定时两种培养的MVECs表达是一致的。倒置显微镜观察细胞铺满瓶底时呈典型的铺路卵石样结构，免疫组化法第Ⅷ因子相关抗原阳性，透射电镜观察到细胞浆中的Weibel-Palade小体，间接免疫荧光法检测CD31、CD34表达阳性，CD44阴性。结论VEGF对MVECs体外培养的影响无显著意义。     

淫羊藿苷对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤的保护作用

目的研究淫羊藿苷对过氧化氢所致血管内皮细胞损伤的影响。方法体外培养血管内皮细胞,淫羊藿苷预处理24h后,采用过氧化氢诱导氧化损伤模型,MTT法测定细胞活性,测定细胞培养液中乳酸脱氢酶（LDH）的释放、细胞中丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）的活力。结果淫羊藿苷能明显提高细胞存活率,增加细胞内SOD活性,降低培养液中LDH释放和细胞内MDA含量。结论淫羊藿苷对过氧化氢诱导的血管内皮细胞损伤有明显的保护作用,可能与其抗氧化有关。     

酸性成纤维细胞生长因子对顺铂所致血管内皮细胞损害保护作用的实验研究

目的研究酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对顺铂(DDP)引起的体外培养的血管内皮细胞损害的保护作用。方法通过组织块法获取血管内皮细胞、Ⅷ因子相关抗原免疫细胞化学染色鉴定,纯化后传代接种于96孔培养板:(1)培养24 h后加入一系列浓度的DDP,再培养24 h后用MTT法检测细胞存活率;(2)培养24 h后在系列DDP浓度的基础上加入一定浓度的aFGF,继续培养24h后用MTT法检测细胞存活率。结果 aFGF能使DDP对血管内皮细胞的半数抑制浓度(IC50)升高。结论 aFGF对DDP损伤的血管内皮细胞有一定的保护作用。     

白花丹参对过氧化氢致人脐静脉血管内皮细胞损伤的保护作用

目的研究白花丹参对过氧化氢（H2O2）所致人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）损失的保护作用。方法应用酶消化灌注法培养人脐静脉血管内皮细胞,采用形态学观察和Ⅷ因子抗体免疫荧光检测法进行鉴定;取对数生长期的细胞分组进行干预,应用形态学观察法和MTT法检测各组血管内皮细胞的活性。结果H2O2损伤模型组细胞损伤明显,经白花丹参高、中、低各剂量组的干预,受损情况均有较明显地改善,使细胞活性（OD值）增高。结论白花丹参对H2O2所致的HUVEC损伤具有保护作用。     

大鼠心肌微血管内皮细胞的体外培养

目的 探讨大鼠心肌微血管内皮细胞离体培养方法.方法 选取1～2周龄的SD大鼠,无菌条件下快速取出心脏,彻底去除大血管、心房、右心室和心内外膜.用植块法培养心肌微血管内皮细胞.倒置显微镜下形态学观察结合免疫细胞化学方法检测第Ⅷ因子相关抗原和CD34对培养细胞进行鉴定.结果 细胞呈单层贴壁生长,融合后呈"铺路石样";第Ⅷ因子相关抗原和CD34免疫细胞化学鉴定阳性.结论 成功培养出纯度较高的大鼠心肌微血管内皮细胞,方法简便,可用于心血管疾病的研究.     

西红花苷对氧化性低密度脂蛋白致内皮细胞损伤的保护作用

目的:探讨西红花苷对氧化性低密度脂蛋白(Ox-LDL)致内皮细胞损伤的保护作用.方法:在体外培养牛主动脉内皮细胞中,加入不同剂量的西红花苷培养12h后,再加入50μg·mL-1的Ox-LDL继续培养24h,测定培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活性和一氧化氮(NO)的含量,测定细胞中一氧化氮合酶(NOS)的活性;利用流式细胞仪观察其对Ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡的影响.结果:西红花苷(10,10-7,10-6mol·L-1)可剂量依赖性地抑制LDH活性及外漏(P＜0 01),提高细胞内NOS的活性(P＜0.01),使细胞分泌的NO含量升高(P＜0.01);西红花苷对Ox-LDL诱导的内皮细胞凋亡有抑制作用.结论:西红花苷对Ox-LDL致内皮细胞损伤有保护作用.     

