遗传性高铁血红蛋白血症患者NADH—细胞色素b5还原酶基因估…

为了探讨中国遗传性高铁血红蛋白血症患者的基因突变类型和建立相应的基因诊断方法，从已发现的１例１型患者的外周血白细胞中提取ＲＮＡ，应用反转录ＰＣＲ法分析了Ｃｙｔｂ５ＲｃＤＮＡ的全部编码序列的９２１ｂｐ片段。结果显示：Ｃｙｔｂ５Ｒ ｃＤＮＡ基因第５７位密码子存在有Ａｒｇ→Ｇｌｎ（ｃｇｇ→ＣＡＧ）的错义突变。针对这一突变，用套式ＰＣＲ的方法对已有的３个家系共６名患者进行了基因诊断。结果表明其中两个家系的     

软骨发育不全FGFR3基因突变的研究

目的了解中国人软骨发育不全患者成纤维细胞生长因子受体３（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｒｅｃｅｐｔｏｒ３，ＦＧＦＲ３）基因变异情况。方法应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和限制性内切酶酶切方法，分析辽宁地区７例软骨发育不全（ａｃｈｏｎｄｒｏｐｌａｓｉａ，ＡＣＨ）患者外周血ＤＮＡ标本中ＦＧＦＲ３基因第１０外显子区域。结果７例患者均检测到相同的Ｇ３８０Ｒ点突变。结论表明Ｇ３８０Ｒ为中国人ＡＣＨ患者常见突变。应用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ和限制性内切酶酶切的方法检测ＦＧＦＲ３基因突变是产前诊断和早期诊断ＡＣＨ患者的简便、快速、可靠的手段     

Pfeiffer综合征的遗传异质性研究

目的为揭示Ｐｆｅｉｆｅｒ综合征的分子病理缺欠。方法采用ＳＳＣＰ－ＤＮＡ直接测序及ＰＣＲ－限制性内切酶酶切技术，对４个Ｐｆｅｉｆｅｒ综合征家系的外周血ＤＮＡ进行了分析。结果２个家系是由ＦＧＦＲ２基因突变所致：１例发生在ＦＧＦＲ２基因第８内含子３′剪切位点部位Ａ→Ｇ突变；１例为ＦＧＦＲ２基因第９外显子Ａｓｐ３２１Ａｌａ突变。另外１个家系是由ＦＧＦＲ１基因第５外显子Ｐｒｏ２５２Ａｒｇ突变所致。结论该项研究结果表明了Ｐｆｅｉｆｅｒ综合征的遗传异质性，为该病的病因学研究和临床研究提供了有用的资料     

云南苯丙氨酸羟化酶基因点突变及外显子5内新突变Y166X(C→G)的鉴定

目的研究云南苯丙氨酸羟化酶基因点突变分布概况,以提高该地区苯丙酮尿症（ＰＫＵ）的基因诊断率。方法应用ＰＣＲ－ＡＳＯ探针斑点杂交,ＰＣＲ－ＳＳＣＰ、ＡＳＰＣＲ和ＤＮＡ直接测序等技术,对１３／１４名云南籍ＰＫＵ患儿的苯丙氨酸羟化酶（ＰＡＨ）基因外显子４、５、６、７、１０、１１和１２进行了鉴定分析。结果共检出５种错义突变：Ｒ２４３Ｑ（５／２６）、Ｙ２０４Ｃ（３／２８）、Ｒ４１３Ｐ（２／２８）、Ｔ４１８Ｐ（１／２８）及Ｇ２４７Ｖ（１／２６）,３种无义突变Ｙ１６６Ｘ（Ｃ→Ｇ）（２／２６）、Ｗ３２６Ｘ（１／２８）及Ｙ３５６Ｘ（２／２６）和１种静止突变Ｖ３９９Ｖ（２／２６）。经检索国际ＰＡＨ基因突变数据库,其中Ｙ１６６Ｘ（Ｃ→Ｇ）为首次发现的新突变。结论云南藉ＰＫＵ与中国北方人群有相类似的最常见的ＰＡＨ基因突变类型（Ｒ２４３Ｑ、Ｙ２０４Ｃ、Ｙ３５６Ｘ、Ｖ３９９Ｖ和Ｒ４１３Ｐ）,但与南方人群ＰＡＨ基因突变特点则不同。该发现有助于提高云南ＰＫＵ的基因诊断率,并对我国ＰＡＨ基因突变不同地区及人群的分布、起源研究有参考价值。     

