端粒酶催化亚基启动子调控osm基因表达对瘤细胞抑制作用的研究

为了探讨端粒酶催化亚基(hTERT)启动子调控抑瘤素(oncostatin M,osm)基因在端粒酶表达阳性的瘤细胞中的特异性及对瘤细胞和正常细胞增殖的影响,构建了phTERTosm表达载体,分别转染瘤细胞和正常细胞,用MTT法检测osm基因表达对瘤细胞和正常细胞增殖的影响。结果表明,hTERT启动子调控osm基因对端粒酶表达阳性瘤细胞HepG2、HeLa、Glc和A549的增殖有明显的抑制作用,抑制率为12.4%～46%;而对端粒酶阴性的正常人胚肺成纤维细胞没有明显的影响,提示hTERT启动子能明显限制osm的毒性作用仅在端粒酶阳性表达的瘤细胞中,而对端粒酶表达阴性细胞则无抑制作用。     

人端粒酶催化亚基基因启动子克隆及转录活性的评价

为检测人端粒酶催化亚基(hTERT)基因启动子，克隆构建hTERT启动子(319bp)调控的荧光素酶报告载体，用脂质体转染法将其转染肿瘤细胞和正常细胞。结果表明，hTERT启动子在所检测的4种端粒酶阳性的肿瘤细胞中具有明显的转录活性，平均为阳性对照的44．3％；而在端粒酶阴性的正常成纤维细胞株中则无明显的转录活性。结论：hTERT启动子的转录活性在端粒酶阳性的肿瘤细胞中明显上调，由hTERT启动子构建的载体可能是一种新颖和有前景的靶向性基因治疗载体。     

抑制IGF2基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用

目的:研究抑制人胰岛素样生长因子2(IGF2)基因的siRNA表达载体对肝癌Huh-7细胞增殖的抑制作用。方法:将重组人甲胎蛋白(hAFP)和人端粒酶逆转录酶(hTERT)双启动子调控抑制IGF2基因的siRNA表达载体pGL3-h AFP-hTERT-siRNA3(简称siRNA3)转染Huh-7细胞和正常肝L-02细胞,另设阴性对照(载体p GL3-hAFP-hTERT)组和空白对照组。采用实时荧光定量聚合酶链反应法检测各组细胞转染48 h后IGF2 mRNA表达;酶标仪检测转染0、24、48、72 h后的细胞活性;流式细胞仪检测转染48h后细胞周期、细胞凋亡;Western blot法检测细胞IGF2、增殖细胞核抗原(PCNA)、细胞周期蛋白(Cyclin)E2、Cyclin D2、Cdc2、Bcl-2蛋白表达水平。结果:与阴性对照组和空白对照组比较,转染siRNA3的Huh-7细胞中IGF2 mRNA表达明显减弱,转染48、72 h后Huh-7细胞活性明显降低,G1期Huh-7细胞明显增加,S期Huh-7细胞明显减少;Huh-7细胞早期、晚期及总凋亡百分比均明显增加,IGF2、PCNA、Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2和Bcl-2蛋白表达均明显减弱,以上差异具有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。转染siRNA3表达载体的L-02细胞上述指标均无明显变化(P>0.05)。结论:重组hAFP和hTERT双启动子调控针对IGF2基因的siRNA可特异性抑制Huh-7细胞IGF2表达及细胞增殖,其可能与下调IGF2 mRNA及蛋白表达,进而引起细胞增殖相关基因PCNA、细胞周期调控相关基因Cyclin E2、Cyclin D2、Cdc2及细胞凋亡调控相关基因Bcl-2蛋白表达下调有关。     