西红花苷对低密度脂蛋白所致鹌鹑内皮细胞损伤的保护作用

目的探讨西红花苷对低密度脂蛋白(LDL)所致内皮细胞损伤的保护作用。方法在体外培养牛主动脉内皮细胞中,加入不同剂量的西红花苷培养12 h后,再加入50μg.ml-1的LDL继续培养24 h,测定培养液中NO含量,测定细胞中一氧化氮合酶(NOS)的活性。在鹌鹑饮食性动脉粥样硬化模型上,观察西红花苷连续9周预防性给药对血清LDL和血清NO的影响。结果西红花苷可浓度依赖性地提高细胞内NOS的活性(P<0.01),使细胞合成分泌的NO含量升高(P<0.01)。西红花苷能显著降低血清LDL水平,使血清NO含量提高。结论西红花苷对LDL所致内皮细胞损伤有保护作用。     

虎杖苷对模拟高原低氧环境所致小鼠脑、肺损伤的保护作用

目的探讨中药提取物虎杖苷对模拟高原低氧环境下小鼠脑、肺组织损伤的保护作用及其可能机制。方法 50只昆明小鼠随机分为平原对照组、高原低氧模型组及虎杖苷低、中、高剂量组[25、50、100 mg/(kg·d)],每组10只。给药组灌胃虎杖苷溶液,对照组及模型组灌胃等体积溶媒,连续给药7 d后,放置于复合环境模拟实验舱内,模拟海拔6 000 m高度72 h。出舱后处死动物,取肺叶及脑HE染色观察组织病理学变化;干湿重法测定肺组织湿干比值及脑含水量;化学法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量;ELISA法测定肺组织肿瘤坏死因子(TNF-α)及白细胞介素6(IL-6)含量;免疫组化法检测肺组织Toll样受体2/4(TLR2/4)蛋白表达。结果与平原对照组相比,高原低氧模型组小鼠肺组织出现明显炎性渗出、水肿,神经元细胞核固缩、浓染等病理改变,肺湿干质量比(W/D)和脑含水量明显升高(P<0.05),组织匀浆中MDA、TNF-α及IL-6含量明显升高(P<0.05),SOD活性明显降低(P<0.05);与高原低氧模型组相比,虎杖苷连续给药7 d,能改善脑、肺组织的病理性变化,明显提高小鼠肺、脑组织SOD活性,降低MDA水平,抑制肺组织炎性因子TNF-α、IL-6的升高(P<0.05或P<0.01);免疫组化结果显示,高原低氧模型组小鼠肺组织出现明显TLR2/4蛋白阳性表达,而虎杖苷中、高剂量组表达均降低(P<0.01)。结论虎杖苷可以降低脑含水量、肺W/D及MDA含量,提高SOD活性,抑制肺组织中TNF-α及IL-6水平,从而减轻小鼠在高原缺氧环境下脑、肺组织损伤,虎杖苷抑制炎症反应的作用机制可能与其调节TLR2/4的表达有关。     

脉络宁注射液对人血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用

目的:研究脉络宁注射液对人脐静脉血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用及其机制。方法:常规进行人血管内皮细胞(HUVECs)培养,将细胞随机分为正常对照组、缺氧组和脉络宁20 mg.L-1组。采用CCK-8法检测细胞存活率;Hochest33258荧光染料检测细胞凋亡率;RT-PCR法检测各组细胞中血管内皮生长因子(VEGF),血管生成素-2(Ang-2)mRNA表达水平。结果:脉络宁注射液可显著提高缺氧损伤细胞的存活率(P<0.05);与正常对照组比较,缺氧组细胞内VEGF和Ang-2 mRNA表达水平明显增高。与缺氧组比较,脉络宁组VEGF和Ang-2的表达进一步增强,各组间比较均有差异(P<0.05)。结论:脉络宁注射液可减轻血管内皮细胞缺氧损伤,上调缺氧血管内皮细胞中VEGF和Ang-2的表达,对血管内皮细胞缺氧损伤有一定的保护作用。     

银杏叶提取物对大鼠主动脉内皮细胞中血管内皮生长因子表达的影响

目的:研究溶血磷脂酰胆碱(LPC)对大鼠主动脉内皮细胞(RAEC)中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响以及银杏叶提取物(Ginkgo bilobaextract,GbE)对RAEC的保护作用.方法:MTT法和LDH的释放检测RAEC的损伤;用基础酶联免疫吸附实验(ELISA)检测VEGF蛋白含量;用RNA点杂交(Dot blot)法和原位杂交法检测细胞中 VEGF mRNA的表达.结果:LPC 5 mg/L明显抑制RAEC的生长,加入 GbE 0.01-1 μg/L后,LPC对RAEC生长抑制率明显降低。LPC可使RAEC条件培养基中VEGF蛋白表达明显增加,GbE可剂量依赖性地降低VEGF的蛋白含量.原位杂交及点杂交结果显示正常培养的RAEC未见明显的 VEGF mRNA表达,LPC刺激后可见其高表达,同时加入GbE后,VEGF mRNA的表达明显降低.结论:LPC能诱导RAEC表达高水平的VEGF,GbE可明显降低其含量.     

