植物源性活性因子促进骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化

背景：以往研究已证实,在心肌梗死的大鼠体内,柔毛水杨梅粗提物 EGJ 能有效促进外源性的骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞。课题组进一步分离 EGJ,最终得到植物源性的活性因子 cardiogenin,其是否也能促进间充质干细胞向心肌细胞分化呢？ 目的：分离柔毛水杨梅的活性因子 cardiogenin,并观察其促进骨髓间充质干细胞分化成心肌细胞的作用。方法：分离并纯化大鼠的骨髓间充质干细胞,分别用柔毛水杨梅醇的粗提物 EGJ 100 mg/L 和 cardiogenin 10 mg/L 来处理间充质干细胞。在处理间充质干细胞的第 3 天和第 7 天用免疫荧光的方法进行心肌分化特异性标记物免疫染色,检测被处理的间充质干细胞是否表达心肌特异性标记物。结果与结论：处理 3 d 后,EGJ 组和 cardiogenin 组有 39%的细胞表达心肌分化早期的特异性标记物 Mef2。第 7 天,EGJ组和 cardiogenin 组有 70%以上的细胞表达心肌细胞的肌球蛋白重链 MHC。结果显示 EGJ 和 cardiogenin 均能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但 cardiogenin 的用量比 EGJ 少 5~10 倍,诱导分化的效率也略高。     

钠离子通道阻断剂抑制骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景：研究发现人和动物的多种间充质干细胞均存在河豚毒素敏感性钠离子通道,但钠离子通道是否会影响间充质干细胞向心肌细胞分化尚无共识。目的：观察钠离子通道特异性阻断剂河豚毒素对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响。方法：利用Percoll’s密度梯度离心法结合差速贴壁法分离大鼠骨髓间充质干细胞,用主动脉逆行生物酶灌流法分离大鼠成体心肌细胞。将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞与成体心肌细胞混合培养,应用0,10,100pmol／L的河豚毒素进行干预,1周后观察骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化情况。结果与结论：免疫荧光细胞化学染色显示,大鼠骨髓间充质干细胞和成体心肌细胞混合培养1周后,骨髓间充质干细胞显著表达心肌特异性蛋白结蛋白和肌球蛋白,而10,100μmol／L的河豚毒素均可完全抑制结蛋白和肌球蛋白在骨髓间充质干细胞中的表达。提示钠离子通道是骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的必要条件。     

心肌梗死大鼠血清对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的影响

背景:骨髓间充质干细胞的分化与微环境密切相关,心肌梗死后,心肌细胞发生坏死,补体活化,自由基产生,分泌各种细胞因子,患者的血清成分也发生改变,这些改变究竟对骨髓间质干细胞向心肌细胞分化存存怎样的影响?目的:观察急性心肌梗死大鼠血清在体外对大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞的作用.设计、时间及地点:对比观察体外细胞学实验,于2005-09/2006-06在中山大学干细胞与组织工程中心实验室完成.材料:体质量50～80g三四周龄SD大鼠用于骨髓间质干细胞分离培养;体质量200～300 g 6～8周龄SD大鼠用于制作急性心肌梗死大鼠模型.方法:采用贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞.结扎左冠状动脉前降支制作急性心肌梗死大鼠模型,并抽取正常大鼠与模型大鼠血清备用.取第3代骨髓间充质干细胞分6组培养:未诱导组、5-氮胞苷诱导组、5-氮胞苷+心肌梗死模型大鼠血清诱导组、5-氮胞苷+正常大鼠血清诱导组、心肌梗死模型大鼠血清诱导组、正常大鼠血清诱导组.主要观察指标:大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后的形态学变化.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后心肌肌钙蛋白的表达情况.大鼠骨髓间充质干细胞经诱导后GATA-4和结蛋白mRNA表达水平.结果:大鼠骨髓间充质干细胞经5-氮胞苷联合血清诱导后.部分细胞渐伸长、变细,胞体中央形成球形,二三周后可见细胞呈球形、棒状,邻近细胞之间形成连接,镜下可见部分分化的细胞旱节律性跳动,晕心肌样细胞改变,其心肌肌钙蛋白、GATA-4、结蛋白表达阳性.对照组和单纯血清诱导组骨髓间充质干细胞未见形态改变.其心肌肌钙蛋白为阴性,GATA-4、结蛋白呈弱阳性.结论:单纯使用心肌梗死大鼠血清不能诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,但心肌梗死血清能促进5-氮胞苷诱导的骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,并促进分化的心肌细胞成熟.     