靶向survivin的siRNA对肝癌HepG2细胞增殖和转移能力的影响

目的探讨针对人survivin基因的siRNA对肝癌细胞HepG2的体内外抑制作用。方法合成survivin基因的RNA干涉（RNA interferance,RNAi）特异性片段,构建survivin特异性的RNA干涉载体pSiS,转染HepG2细胞,G418筛选稳定转染的细胞系。细胞计数检测细胞生长情况;Western blotting检测细胞中survivin蛋白表达的变化;通过AnnexinV法染色和流式细胞术检测细胞凋亡;观察裸鼠皮下HepG2移植瘤的形成。结果成功构建了survivin基因siRNA真核表达载体pSiS,获得了稳定转染的细胞HepG2／pSiS。与HepG2、HepG2／pSi（空质粒对照细胞）相比,HepG2／pSiS细胞生长曲线十分平缓,差异有统计学意义（P〈0．01）;Westernblotting显示,HepG2／pSiS细胞中survivin蛋白表达减少,细胞凋亡率增加（P〈0．01）。HepG2／pSiS移植瘤形成明显受到抑制。结论Survivin特异性siRNA可明显促进肝癌细胞HepG2的凋亡,抑制该肿瘤细胞体外生长和体内移植成瘤。     

端粒酶反义hTR和反义hTERT合用对宫颈癌HeLa细胞凋亡的影响

目的探讨端粒酶反义hTR和反义hTERT联合作用于宫颈癌HeLa细胞,对HeLa细胞凋亡的影响。方法实验分空白对照组、脂质体对照组、正义hTR组、正义hTERT组、反义hTR组、反义hTERT组及反义hTR+反义hTERT组。分别采用四甲基偶氮唑蓝法(MTT)、逆转录聚合酶链反应技术-端粒重复序列扩增(TRAP)酶联免疫法(ELISA)、吖啶橙染色法、流式细胞术检测宫颈癌HeLa细胞转染反义hTR和反义hTERT后细胞的端粒酶活性、形态学、凋亡和周期的改变。结果宫颈癌HeLa细胞转染端粒酶反义核酸后,出现明显的细胞凋亡形态学改变,端粒酶活性抑制率、凋亡率增高及细胞周期阻滞,与空白对照组、脂质体对照组及正义核酸组比较,统计学上差异有显著性(P<0.01)。HeLa细胞转染0.2μmol·L-1反义hTR+反义hTERT72h后,端粒酶活性抑制率、细胞凋亡率分别为80.5%、28.6%,与反义hTR组和反义hTERT组比较(端粒酶活性抑制率、细胞凋亡率分别为hTR:62.7%、13.2%;hTERT:66.5%、13.7%),差异有显著性(P<0.01,q值分别为0.919、1.075)。反义hTR+反义hTERT组比反义hTR组和反义hTERT组细胞凋亡的形态学改变更明显,反义hTR+反义hTERT组G0/G1期细胞比例增加(G1期细胞比例为57.8%,空白对照组G1期细胞比例为50.7%)。结论端粒酶反义核酸能通过抑制端粒酶活性诱导细胞凋亡,端粒酶反义hTERT和反义hTR有协同效应。     

hTERT-TK/GCV联合hTERT-CD/5-FC靶向抗肝癌及旁观者效应机制的研究

目的观察人端粒酶反转录酶-胸苷激酶/丙氧鸟苷(hTERT-TK/GCV)联合hTERT-胞嘧啶脱氨酶/5-氟胞嘧啶(CD/5-FC)对肝癌细胞株HepG2生长及凋亡的靶向杀伤效应。方法细胞培养,构建pGL3-hTERT-CD质粒,hTERT-TK/GCV联合hTERT-CD/5-FC同时转染HepG2细胞和正常肝细胞L-02,用噻唑蓝(MTT)法观察药物浓度对肝癌细胞存活率的影响,用DNA缺口末端标记法(TUNEL)观察自杀基因对肝癌细胞生长和凋亡的影响,以及对旁观者效应的观察。结果MTT法显示hTERT启动子驱动下两自杀基因体系可以协同表达于肝癌细胞,当GCV为20μg/ml,5-FC为200μg/ml时,对HepG2细胞的杀伤作用达到最大。TUNEL法显示在肝癌细胞中,自杀基因一被启动子高效表达,产生凋亡小体和明显的细胞凋亡率,转染正常肝细胞无此现象。结论hTERT-TK/GCV联合hTERT-CD/5-FC基因体系能够靶向杀伤肝癌细胞,存在明显的旁观者效应,弥补了基因治疗转染效率不高的问题,便于指导今后的实验和研究。     