先天性巨结肠RET基因的突变

酪氨酸激酶受体基因（ｒｅｃｅｐｔｏｒｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｇｅｎｅ，ＲＥＴ基因）被定位于染色体１０ｑ１１．２上，其突变可导致３种多发性内分泌瘤综合征和先天性巨结肠的发生。为了探讨ＲＥＴ基因突变在先天性巨结肠发病中的作用，采用多聚酶链反应（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ，ＰＣＲ）及单链ＤＮＡ构象多态性分析（ｓｉｎｇｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄＤＮＡｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＳＳＣＰ）的方法，对３４例散发先天性巨结肠基因组ＤＮＡ进行ＲＥＴ基因第６外显子突变筛查，并对电泳条带变异的ＰＣＲ产物进行了直接核苷酸序列分析。发现１例为ＧＡＣＴＣＡＧＡＣ→ＧＡＡＴＣＡＡＡＣ碱基突变，导致两个氨基酸发生改变。表明ＲＥＴ基因突变与先天性巨结肠发病有关。     

人体对链霉素致聋遗传易感性的分子遗传学研究

为在分子水平探讨链霉素致聋的病理机理，采用ＰＣＲ－ＳＳＣＰ及ＰＣＲ－限制性内切酶酶切，对４个链霉素致聋家系１１例成员的外周血线粒体ＤＮＡ进行了分析。结果发现，１１例家系成员中有９例（４例为正常母亲，５例为聋哑患儿）线粒体ＤＮＡ１２ＳｒＲＮＡ基因上核苷酸１５５５位点发生了Ａ→Ｇ突变。而２例正常父亲未发现该突变。推测该突变是人体对链霉素致聋遗传易感性的分子基础。并对易感致聋的发病机理进行初步探讨。本研究对临床基因诊断及预防具有指导意义。     

21－羟化酶CYP21B基因Ile~（172）→Asn错义突变

为了解先天性肾上腺皮质增生症患者的２１－羟化酶ＣＹＰ２１Ｂ基因中Ｉｌｅ~（１７２）→Ａｓｎ错义突变的发生率，根据放大受阻突变体系（Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｍｕｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ，ＡＲＭＳ）的要求，设计了３种引物：５＇ｄ（ＴＴＧＧＧＡＧＡＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＴＣＴ）３＇（共同引物）、５＇ｄ（ＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＡ）３＇（正常引物）、５＇ｄ（ＡＧＧＴＧＡＧＧＴＡＡＣＡＧＴ）３＇（突变引物），在７例患儿中进行了检测，发现具有本突变者３例。对其中一例进行的家系分析，结果提示：这组引物有快速、简便的优点，不需使用同位素就能对具有Ｉｌｅ~（１７２）→Ａｓｎ变异的高危家庭成员作产前诊断。     

应用微卫星DNA单体型检测Wilson病症状前患者及杂合子

目的建立快速、准确、有效的Ｗｉｌｓｏｎ病（Ｗｉｌｓｏｎｄｉｓｅａｓｅ，ＷＤ）患者早期诊断及杂合子检测的基因诊断技术。方法应用Ｄ１３Ｓ３０１、Ｄ１３Ｓ３１６、Ｄ１３Ｓ２９６、ＡＦＭ２３８ｖｃ３、ＡＦＭ０８４ｘｃ５等５个微卫星ＤＮＡ（ｓｈｏｒｔｔａｎｄｅｍｒｅｐｅａｔ，ＳＴＲ），经聚合酶链反应（ＰＣＲ），扩增片段长度多态性－聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＡＦＬＰ－ＰＡＧＥ），对２３个ＷＤ家系１２０名成员的ＤＮＡ进行单体型分析。结果２例拟诊患者得到确诊。在３１例ＷＤ同胞中，检出肯定症状前患者４例、杂合子８例、正常人１７例、可疑患者２例。结论ＳＴＲ单体型可提供高信息量的遗传诊断信息，为ＷＤ基因诊断提供了重要的新途径     