化学诱导剂5-氮杂胞苷及模拟生物微环境对骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞的影响

背景:研究显示干细胞有随环境发生分化即"环境依赖性分化"的特性,但骨髓间充质干细胞在心肌组织是否存在此种特性目前尚未形成公识.目的:观察化学诱导剂和模拟的生物微环境诱导对骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响.设计、时间及地点:随机分组设计,细胞学体外对比观察,于2008-01/2009-02在苏州大学心血管内科干细胞移植实验室完成.材料:6～8周龄SD大鼠,用于骨髓间充质干细胞的培养;新生1～3 d同种系SD大鼠,用于心肌细胞的培养.方法:取SD大鼠股骨骨髓,培养至第2代,经流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞纯度97%以上,制成4×108L-1的细胞悬液,实验分为4组:单纯DMEM培养组:用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基继续培养;5-氮杂胞苷组:24 h后培养液内加入10 μmol/L的5-氮杂胞苷;心肌细胞裂解液组:将4倍于骨髓间充质干细胞数量的心肌细胞裂解液加入骨髓间充质干细胞培养瓶中;间接接触组:在培养体系中放入millicell插入式细胞培养皿,28 d收获细胞.主要观察指标:免疫组织化学法检测诱导后骨髓间充质干细胞表达心肌特异性肌钙蛋白T、连接蛋白43、CD31的情况;RT-PCR法检测各组早期心肌细胞特异性转录因子GATA4、NKX2.5、β-肌球蛋白重链及α-肌球蛋白重链基因的表达情况.结果:免疫组织化学检测显示实验组诱导4周后特异性抗原呈阳性表达,实验组与单纯DMEM培养组相比,差异有显著性意义(P<0.05);间接接触组较心肌细胞裂解液组阳性细胞数目稍增多,但组间差异无显著性意义(P>0.05);CD31是血管内皮细胞的表面抗原标志,单纯DMEM培养组和5-氮杂胞苷组无表达,其他两组弱阳性表达,组间差异无显著性意义(P>0.05).实验组诱导4周后,均表达心肌前体细胞特异性转录因子NKX-2.5和GATA4,同时表达胚胎期占优势的心肌细胞特异性β-肌球蛋白重链,而没有表达成年期占优势的心肌细胞特异性标志α-肌球蛋白重链.结论:5-氮杂胞苷可以诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,心肌细胞裂解液和细胞间接接触模拟的心肌微环境也可以诱导骨髓间充质干细胞分化成心肌样细胞,分化的细胞介于成熟的心肌细胞和心肌祖细胞之间的心肌细胞前体.     

人脐带间充质干细胞经体内定植并向心肌样细胞分化的研究

目的探讨人脐带间充质干细胞(MSCs)移植到大鼠心肌后能否存活并向心肌样细胞分化,为心肌细胞的移植探索新的细胞来源。方法从人脐带华尔通氏胶分离、培养MSCs,检测人脐带来源的MSCs的细胞表面标记。用5-溴-2-脱氧尿苷(BrdU)标记人脐带间充质干细胞,标记细胞移植到梗塞大鼠心肌,观察移植后2周细胞能否存活,移植细胞能否向心肌样细胞分化,表达心肌细胞标记物troponinI及troponinT。结果人脐带间充质干细胞移植到心肌梗塞模型大鼠心肌后细胞能存活,并表达心肌细胞标记物troponinI及troponinT。结论人脐带间充质干细胞移植至体内能存活并分化为心肌样细胞,人脐带间充质干细胞可能作为心肌细胞移植的来源。     