hTERT siRNA对HepG2细胞hTERT表达及端粒酶活性的影响

目的研究siRNA技术对肝癌HepG2细胞系hTERT mRNA表达及端粒酶的抑制作用,探讨siRNA抑制肿瘤细胞的作用及机理。方法体外转录合成hTERT siRNA并转染入HepG2细胞株中,应用RT-PCR观察HepG2细胞中hTERT mRNA表达改变,Western blot检测hTERT蛋白的表达,应用末端重复片断扩增-酶联免疫吸附(TRAP-ELISA)方法测定转染24h、48h后细胞端粒酶活性。结果hTERT siRNA转染后,对HepG2细胞hTERT mRNA和蛋白表达明显抑制。转染后24h端粒酶活性转染组均数为(0.167±0.019),与未转染组均数(0.823±0.027)、空质粒阴性对照组均数(0.826±0.031)比较,差异有统计学意义(P<0.05);48h端粒酶活性转染组均数为(0.153±0.017),与未转染组均数(0.816±0.022)、空质粒阴性对照组均数(0.809±0.028)比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论靶向hTERT的siRNA,能有效抑制肝癌细胞系HepG2 hTERT-mRNA和蛋白表达及端粒酶活性。     

厚朴酚通过改变Bax/Bcl-X_L表达和激活caspase诱导人宫颈癌HeLa细胞凋亡

目的研究厚朴酚诱导HeLa细胞凋亡机制。方法MTT法测定厚朴酚对HeLa和人正常胚肺HEL299细胞的细胞毒作用。通过显微镜,荧光染色观察细胞形态学变化,用琼脂糖凝胶电泳检测DNA片断化。用Western印迹法分析药物对蛋白质表达的影响。结果厚朴酚明显抑制HeLa细胞的增殖,诱导HeLa细胞调亡。对HEL299细胞的细胞毒作用弱于HeLa细胞。Caspase3,8,9,10及家族抑制剂可明显抑制厚朴酚诱导的凋亡。激动型Fas抗体CH11对厚朴酚诱导的HeLa细胞死亡有协同作用。Western印迹结果显示厚朴酚作用12h后Bax/BclXL表达比率升高,caspase3前体及其底物ICAD和PARP发生降解,磷酸化p53和p53蛋白表达增加。结论厚朴酚(80μmol·L-1)通过改变Bax/BclXL的表达激活caspase途径诱导HeLa细胞凋亡。     

双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒对卵巢癌靶向治疗的研究

目的 构建表达携带切除修复交叉互补基因1(ERCC1)siRNA的人端粒酶反转录酶启动子(hTERT)及缺氧诱导因子(HIF)的双调控肿瘤特异性溶瘤腺病毒(RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1,以下简称双调控腺病毒),作用于卵巢癌细胞后研究其抑瘤作用及相关分子机制,为卵巢癌的基因治疗奠定基础.方法 2018年1—12月,以人端粒酶逆转录酶启动子(hTERT)调控腺病毒Ela基因,缺氧调控元件序列(HRE)调控E1b基因,重组hTERT/HIF双调控双功效的肿瘤特异性溶瘤腺病毒载体;于E1区插入ERCC1基因序列设计特异基因构建双调控腺病毒.将构建好的病毒增加荧光载体,荧光显微镜下观察SKOV3人卵巢癌细胞中病毒转染情况.以噻唑蓝(MTT)实验检测不同组别癌细胞增殖活性,流式细胞术检测不同组别癌细胞凋亡情况.蛋白质印迹法检测SKOV3细胞中ERCC1蛋白、JAK/STAT、PI3K/Akt通路蛋白表达情况.结果 成功构建了双调控腺病毒,病毒能够在卵巢癌中高效转染并快速增殖,屏蔽ERCC1耐药基因,并具明显的抑瘤作用.MTT结果显示,24 h后双调控腺病毒对SKOV3细胞株具有明显增殖抑制,随着病毒数目增加抑制率逐渐上升,感染强度(MOI)=30时,卵巢癌SKOV3细胞增殖率下降到50％以下,且AD-ERCC1-siRNA组与AD-NC-siRNA组肿瘤抑制差异无统计学意义(P>0.05),AD-ERCC1-siRNA联合顺铂(74.19±3.04)％抑瘤作用较AD-NC-siRNA+DDP组(56.85±2.51)％更强.流式细胞术结果显示:AD-ERCC1-siRNA组细胞凋亡率(5.5±0.75)％较对照组(0.5±0.24)％明显升高.我们对病毒作用后的SKOV3细胞运用WB方法进行检测,结果显示作用后的细胞ERCC1蛋白表达(0.567±0.016)较对照组(1.612±0.072)下降(P<0.01),JAK2[(0.860±0.010)比(0.694±0.011)]、STAT3[(0.826±0.032)比(0.651±0.037)]显著高于对照组,(P<0.01),而PI3K[(0.292±0.013)比(0.291±0.015)]、AKT[(0.810±0.018)比(0.813±0.024)]较对照组差异无统计学意义(P>0.05).结果提示,当病毒接触卵巢癌细胞24 h后发挥出对卵巢癌细胞较明显的抑瘤作用,且AD-ERCC1-siRNA组与AD-NC-siRNA组无明显差异,在感染强度(MOI)=30时,卵巢癌SKOV3细胞增殖抑制率下降到50％以下.结论 双调控腺病毒成功构建且具备高转染效率,该病毒对卵巢癌SKOV3细胞株有明显生长抑制及促凋亡作用,可能与JAK/STAT通路激活有关,而且该病毒能增强顺铂的用药效果,其机制可能与该病毒成功屏蔽ER-CC1耐药基因有关.     