应用多重等位基因特异PCR技术进行β地中海贫血的基因诊断

在等位基因特异ＰＣＲ及多重ＰＣＲ的基础上建立了多重等位基因特异ＰＣＲ技术（ＭＡＳＰＣＲ），对中国人常见的－２８Ａ→Ｇ，ＣＤ１７→０，ＣＤ４１－４２（－４ｂｐ）和ＣＤ７１－７２（＋Ａ）等β地中海贫血基因突变进行检测，应用该技术对２１例β地中海贫血患者或携带者进行基因诊断和２例高风险胎儿进行产前诊断诊断，诊断结果与ＰＣＲ／ＡＳＯ探针点杂交或ＤＮＡ测序的结果完全一致，证实多重等位基因特异ＰＣＲ技术具有简便、快速、可靠和经济等优点。     

微卫星标记AFM238vc3多态性及Wilson病基因诊断的研究

目的：评估中国人群Ｗｉｌｓｏｎ病（ＷＤ）基因（ＷＮＤ）侧翼微卫星ＤＮＡ（ＳＴＲ）位点ＡＦＭ２３８ｖｃ３的基因多态性及在ＷＤ基因诊断中的价值。方法：采用聚合酶链反应（ＰＣＲ）、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染法分析８９名无血缘关系中国人ＡＦＭ２３８ｖｃ３的片段长度多态性；并对１９个ＷＤ家系进行ＳＴＲ连锁分析。结果：ＡＦＭ２３８ｖｃ３有２１个等位片段，长度范围为２９１～３４５ｂｐ，多态信息含量（ＰＩＣ）为０９３８。共检出８例症状前患者，８例基因携带者及１４例正常人，６例未能确定，基因诊断率达８３％。结论：ＡＦＭ２３８ｖｃ３在中国人群是优秀的多态性标记，对ＷＤ基因诊断有较重要价值。     

外源基因在人造血干祖细胞中的转移和表达

应用逆转录病毒载体介导基因转移法将ｎｅｏ~ｒ基因导入人造血干祖细胞，并经体外液体长期培养。结果表明，产重祖病毒细胞ＰＡ３１７／Ｎ２的病毒滴度最高达６．５×１０~５ＣＦＵ／ｍｌ，用ＰＣＲ法从体外培养２、４、６ｗ及加入ｒＩＬ－１、ｒＩＬ－６的悬浮和贴壁的转染细胞中均可扩增出ｎｅｏ~ｒ基因ｃＤ－ＮＡ片段，非同位素化学发光法标记ｎｅｏ~ｒ探针与之杂交显示阳性结果。表明逆转录病毒介导目的基因已有效地转入体外培养的人造血干祖细胞中，并进行表达。     