丁酸钠诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化

背景:组蛋白乙酰化是诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的机制之一。目的:观察组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠对体外培养的骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响,并分析其诱导分化的机制。方法:分离、培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行鉴定。取第2代骨髓间充质干细胞,应用1mmol/L丁酸钠诱导其向心肌样细胞分化。结果与结论:实验分离培养的骨髓间充质干细胞高表达CD90,CD29;低表达CD45,CD31。加入丁酸钠后细胞增殖能力及组蛋白去乙酰化酶活性明显降低,但未发生明显凋亡现象,表明丁酸钠具有低毒性的特征。real-timePCR检测显示,经丁酸钠诱导后细胞GATA-4,MEF-2c,β-MHC等心肌细胞早期标志基因表达率明显增高(P<0.05)。Westernblot检测发现,经丁酸钠诱导后细胞心肌细胞特异性蛋白连接蛋白43和肌钙蛋白T的表达明显增高。免疫荧光测得的肌钙蛋白T表达结果与Westernblot一致。说明丁酸钠能够有效诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,其机制可能与抑制组蛋白去乙酰化酶活性,增强组蛋白的乙酰化有关。     

不同诱导条件对体外诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的影响

目的:已证实骨髓间充质干细胞体内移植能改善心脏功能,但其机制尚不清楚。观察不同诱导条件对骨髓间充质干细胞体外分化为心肌样细胞的影响。方法:实验于2005-05/2006-04在南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所完成。①实验材料:健康供体骨髓(自愿捐赠),孕16周水囊引产胎儿(胎儿家属同意捐赠)。②实验方法:取健康供体骨髓,采用淋巴细胞分离液并结合骨髓间充质干细胞贴壁特性分离细胞。取第4代骨髓间充质干细胞进行诱导实验,分为生物诱导组和化学诱导组。生物诱导组分别采用胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞直接混合培养、胚胎心肌细胞与骨髓间充质干细胞间接混合培养及胚胎心肌细胞匀浆液诱导培养,化学诱导组用5,10,15μmol/L5-aza分别处理12,24,48h进行诱导。③实验评估:采用免疫细胞荧光染色法检测胞浆中的肌节肌动蛋白。结果:①骨髓间充质干细胞只有在其与胚胎心肌细胞直接混合培养时,才能分化为心肌样细胞,而在其他生物诱导模型下却未见其分化为心肌样细胞。②化学诱导组骨髓间充质干细胞经免疫细胞荧光染色鉴定后,均未见胞浆中有肌节肌动蛋白表达,证实经5-aza诱导处理后,未见骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞。结论:①胚胎心肌细胞可诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞,机械因素是促进骨髓间充质干细胞定向分化为心肌样细胞必不可少的因素之一。②骨髓间充质干细胞经5-aza诱导是否分化为心肌样细胞未能获得证实。     

心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:骨形态发生蛋白、Wnt、Notch、FGF 及 Hedgehog 等信号通路是否参与诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化还不清楚. 目的:探讨心肌微环境中,不同刺激因素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞及其分化的机制. 方法:利用 Transwel 培养装置建立心肌微环境,骨髓间充质干细胞在此环境中培养并加入 Wnt11、骨形态发生蛋白抑制剂诱导其向心肌细胞分化;应用 RT-PCR、Western blot 方法检测骨形态发生蛋白、Wnt、Notch、FGF 和 Hedgehog 信号通路关键信号分子的表达.同时检测心肌特异性转录因子(Nkx2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌细胞特异性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)的表达. 结果与结论:骨髓间充质干细胞经过与大鼠心肌细胞共培养诱导后,Wnt、骨形态发生蛋白、Notch、Hedgehog 信号通路关键信号分子的表达较未诱导的阴性对照组明显升高(P <0.01).在骨髓间充质干细胞与大鼠心肌细胞共培养体系中加入骨形态发生蛋白信号通路的抑制剂Noggin,心肌特异性转录因子或结构蛋白的表达明显降低(P <0.01).提示心肌细胞构成的微环境可以诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞;Wnt、骨形态发生蛋白、Notch、FGF、Hedgehog 信号通路共同参与了诱导分化过程.     