双启动子shRNA 表达载体对hTERT和bcl-2基因表达的抑制作用

目的: 将已构建好的双启动子shRNA表达载体pdPRO-TB、单启动子对照pdPRO-T、pdPRO-B和阴性对照质粒pdPRO转染hela细胞,研究双启动子shRNA表达载体可否同时抑制双基因的表达,并且通过建立这种模式化工具载体,为今后的实验研究开拓新的思路。方法: 分别从构建好的大杆菌DH5α菌体中提取含有双启动子shRNA表达载体pdPRO-TB、单启动子对照pdPRO-T、pdPRO-B和阴性对照质粒pdPRO,通过脂质体介导瞬时转染hela细胞,镜下观察细胞形态。实时荧光定量RCR检测hTERT和bcl-2基因的表达水平。结果: 转染pdPRO-T和pdPRO-B的hela细胞生长受到抑制,转染pdPRO-TB的hela细胞生长抑制更为明显。转染pdPRO-T的hela细胞hTERT基因表达明显抑制,bcl-2基因无明显抑制;转染pdPRO-B的hela细胞bcl-2基因表达明显抑制, hTERT基因无明显抑制;而转染pdPRO-TB的hela细胞hTERT基因和bcl-2基因均受到明显抑制。。结论: 双启动子shRNA表达载体构建成功,可以同时抑制双基因的表达。该方法可作为新的研究手段运用于基因治疗等领域,构建双启动子shRNA表达载体,使其在细胞中表达两个不同的siRNA,同时诱导两个基因的表达沉默,达到双基因治疗的目的。     

槲寄生碱影响Ras蛋白表达抑制肺癌H358细胞增殖

目的研究槲寄生碱对非小细胞肺癌H358细胞的抑制作用及其相关作用机制。方法采用MTT法检测槲寄生碱对H358细胞增殖的抑制作用;采用流式细胞仪检测槲寄生碱对H358细胞凋亡的影响;采用Western blot方法检测槲寄生碱对K-Ras、Bcl-2和Bax等蛋白表达的影响;测定caspase 3、caspase 8和caspase 9的活性;检测槲寄生碱在体内的抑瘤活性。结果槲寄生碱以质量浓度依赖的方式抑制H358细胞增殖,并能有效地诱导H358细胞凋亡;caspase 3、caspase 8和caspase 9受到了不同程度的激活;同时,槲寄生碱抑制K-Ras和Bcl-2的表达,而对Bax没有明显抑制作用;槲寄生碱在体内也表现出明显的抑瘤活性。结论槲寄生碱在体外能够抑制H358细胞增殖并诱导H358细胞凋亡,为K-Ras突变型非小细胞肺癌等肿瘤疾病的治疗奠定了实验基础。     