应用载体介导的RNA干扰技术抑制Nurr1基因在PT67细胞中的表达

本研究应用载体介导的RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术特异地干扰孤儿核受体1(nuclear related factor1,Nurr1)基因的表达,以建立稳定的RNAi技术及用于下一步的Nurr1基因治疗研究。我们筛选了四对Nurr1基因的特异性序列shRNA(short hairpin RNA),构建相应的载体(psilencerTM3.1-H1neo shRNA1,2,3,4)。分别将这4种质粒瞬时转染入已转染了逆转录病毒质粒pLNCX2-Nurr1并稳定表达Nurr1基因的PT67细胞中。在转染后24、48和72h分别采用免疫荧光、免疫组化、免疫印迹以及Real-time PCR的方法检测细胞中Nurrl蛋白及基因的表达水平。结果显示,转染psilencerTM3.1-H1neo shRNA2、3号24h和48h后,经免疫荧光和免疫组化检测,Nurr1在PT67细胞中表达显著降低;免疫印迹结果也显示,Nurr1蛋白量明显低于阴性对照组。psilencerTM3.1-H1neo shRNA1、4对Nurr1蛋白表达没有明显影响。Real-time PCR相对定量结果也同样证实2、3号转染后Nurr1基因表达的干扰效果明显,而1、4号结果相对较弱。通过本实验,我们筛选出了两段Nurr1特异性siRNA序列,且干扰效果在转染后24h至48h时效果最为明显。     

多聚乙酸亚胺介导基因转移

目的 采用一种新的多聚阳离子化合物－多聚乙酰亚胺（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ,ＰＥＩ）,作为将外源性基因转入骨骼肌细胞的介导物。方法 骨骼肌细胞取生新生ＳＤ大鼠,经胰酶消化后培养,将ＬａｃＺ基因ＤＮＡ－ＰＥＩ复合物导入骨骼肌细胞内,最后用Ｘ－ｇａｌ组织化学染色法检测已转染的细胞。结果 ＰＥＩ可作为介导剂使ＬａｃＺ基因在培养的骨骼肌细胞中表达,其表达率可达到３０％。结论 ＰＥＩ在真核细胞中实施     

白细胞介素3基因疗法和白细胞介素6基因疗法的联合造血调控作用

研究了成纤维细胞介导的ＩＬ－３基因疗法，ＩＬ－６基因疗法以两者联合后对造血系统的影响。结果发现，单用ＩＬ－基因疗法的小鼠白细胞总数，中性粒细胞，骨髓ＣＦＵ－ＧＭ，ＣＦＵ－ＭＫ等显著上升，但血小板上升程度经，单用ＩＬ－６基因疗法的小鼠血小板，中性粒细胞，骨髓ＣＦＵ－ＧＭ，ＣＦＵ－ＭＫ上晚为显著。     

脂质体介导IFNγ基因治疗小鼠肝癌的研究

以大肠杆菌β－ｇａｌ基因为报告基因，优化了３种阳离子脂质本的转染条件，评估了其转染效率。用构建的含腺相关病毒反向末端重复序列的质粒表达载体，经Ｄｏｓｐｅｒ介导将小鼠ＩＦＮγ基因导入ＭＭ４５Ｔ．Ｌｉ细胞，体外有效地表达ＩＦＮγ。瘤体内注射Ｄｏｓｐｅｒ－ｐＡＩ－ｍＩＦＮγ复合物可明显报制肿瘤生长，荷瘤小鼠生存期延长。     

mRNA差异显示法克隆小鼠精子发生相关基因p38MAPK基因

目的：克隆1、2、3、4周龄小鼠睾丸之间差异表达的基因。方法：应用改良的mRNA差异显示技术,对1、2、3、4周龄小鼠睾丸进行基因表达的差异显示分析,并对其中1个从2周龄小鼠中高表达的cDNA片段进行了克隆和测序。结果：所克隆的cDNA片段与小鼠大脑、造血干细胞p38MAPK（p38beta mitogen-activated protein knase,p38MAPK-β）基因的同源性分别为91％和85％.Northern dot blot结果显示该基因在小鼠睾丸和脑组织 中表达最高。结论：小鼠p38MAPK基因基因可能与小鼠精子发生相关。     