蜕皮甾酮对内皮细胞凋亡保护作用的研究

目的　初步探讨缺氧对培养人脐静脉内皮细胞 (HU VECs)凋亡的影响及蜕皮甾酮的干预性作用。方法　①人脐静脉内皮细胞的培养及鉴定 ;②建立人脐静脉内皮细胞缺氧模型 ,TUNEL法观测不同的缺氧时间 ( 0、12、2 4、4 8h)及蜕皮甾酮对内皮细胞凋亡的影响 ;③内皮细胞在常氧与缺氧状态下 ,实验组分别给于蜕皮甾酮 ( 10 0mg·L-1)刺激 ,2 4h后检测细胞中血管内皮生长因子 (VEGF)的表达。结果　随缺氧时间延长 ,HUVECs凋亡率显著升高 ;蜕皮甾酮能抑制缺氧导致的内皮细胞凋亡 ;蜕皮甾酮刺激内皮细胞VEGF表达上调。结论　缺氧作为一种致病因素 ,对内皮细胞凋亡的促发作用是随缺氧时间的延长而加重的。内皮细胞的过度凋亡是引起内皮功能障碍的一个重要因素 ,蜕皮甾酮通过抑制内皮细胞凋亡而具有内皮细胞保护作用 ,而此作用是由蜕皮甾酮刺激内皮细胞VEGF表达上调所介导的。     

Enhancement of glucose transporter expression of brain endothelial cells by vascular endothelial growth factor derived from glioma exposed to hypoxia

Increased need for glycolysis and glucose uptake for ATP production is observed in tumor cells, particularly in cells lacking of oxygen supply. Because glucose is transported from blood to tumor, glucose molecules must be delivered across glucose transporters of the vascular endothelium and tumor cells. Here we found that glioma suffered from hypoxic insults can secrete factor(s) to regulate glucose transporter expression in brain endothelium. It was found that conditioned medium from rat C6 glioma cells under hypoxia up-regulated glucose transporter type 1 (GLUT1) expression in rat brain endothelial cells, whereas conditioned medium from C6 cells under normoxia caused no significant effect. We further investigated whether the observed potentiating effect was caused by vascular endothelial growth factor (VEGF) production from C6 cells, because secreted VEGF was markedly increased under hypoxic condition. By transfection of C6 cells with VEGF small interfering RNA, it was found that conditioned medium from transfected cells under hypoxia no longer up-regulated GLUT1 expression of endothelial cells. Moreover, the addition of VEGF-neutralizing antibody to the hypoxic conditioned medium could also exert similar inhibitory effects. Furthermore, it was found that the VEGF-induced increase of GLUT1 expression in endothelial cells was mediated by the phosphoinositide-3 kinase/Akt pathway. Our results indicate that hypoxic brain glioma may secrete VEGF to increase glucose transport across blood-brain barrier.     

欧芹素乙对人脐静脉内皮细胞的保护作用及对血管内皮生长因子表达的影响

目的:研究欧芹素乙对内皮细胞的保护作用;溶血磷脂酰胆碱(LPC)对人脐静脉内皮细胞株HUVEC细胞中血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响以及欧芹素乙的影响.方法:应用四唑盐(MTT)法检测溶血磷脂酰胆碱对HUVEC细胞的毒性作用及欧芹素乙的保护作用;应用基础酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组条件培养基中VEGF蛋白含量;采用RT-PCR法及Reahime PCR方法检测溶血磷脂酰胆碱对VEGF mRNA的表达及欧芹素乙的影响.结果:MTT检测结果显示,溶血磷脂酰胆碱对HUVEC细胞具有较强的生长抑制作用,而欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱所致的细胞增殖抑制具有较好的保护作用.ELISA结果显示,HUVEC细胞暴露于溶血磷脂酰胆碱后,VEGF蛋白含量明显升高;加入欧芹素乙后剂量依赖性地降低VEGF蛋白的表达.RT-PCR结果显示,溶血磷脂酰胆碱可以增加3种VEGF异构体的转录水平,其中VEGF165的表达显著增加,欧芹素乙可剂量依赖性地抑制溶血磷脂酰胆碱引起的VEGF mRNA的高表达.结论:欧芹素乙对溶血磷脂酰胆碱引起的细胞损伤有明显的保护作用;欧芹素乙可抑制溶血磷脂酰胆碱所诱导的HUVEC细胞中VEGF蛋白及VEGF mRNA的高表达,对内皮细胞起到保护作用.     