心肌微环境诱导骨髓间充质干细胞向心肌样细胞的分化(英文)

背景:骨形态发生蛋白、Wnt、Notch、FGF及Hedgehog等信号通路是否参与诱导骨髓间充质干细胞向心肌细胞的分化还不清楚。目的:探讨心肌微环境中,不同刺激因素诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞及其分化的机制。方法:利用Transwell培养装置建立心肌微环境,骨髓间充质干细胞在此环境中培养并加入Wnt11、骨形态发生蛋白抑制剂诱导其向心肌细胞分化;应用RT-PCR、Western blot方法检测骨形态发生蛋白、Wnt、Notch、FGF和Hedgehog信号通路关键信号分子的表达。同时检测心肌特异性转录因子(Nkx2.5、GATA4、Mef2c)和成熟心肌细胞特异性基因(cTnI、ANP、α-MHC、β-MHC)的表达。结果与结论:骨髓间充质干细胞经过与大鼠心肌细胞共培养诱导后,Wnt、骨形态发生蛋白、Notch、Hedgehog信号通路关键信号分子的表达较未诱导的阴性对照组明显升高(P<0.01)。在骨髓间充质干细胞与大鼠心肌细胞共培养体系中加入骨形态发生蛋白信号通路的抑制剂Noggin,心肌特异性转录因子或结构蛋白的表达明显降低(P<0.01)。提示心肌细胞构成的微环境可以诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞;Wnt、骨形态发生蛋白、Notch、FGF、Hedgehog信号通路共同参与了诱导分化过程。     

利用c-kit^＋骨髓间充质干细胞与心脏脱细胞骨架共培育心肌组织

背景：研究发现c-kit阳性骨髓间充质干细胞可特异分化为心肌细胞,可能成为理想的种子细胞。 目的：验证利用c-kit^＋骨髓间充质干细胞及心脏脱细胞骨架培育心肌组织的可行性。 方法：取成年大鼠心脏脱细胞后备用。取大鼠骨髓间充质干细胞,培养至第8代后行c-kit富集,采用5μmol/L的5氮杂胞苷诱导2周后行二氢吡啶受体α2富集,然后继续培养行心肌分化鉴定或种植于心脏脱细胞骨架内行心肌组织培养。6周后,利用心肌细胞特异性蛋白表达及动作电位鉴定心肌细胞分化,利用免疫荧光染色分析新生心肌组织结构。 结果与结论：第2次富集6周后,约60%的骨髓间充质干细胞表达心肌肌钙蛋白T、GATA结合蛋白4、连接蛋白43,电生理分析显示这些细胞可产生心肌细胞样动作电位,证实 c-kit^＋骨髓间充质干细胞可特异分化为心肌细胞,种植于脱细胞心脏骨架后可形成排列有序的心肌组织。     

诱导间充质干细胞向心肌样细胞的分化

背景:目前很多体内外实验都已表明间充质干细胞具有向心肌样细胞或心肌细胞分化的能力,这使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能。目的:比较诱导间充质干细胞向心肌样细胞分化实验方法的异同及存在的问题。方法:以"mesenchymal stem cells,cardiomyocyte,differentiation;间充质干细胞,心肌细胞,诱导;分化"为检索词,应用计算机检索2000-12/2010-12 PubMed数据库与万方数据库,与间充质干细胞诱导分化为心肌细胞相关的文章。结果与结论:间充质干细胞向心肌细胞分化的方法主要有:①心肌细胞条件培养液:间充质干细胞在体外经药物诱导或模拟体内心肌微环境能定向诱导分化为心肌样细胞。②与希望诱导成的目的细胞共同培养:间充质干细胞可经药物诱导诱导分化为心肌细胞,也可不经任何诱导在心肌微环境中分化为心肌细胞。虽然间充质干细胞在体外心脏病理条件下可分化为心肌细胞,使间充质干细胞治疗心脏疾病成为可能,但其研究有待进一步完善。     