GENE EXPANSION AND ANTIBODY VARIABILITY

The amino acid sequence near the N-terminus of a human immunoglobulin (Ig) light (L) chain has been determined. This sequence is more homologous to avian Ig L chains than to human Ig L chains, and defines an additional variable (V-) region subgroup designated as VλVI. These data also suggest that all vertebrates share large numbers of Ig V-region genes and that 'species-specific’residues reflect the expression in different species of different sets of V-region genes. Control at a level equivalent to ‘regulatory genes’ * * The term ‘regulatory genes’ represents either the regulator gene or the operator gene in the bacterial system or even a fourth level of control.
determines which genes are expressed. Our findings raise a question concerning the possible role of redundant DNA, in that at least some of the ‘nonsense’ DNA in one species may actually be 'sense’DNA in another. We hypothesize that in evolution‘gene expansion’is a regular mechanism for the generation of new genes and that different members of a given group of repetitious genes are expressed in different species. Such a phenomenon is basically similar to the‘mechanism’controlling the differential expression of genes during embryonic differentiation. Our hypothesis differs from the previous version of the germ-line hypothesis proposed for genetic control of antibody variability which involves ‘sudden excessive gene expansion and contraction’. Evidence suggesting that the‘gene expansion’mechanism may also be applicable to a lesser degree to other gene systems is briefly reviewed and discussed.     

RB患者及家庭成员Rb基因突变和患病风险的基因诊断及遗传咨询

目的建立Ｒｂ基因突变的基因诊断方法，正确估计视网膜母细胞瘤（ＲＢ）患者的预后及其家庭成员的患病风险。方法综合利用Ｓｏｕｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交、ＳＳＣＰ分析、直接ＤＮＡ序列测定等多种分子生物学技术作染色体单体型分析及Ｒｂ基因点突变的直接检测。结果７９个有Ｒｂ基因突变的ＲＢ家系中２５例先证者仅查出体细胞起源的Ｒｂ基因突变，其余５４例存在生殖细胞起源的Ｒｂ基因突变，其中３６例突变是新产生的，１５例突变由亲代遗传而来，此外，尚有３例Ｒｂ基因突变嵌合体。结论直接检测Ｒｂ基因点突变可不依赖于患者家庭成员ＲＢ发病情况的遗传背景资料诊断患者是否属于遗传型，正确估计患者的预后；并能在肿瘤发生前甚至产前检出Ｒｂ基因突变携带者，正确估计患病风险     

GST－π基因和癌基因int－2在乳腺癌中的扩增与基因的表达

采用ＤＮＡ和ＲＮＡ的斑点杂交分析方法，对３２例乳腺癌和相应的癌旁正常组织中ＧＳＴ－π和ｉｎｔ－２基因的ＤＮＡ扩增和ＲＮＡ转录表达情况进行研究，发现ＧＳＴ－π在乳腺癌中存在基因扩增和明显的ｍＲＮＡ表达增强，ＧＳＴ－π基因表达调控主要在转录水平进行；癌基因ｉｎｔ－２与乳腺癌的发生有一定关系。同时还发现乳腺癌中ＧＳＴ－π与ｉｎｔ－２基因之间存在有共扩增和共表达现象。     

恙虫病东方体58kDa热休克蛋白与47kDa外膜蛋白的基因嵌合及58-47嵌合基因在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法 ,从恙虫病东方体Karp株基因组DNA中扩增 5 8kDa热休克蛋白的基因 ,将该基因分别与原核表达载体pQE30及 4 7kDa外膜蛋白的基因重组质粒 (pQE30 4 7)连接 ,构建pQE30 5 8及pQE30 5 8 4 7重组质粒 ,用重组质粒转化大肠杆菌。SDS PAGE显示 ,pQE30 5 8和pQE30 5 8 4 7转化的大肠杆菌分别产生一 5 8kDa重组蛋白和一 90kDa的双抗原 (5 8- 4 7)融合蛋白。免疫印迹分析显示Karp株免疫血清能特异识别 5 8kDa重组蛋白和 90kDa融合蛋白 ,90kDa融合蛋白既与 4 7kDa重组蛋白也与 5 8kDa重组蛋白的免疫血清特异反应 ,5 8kDa与 4 7kDa重组蛋白也被 90kDa融合蛋白免疫血清所识别。研究结果证明 5 8 4 7融合蛋白具有恙虫病东方体Karp株 4 7kDa外膜蛋白和 5 8kDa热休克蛋白的抗原特性