川芎嗪对缺氧时视网膜血管内皮细胞HIF-1α、VEGF表达及细胞增殖的影响

目的研究川芎嗪对缺氧时体外培养的牛眼视网膜血管内皮细胞（BREC）VEGF表达及细胞增殖活性的影响,探讨川芎嗪治疗视网膜新生血管性疾病的药理机制及可行性。方法 CoCl2模拟缺氧处理培养的BREC细胞,用浓度分别为20、40、120μg/mL的川芎嗪分别加入细胞培养液中24h,采用ELISA法检测细胞培养上清液VEGF含量,免疫组织化学法和生物荧光法分别检测细胞PCNA的表达、细胞内ATP含量以分析细胞增殖能力,采用免疫组织化学法检测HIF-1α的表达。结果川芎嗪可减少缺氧引起的视网膜血管内皮细胞中PCNA的表达,降低细胞内ATP含量,降低培养上清液中的VEGF浓度,且呈剂量依赖性。结论川芎嗪可抑制缺氧引起的视网膜血管内皮细胞的增殖。其机制可能是通过抑制HIF-1α途径来实现的。     

VEGF—P（HBHO）NPs缓释微球的制备性能及生物学活性检测

目的制备血管内皮生长因子（VEGF）可降解缓释微球,考察其生物活性的保存情况以及对血管内皮细胞的作用。方法采用W1／O／W2超声乳化法制备羟基丁酸与羟基辛酸共聚物载血管内皮生长因子纳米微球,采用三步梯度筛网法培养肾微血管内皮细胞,按照培养液中所含成分不同分为3组：血管内皮生长因子组、纳米微球组、对照组,其中前两组血管内皮生长因子的有效质量浓度分别设为10、20、50μg／L。结果培养第1、3天,血管内皮生长因子组与纳米微球组吸光度值比较差异无统计学意义（P〉0．05）。但吸光度值显著高于对照组（P〈0．05）,即血管内皮生长因子对肾微血管内皮细胞具有明显促增殖作用;第5、7天纳米微球组吸光度值高于血管内皮生长因子组（P〈0．01）,即纳米微球缓慢释放血管内皮生长因子,明显提高生物利用度;第7、10天载药纳米微球组微血管内皮细胞仍有较强的增殖能力,与其他两组比较,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论VEGF—P（HBHO）NPs对生长因子具有良好缓释作用,比单纯VEGF对肾微血管内皮细胞有更为明显的生物学效应,可以持续促进其增殖。     

苦参碱对纤维蛋白纤维蛋白原降解产物诱导血管细胞损伤、增殖及腹腔巨噬细胞释放IL-1的影响

目的：研究苦参碱(Mat)对纤维蛋白纤维蛋白原降解产物(FFDP)作用的影响。 方法：大鼠主动脉内皮细胞损伤以乳酸脱氢酶释放测定;大鼠主动脉平滑肌细胞增殖采用结晶紫染色法测定;白细胞介素-1活性采用小鼠胸腺细胞增殖法测定。结果：FFDP能促进大鼠主动脉内皮细胞释放乳酸脱氢酶,诱导大鼠主动脉平滑肌细胞增殖,并促使小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1增加。结论：Mat可抑制FFDP的作用。对动脉粥样硬化的防治可能有一定意义。     

Protective effects of diltiazem against vascular endothelial cell injury induced by angiotensin‐II and hypoxia

To provide pharmacological data for future clinical studies, this study investigated the protective effects of diltiazem on vascular endothelial cell (VEC) injury induced by angiotensin‐II (AngII), hypoxia, and a combination of both treatments. The concentration of intracellular free calcium and the mitochondrial membrane potential in VEC were assessed as indicators of cell injury. An in vivo hypoxic animal model was used to test the protective effect of diltiazem on vascular endothelial tissues. Our study showed that AngII and hypoxia decreased the mitochondrial membrane potential in VEC, which was significantly inhibited by diltiazem. Diltiazem protected against VEC injury induced by the increased concentration of intracellular free calcium, which was associated with AngII and hypoxia. Diltiazem reduced the apoptosis of rat VEC under a sustained hypoxic condition. In addition, it reduced AngII and endothelin I levels in rat vascular endothelial tissues. Our study confirmed that AngII and hypoxia induced VEC injury by regulating the levels of mitochondrial membrane potential and intracellular free calcium. Diltiazem, a calcium channel blocker, protected VEC from AngII‐ and hypoxia‐induced injury.