体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞定向分化的研究

目的 探讨心肌细胞对骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌细胞定向诱导分化的作用及其生物学特性.方法 取大鼠四肢骨髓,用细胞分离液通过密度梯度离心分离MSCs,并将MSCs进行原代培养和传代培养,将传2代MSCs用5-溴脱氧尿核苷(BrdU)进行标记.采用胰蛋白酶消化法取乳鼠心尖部心肌细胞进行培养,并与标记的MSCs混合培养,光镜下观察其动态变化,并于第3日行免疫组化染色,第5日行电镜观察.结果 原代和传代的MSCs增殖迅速,其阳性率达(90.34±2.31)%,与平行对照组[(4.07±1.35)%]比较差异有统计学意义(P<0.01).与心肌细胞混合后,光镜下观察MSCs形态出现明显的变化,第3日BrdU标记阳性的MSCs胞质中肌动蛋白(actin)表达阳性.电镜下观察原始细胞内出现了不规则的肌小节样结构.结论 心肌细胞与MSCs的接触可有效诱导MSCs向心肌细胞定向分化.     

细胞间接触诱导大鼠骨髓间质干细胞向平滑肌细胞的分化

背景:干细胞能够分化为血管平滑肌细胞,参与动脉粥样硬化发生、发展,其机制尚不清楚。“环境诱导分化学说”认为细胞-细胞接触、细胞因子可能在干细胞分化过程中起关键作用。骨髓间质干细胞具有向平滑肌细胞分化的潜能。目的:体外诱导骨髓间质干细胞分化为平滑肌细胞,观察已分化成熟平滑肌细胞及细胞因子对骨髓间质干细胞分化的影响。设计:以细胞为观察对象的重复观察测量,对照性体外实验。单位:西安交通大学第一医院心内实验室。材料:实验于2003-05/2004-05在西安交通大学第一医院心内实验室完成。SD大鼠60～80g、90～110g,雌雄不限,由本校动物中心提供。PE标记小鼠抗大鼠CD34(Santa Cruz),PE标记小鼠抗大鼠CD71(Oxford Biotechnology),FITC标记小鼠抗大鼠CD90(Oxford Biotechnology),小鼠抗人单克隆抗体SM-α-actin(NeoMarkers),小鼠抗人单克隆抗体Calponin(NeoMarkers),TRITC标记山羊抗小鼠IgG(SBA),pEGFP-N3(本实验室提供),Lipofectamine2000(Invitrogen)。方法:采用密度梯度离心和细胞贴壁法与组织贴块法分离培养骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。通过流式细胞仪检测,平滑肌细胞抗体免疫荧光染色,鉴定骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞。将骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白,以未转染的骨髓间质干细胞为对照。骨髓间质干细胞与血管平滑肌细胞分条件培养:①取3代骨髓间质干细胞传至12孔培养板,培养液为低糖DMEM加骨髓间质干细胞条件培养液各半,胎牛血清浓度为0%、5%、7.5%。细胞固定后,应用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。②将半透膜小室置于6孔培养板每一孔内,使每孔隔成内外两室。将骨髓间质干细胞在外室培养,平滑肌细胞在内室培养。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照,胎牛血清浓度为3%、7.5%。用平滑肌细胞抗体免疫荧光染色检测结果。③骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养:于骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白后24h,向每孔内加入等量的平滑肌细胞混合培养,观察细胞形态变化。以单独培养的骨髓间质干细胞为对照。主要观察指标:①骨髓间充质干细胞流式细胞仪检测结果。②不同条件培养下平滑肌细胞抗体免疫荧光染色结果。结果:①免疫荧光染色示,平滑肌细胞抗SM-α-actin阳性,抗calponin阳性。骨髓间质干细胞抗SM-α-actin阳性,而抗calponin阴性。②流式细胞仪检测,骨髓间质干细胞不表达CD34,弱表达CD71,高表达CD90。③骨髓间质干细胞转染绿色荧光蛋白持续表达约2周～3周。④加入平滑肌细胞培养液或不同浓度的胎牛血清,骨髓间充质干细胞生长良好。骨髓间充质干细胞与平滑肌细胞分层培养中,骨髓间充质干细胞生长对胎牛血清呈浓度依赖性。骨髓间质干细胞与平滑肌细胞混合培养7d后免疫荧光染色,可见绿色荧光蛋白和抗SM-α-actin、Calponin的双标细胞存在。而加平滑肌细胞条件培养液与分层培养组中骨髓间质干细胞均不表达Calponin。结论:①平滑肌细胞培养液及细胞因子只能促进骨髓间充质干细胞生长,细胞胞浆颗粒增多,并不能诱导骨髓间充质干细胞分化为平滑肌细胞。②细胞间直接接触对诱导骨髓间质干细胞定向分化为平滑肌细胞起决定作用。     