MAP30-PEG结合物对A549体外细胞增殖作用的研究

目的探讨苦瓜籽核糖体失活蛋白MAP30及其聚乙二醇修饰物对人肺腺癌细胞A549增殖、细胞凋亡的影响和caspase3相关凋亡途径的诱导作用。方法用MTT法测定MAP30和MAP30-PEG结合物对人肺腺癌细胞A549的抑制率;通过Hoechst33258荧光染色观察A549细胞凋亡形态,并用流式细胞术测定细胞凋亡率以及用western blot检测凋亡细胞caspase3表达。结果 MAP30和MAP30-PEG结合物均对A549有抑制作用,且呈时间和剂量依赖性关系;MAP30-PEG结合物对A549细胞增值抑制率约为MAP30的60%;Hoechst33258荧光染色后均呈典型凋亡形态;流式细胞术检测显示,MAP30和MAP30-PEG结合物作用于A549细胞48 h后均可使A549细胞呈现Sub-G1凋亡峰,凋亡率分别为58.7%、42.7%;MAP30和MAP30-PEG结合物对胞内caspase3在凋亡过程中显示有激活作用。结论 MAP30和MAP30-PEG结合物均对A549增殖有明显的抑制作用;两者均能通过caspase3途径诱导细胞凋亡。     

假单胞菌外毒素体外靶向抗肝细胞癌的实验研究

目的：构建携铜绿假单胞菌外毒素PE38基因及甲胎蛋白（AFP）启动子的重组载体,并研究其在体外对AFP阳性肝细胞癌（hepatocellularcarcinoma,HCC）的靶向杀伤作用。方法：构建重组免疫毒素表达质粒pAFP-PE38,通过转染细胞观察其作用,RT-PCR法测定PE38 mRNA表达,CCK-8法检测细胞毒性。结果：各组细胞转染质粒pAFP-PE38后仅AFP阳性的HepG2细胞表达PE38 mRNA,且形态发生改变,生长显著受抑（P〈0.01）,48 h和72 h抑制率分别为27.2%、58.3%,而AFP阴性的PC-3和HeLa细胞未受明显影响。结论：PE38基因真核表达载体可实现HCC基因治疗的靶向性和高效性,有望成为肝细胞癌靶向基因治疗的有力工具。     

放射诱导同步放大基因电路调控HSV-TK表达对肺癌移植瘤的抑制作用

目的构建由放射诱导的一氧化氮(NO)同步放大基因电路,并利用该基因电路调控单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)表达,以研究该基因电路对肺癌细胞体内的治疗作用。方法利用分子克隆的方法构建重组治疗载体pfos-iNOS/TK和对照载体pfos-TK/GFP,并采用脂质体介导重组治疗载体和对照载体转染肺癌细胞A549;G418筛选阳性克隆;建立BALB/c裸鼠移植瘤模型,检测接受照射和未接受照射的瘤组织内TK表达情况,分析给予照射和更昔洛韦(GCV)后肿瘤体积的变化。结果接受照射的瘤组织内TK表达明显强于未接受照射组,接受照射的转染治疗载体组强于接受照射的转染对照载体组,放射合并GCV可明显抑制转染治疗载体的移植瘤,且抑瘤率明显高于单纯照射、GCV治疗和转染对照载体的对照组。结论放射诱导的同步放大基因电路可明显提高体内转染细胞TK的表达,对肺癌移植瘤有显著的抑制作用,明显地提高了HSV-TK/GCV系统对肺癌细胞的敏感性,进一步完善了肿瘤的放射—基因治疗模式。     

siRNA介导的hPOT1基因表达抑制对HeLa细胞凋亡的影响

目的　应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,特异地抑制端粒保护蛋白hPOT1基因在HeLa细胞中的表达,并观察其对细胞凋亡的影响。方法利用先前构建的含hPOT1基因特异性序列(hsRNA)的3种重组siRNA表达质粒,由脂质体介导转染HeLa细胞,以RT PCR和电泳迁移率变化分析法检测转染细胞中的hPOT1基因的表达抑制效果,并通过流式细胞术、Hoechst荧光染色和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果　不同hPOT1特异性序列的3种的重组质粒转染HeLa细胞4 8h后,细胞中hPOT1基因mRNA和蛋白质表达水平降低,细胞凋亡水平明显增加。结论　siRNA表达载体介导的RNAi能有效地抑制HeLa细胞中hPOT1基因表达,hPOT1基因表达下调导致HeLa细胞凋亡     

反义hTERT体外诱导肺癌细胞凋亡的研究

目的研究反义hTERT基因体外诱导肺癌细胞凋亡。方法体外通过SuperFect(QIAGEN)转染正、反义hTERT真核表达载体至人肺腺癌细胞株GLC82,再经过G418及PCR筛选鉴定获得分别转入了正、反义hTERT载体的抗性克隆细胞GLC82s和GLC82as。然后采用MTT法、双层软琼脂克隆形成试验、流式细胞术观察和分析了反义hTERT对肺癌细胞体外生长增殖活力的影响及是否能诱导瘤细胞的凋亡;同时还运用实时荧光定量RTPCR技术及TRAP银染法对各组细胞内源性hTERTmRNA的表达情况及端粒酶的活性进行了检测。结果当各组细胞传至第25代后,与GLC82、GLC82s比较,GLC82as细胞的生长速度和集落形成能力明显地减慢和降低,同时伴有凋亡率的显著增加;与空白对照、正义hTERT组相比,反义hTERT能显著地降低GLC82细胞内源性hTERTmRNA的表达(P<0.01)和下调端粒酶活性。结论反义hTERT体外确实能明显地诱导肺癌细胞的凋亡及抑制瘤细胞的生长增殖能力。     

Lipocalin-2过表达对人肺癌 A549细胞增殖、凋亡及侵袭力的影响

目的：采用基因过表达方法上调人肺癌 A549细胞 Lipocalin-2表达,观察 Lipocalin-2对细胞增殖、凋亡、细胞周期调控及侵袭力的影响。方法构建 Lipocalin-2过表达慢病毒载体,转染人肺癌 A549细胞。Real-time PCR 和 Western blot 检测转染后人肺癌 A549细胞中 Lipocalin-2表达水平。MTT 实验检测细胞增殖。流式细胞术检测细胞周期及凋亡情况。Transwell 小室实验检测细胞侵袭力。结果与阴性对照组和空载体对照组比较,转染组 Li-pocalin-2 mRNA 和蛋白表达水平均显著增加,差异有统计学意义（ P ﹤0.05）。Lipocalin-2过表达慢病毒载体转染后,细胞增殖率和侵袭力显著增加,同时细胞凋亡率及 G0/ G1期细胞比例显著降低,S 期细胞比例显著提高,差异有统计学意义（ P ﹤0.05）。结论 Lipocalin-2过表达通过调控人肺癌 A549细胞周期、抑制凋亡促进细胞的增殖,还明显提高细胞的侵袭力。     

三氧化二砷对HL-60细胞凋亡及其端粒酶hTERT-mRNA表达影响的实验研究

目的　探讨不同浓度的三氧化二砷 (As2 O3)对急性早幼粒细胞白血病细胞株HL 60细胞端粒酶亚单位hTERT mRNA表达及其诱导凋亡的作用。方法　不同浓度的As2 O3与HL 60细胞株共培养 48h ,流式细胞术鉴定HL 60细胞凋亡 ;RT PCR法检测HL 60细胞端粒酶亚单位hTERTmRNA的表达。结果　在 0 1、1 0和 5 0 μmol·L-13种浓度的As2 O3作用下 ,HL 60细胞凋亡率分别为 2 2 8%± 0 40 %、2 5 5 %± 0 2 2 %和 47 5 7%± 2 79% ;端粒酶亚单位hTERT mRNA表达的相对值分别为 73 97%、63 70 %和 2 9 0 4%。细胞凋亡率在 5 0 μmol·L-1与 0 1和 1 0μmol·L-1浓度组间差异有显著性 (P <0 0 1) ;端粒酶亚单位表达的差异也有显著性 (P <0 0 5 )。As2 O3诱导HL 60细胞凋亡效应与其抑制端粒酶亚单位hTERTmRNA的表达相关。结论　As2 O3对HL 60细胞具有凋亡诱导效应 ,且对其端粒酶亚单位hTERTmRNA的表达具有抑制作用 ,两者均呈现浓度依赖效应。As2 O3可能通过抑制HL 60细胞端粒酶亚单位hTERTmRNA的表达而诱导肿瘤细胞凋亡