胚胎干细胞向心肌细胞的分化

目的:了解国内外在胚胎干细胞向心肌细胞分化的机理及其应用潜能等方面的研究现状。资料来源:应用计算机检索Medline,检索时间为1997/2005,检索词限定为“embryonicstemcell,cardiomyocyte/cardiacmyocyte,differentia-tion”,并限定语言种类为英文。资料选择:对所检索到的文献进行初审,纳入标准:符合胚胎干细胞向心肌细胞分化的文章。排除标准:重复性研究。资料提炼:共查找文献200余篇,筛选出26篇。资料综合:收集到多篇关于胚胎干细胞分化为心肌细胞的文章,从最初获得胚胎干细胞源性心肌细胞的实验方法的建立到在单细胞水平对胚胎干细胞源性心肌细胞进行电生理研究。进一步,很多研究者从转录因子的角度研究了控制心脏发育的转录因子在胚胎干细胞向心肌细胞分化过程中的表达,研究表明心脏转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2.5控制着心脏基因的表达,它们在心脏发生过程中发挥重要的转录调控作用。研究同时发现,钙调神经磷酸酶信号通路、MAPK信号通路以及其他信号通路参与了心肌细胞分化的调节。此外,从胚胎干细胞纯化分化的心肌细胞用于治疗心肌梗死亦是一个关键问题。结论:当胚胎干细胞以胚小体的形式在没有白血病抑制因子的条件下培养时,一些干细胞可以分化成心肌细胞。干细胞来源的心肌细胞表达一些收缩蛋白,如MHC和肌球蛋白轻链-2V。转录因子GATA4、肌细胞增强因子2C和NKx2.5在心肌细胞分化中发挥重要作用,并且可以触发特异基因如α-肌动蛋白、MHC和肌球蛋白轻链-2V的表达,然而,胚胎细胞向心肌细胞分化的分子机制还有待进一步研究,鉴别出促进心脏分化的因子是研究心脏分化的基础所在。     

犬脐血干细胞肌源性诱导分化移植对细胞间连接的影响

背景:脐血间充质干细胞诱导分化为心肌细胞后移植入心肌缺血组织,可以通过与宿主细胞建立联系来修复取代缺血心肌组织.目的:对犬脐血干细胞进行肌源性诱导,观察其植入后与宿主细胞间的连接情况.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-07/2007-10在上海交通大学医学院附属新华医院动物实验中心完成.材料:接近足月的妊娠杂种犬2只,用于分离培养脐血间充质干细胞.成年杂种犬36只,随机数字表法分为细胞移植组、模型对照组,18只/组.方法:取传至第4代的犬脐血间充质干细胞,加入含lacZ基因的重组腺相关病毒载体进行基因转染,继续培养3 d后,行10 μmol/L5-氮杂胞苷肌源性诱导,常规培养3周.两组犬均建立心肌梗死模型,造模后细胞移植组经冠状动脉和局部注射将2 mL细胞悬液(约107个脐血间充质干细胞)移植到梗死区,模型对照组同法注射等量生理盐水.分别于移植后2,4,8周取材制备心肌组织切片,免疫组化检测细胞间连接情况.主要观察指标:脐血间充质干细胞的基因转染、肌源性诱导分化情况,移植细胞与宿主心肌细胞的细胞间连接情况.结果:转染72 h后大部分细胞表达LacZ基因,并合成半乳糖苷酶,X-gal染色呈蓝色.5-aza诱导3周后,脐血干细胞α-Actin(+),Desmin(+),Connexin43(+),而诱导前均呈阴性.移植后第8周,心肌切片中移植细胞和宿主心肌相连处可形成连接,连接处可见cadherin和connexin43绿色荧光阳性表达;模型对照组仅表达cadherin和connexin43,未见带红色荧光的移植细胞.结论:脐血间充质干细胞可在体外诱导为心肌样细胞,移植后能与宿主心肌可能形成有效连接,从而具有通讯联系.     

碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2诱导分化兔骨髓间充质干细胞

背景:骨髓间充质干细胞依赖特定的生长和分化因子能分化为骨、软骨、脂肪等不同组织。人重组骨形态发生蛋白2有明显的骨诱导作用,能诱导未分化的骨髓间充质干细胞不可逆地形成骨与软骨,并最终导致新骨生成;碱性成纤维生长因子亦参与调控骨髓间充质干细胞的软骨与骨的分化。目的:观察碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响,以便寻求合适的骨形成诱导方法以代替常规的成骨培养体系。设计:随机对照实验。单位:解放军第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所。材料:培养的兔骨髓间充质干细胞。方法:实验于2004-06/12在第四军医大学唐都医院骨肿瘤研究所暨全军骨科中心完成。①体外培养的兔骨髓间充质干细胞分别经3种不同的生长因子(100μg/L人重组骨形态发生蛋白2,100μg/L碱性成纤维生长因子,100μg/L人重组骨形态发生蛋白2加100μg/L碱性成纤维生长因子)和成骨培养体系处理。②其增殖和分化通过四甲基偶氮唑盐比色法,碱性磷酸酶、骨钙素检测和钙结节VonKossa染色观察。主要观察指标:通过检测增殖率和碱性磷酸酶活性比较不同生长因子对兔骨髓间充质干细胞增殖和分化的影响。结果:①人重组骨形态发生蛋白2能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化,特别是其分化。②碱性成纤维生长因子能刺激兔骨髓间充质干细胞的增殖,与对照组相比,细胞增值率提高近100%;虽然对兔骨髓间充质干细胞分化无明显影响,但其能促进人重组骨形态发生蛋白2对兔骨髓间充质干细胞分化。结论:碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2是兔骨髓间充质干细胞有效的分化因子,两者在体外都能促进兔骨髓间充质干细胞的增殖和分化。碱性成纤维生长因子和人重组骨形态发生蛋白2能协同作用加速骨诱导及骨形成,可以用作分化骨组织工程中的种子细胞。     

Carvedilol Enhances Mesenchymal Stem Cell Therapy for Myocardial Infarction via Inhibition of Caspase-3 Expression

Adult stem cells have shown great promise toward repairing infarcted heart and restoring cardiac function. Mesenchymal stem cells (MSCs), because of their inherent multipotent nature and their ability to secrete a multitude of growth factors and cytokines, have been used for cardiac repair with encouraging results. Preclinical studies showed that MSCs injected into infarcted hearts improve cardiac function and attenuate fibrosis. Although stem cell transplantation is a promising therapeutic option to repair the infarcted heart, it is faced with a number of challenges, including the survival of the transplanted cells in the ischemic region, due to excessive oxidative stress present in the ischemic region. The objective of this study was to determine the effect of Carvedilol (Carv), a nonselective β-blocker with antioxidant properties, on the survival and engraftment of MSCs in the infarcted heart. MSCs were subjected to a simulated host-tissue environment, similar to the one present in the infarcted myocardium, by culturing them in the presence of hydrogen peroxide (H(2)O(2)) to induce oxidative stress. MSCs were treated with 2.5 μM Carv for 1 h in serum-free medium, followed by treatment with H(2)O(2) for 2 h. The treated cells exhibited significant protection against H(2)O(2)-induced cell death versus untreated controls as determined by 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5-diphenyltetrazolium bromide and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling assays. Likewise, transplantation of MSCs after permanent left coronary artery ligation and treatment of animals after myocardial infarction (MI) with Carv (5 mg/kg b.wt.) led to significant improvement in cardiac function, decreased fibrosis, and caspase-3 expression compared with the MI or MSC-alone groups.     

兔外周血间充质干细胞的体外分离培养及诱导成骨

背景:研究证明外周血中存在间充质干细胞,但含量极少.目的:拟从兔外周血中提取间充质干细胞,并诱导其向成骨细胞分化.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2008-06/12在山东省立医院中心实验室完成.材料:新两兰大白兔6只,购自山东省农科院.α-MEM培养基、L-DMEM培养基为Hyclone公司产品.方法:每隔2 d从兔背部不同部位切去3 cm×3 cm的全层皮肤(保留背部肌层),所切皮肤做原何移植后包扎,每只兔连续创伤4次.分别于创伤前及末次创伤1周后从股静脉取外周血,采用密度梯度离心法获取间充质干细胞,设立2组,分别加入含体积分数为10%胎生血清的α-MEM培养基或L-DMEM培养基.细胞传至第2代以1×105cm2密度接种于12孔板,加入含成骨诱导剂的H-DMEM培养液进行成骨诱导.主要观察指标:创伤前后细胞形态观察,成纤维样细胞集落形成率,成骨诱导效果.结果:创伤前所获得的细胞首次换液后,未见有梭形细胞贴壁;创伤后所获得的细胞接种24 h即可见有短梭形及多角形细胞贴壁,五六天后出现细胞集落.与L-DMEM培养基组比较,α-MEM培养基组外周血成纤维样细胞集落形成率明显升高(P<0.05).外周血间充质干细胞成骨诱导后,呈梭形、三角形或多角形,有突起,可见两三个核仁和细胞分裂相,增殖速度缓慢,诱导7 d后碱性磷酸酶阳性率达80%以上,诱导21 d后茜素红染色形成钙结节.结论:皮肤损伤刺激后可成功从兔外周血中获取间充质干细胞,且具备成骨分化特性,α-MEM培养基较L-DMEM培养基更适合外周血间充质干细胞的体外生长.     

骨形成蛋白4诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力

目的骨形成蛋白 4( bone morphogenetic protein 4,BMP4)体外诱导成年大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经元的能力. 方法采用 BMP4体外定向诱导第五代骨髓间充质干细胞,免疫组化鉴定神经丝蛋白( NF)、胶质纤维酸性蛋白( GFAP)的表达. 结果成年大鼠骨髓间充质干细胞受 BMP4诱导后出现神经元样细胞 ,细胞免疫组化显示诱导出的神经元样细胞 NF表达阳性,诱导后 5 h, 12 h, 1 d, 3 d, 5 d和 7 d的 NF神经样细胞阳性率分别为 (40± 7)%, (71± 6)%, (58± 3)%, (53± 6)% , (37± 5)%, (13± 2)% ,诱导后 12 h,NF神经元样细胞阳性表达到高峰 ,与诱导后 5 h比较,差别有显著性 (t=1.380～ 2.621,P< 0.05). 结论 BMP4可以在体外诱导成年大鼠骨髓间充质分化为神经元.