抗人CD86人-鼠嵌合抗体的构建及在CHO细胞的表达

从分泌鼠抗人CD86单克隆抗体的杂交瘤细胞株(克隆号:1D1)中抽提总RNA,采用简并引物,经RT-PCR扩增单抗VH和VL的DNA编码区基因。通过SMART-PCR扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。采用基因重组技术,将单抗VH、VL基因及其相应信号肽序列,与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/1D1。转染293T细胞进行瞬时表达,采用流式细胞术分析,转染上清与L929-CD86基因转染细胞的阳性结合率为97.6%。既而转染CHO细胞,经G418筛选,获取稳定分泌嵌合抗体的基因转染细胞株(CHO-ch1D1)。收集无血清培养基的培养上清,采用Protein G亲和层析柱分离纯化,经Lowr法定量。从上清中获取的嵌合抗体蛋白的得率为3.066 mg/L。经进一步间接免疫荧光及流式细胞术分析,纯化嵌合抗体与L929-CD86基因转染细胞,及Daudi细胞膜型CD86分子的阳性结合率分别为98.5%和95.7%。将嵌合抗体(终浓度为5μg/ml)加入到Daudi细胞的培养体系中,经显微镜观察及MTT法分析,嵌合抗体对Daudi细胞的生长具有抑制作用(P<0.05)。本研究获取的嵌合抗体在CD86分子的基础和应用研究中具有重要的价值。     

抗人肺癌mAbLC-1的人-鼠嵌合Fab片段基因表达质粒的构建与表达

目的表达抗人肺癌单克隆抗体(mAb)LC 1的人 鼠嵌合基因工程抗体。方法将mAbLC 1的VL 和VH 基因插入质粒 pWS1 中 ,构建成表达mAbLC 1人 鼠嵌合Fab片段基因的质粒pLC 1 ,转化大肠杆菌TG 1并在其中表达。结果酶切鉴定表明 ,mAbLC 1的VL 和VH 基因插入方向正确 ,该载体能在大肠杆菌TG1中表达预期相对分子质量的蛋白 ,表达产物对mAb具有较强的竞争结合抗原的活性。结论成功地表达了具有较高亲和活性的人 鼠嵌合抗人肺癌的基因工程抗体。     

抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段的构建和表达

目的:通过基因工程技术构建和表达抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段。方法:从分泌鼠抗人CD154单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4F1中提取总RNA,分别采用特异性引物扩增mAb VH和VL的DNA编码区基因。同时,从人脾脏细胞中克隆出免疫球蛋白恒定区基因。利用基因重组技术构建嵌合Fab共表达载体pTXB1-Fab,利用大肠杆菌表达简单,高效,成本低廉的特点,对重组Fab进行原核表达。利用SDS-PAGE电泳、Western blot、流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征。表达质粒pTXB1-Fab构建正确,在大肠杆菌中实现可溶性表达。表达的人-鼠嵌合抗体与亲本抗体具有相同的识别位点。结论:成功地克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4F1)的轻链、重链可变区基因,成功构建pTXB1-Fab共表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,为人源化抗体的制备奠定了技术基础。     

抗rh-bFGF嵌合抗体真核表达载体的构建与表达

目的 :构建并在真核细胞中表达抗人重组碱性成纤维生长因子 (rh bFGF)人 鼠嵌合抗体。方法 :从分泌抗rh bFGF鼠单抗(mAb) 1F11的杂交瘤细胞中扩增、克隆VL、VH 基因 ,从质粒pMDHC和pMDLC中扩增、克隆CL、CH 基因 ,测序鉴定后插入真核表达载体 ,并转化二氢叶酸还原酶缺陷型中国仓鼠卵巢(CHO dhfr- )细胞进行表达。采用间接ELISA检测表达产物的人源性和其抗原结合活性。结果 :序列测定表明所克隆的抗体基因是功能性抗体的V区基因 ,在转化细胞的培养上清中可检测到抗rh bFGF嵌合抗体的表达。ELISA试验证实 ,该嵌合抗体具有人源C区 ,并具有鼠mAb 1F11的抗原结合活性。结论 :在真核细胞中成功地表达抗rh bFGF的人 鼠嵌合抗体 ,为其临床应用研究奠定了基础     

抗人CD25嵌合抗体基因的构建及其瞬时表达研究

目的:构建抗人CD25嵌合抗体基因并在哺乳动物细胞中进行瞬时表达和初步鉴定。方法:采用RLM-RACE法克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并利用基因拼接法构建嵌合抗体基因。用脂质体法瞬时转染三种哺乳动物细胞,并使用ELISA、FCM、WB、Dot blot和免疫荧光法进行检测。结果:成功克隆WuTac抗体可变区和信号肽序列,并构建了抗人CD25嵌合抗体表达质粒。瞬时转染结果表明所表达的嵌合抗体保留了亲本抗体WuTac的抗原结合力。结论:成功构建了抗人CD25嵌合抗体基因,为其进一步研究打下基础。     

抗人CD3嵌合抗体基因的构建、表达及表达产物的初步功能研究

目的：构建并表达抗人CD3嵌合抗体，以克服鼠源单克隆抗体(mAb)用于临床的局限性。方法：采用基因工程技术，将抗体VL、VH因分别克隆入嵌合抗体表达载体VL Express及VH Express中。共转染COS-7细胞后，用ELISA检测培养上清中嵌合抗体的表达水平；采用Protein A亲和层析法纯化抗体，并进行Western blot鉴定。用FACS检测嵌合抗体结合抗原的活性；混合淋巴细胞培养检测抗体的功能。结果：成功地构建了VH Express-VH及VL Express-VL表达载体并表达纯化。Westem blot的结果显示，表达的抗人CD3抗体为人鼠嵌合抗体。FACS的结果显示．该抗体具有良好的结合抗原活性；混合淋巴细胞培养结果显示．该抗体具有一定的免疫抑制功能。结论：成功地构建、表达了抗人CD3嵌合抗体，为进一步的研究打下了基础。     

抗CD4人-鼠嵌合抗体的表达和抗增殖效应

目的：制备抗CD4人－鼠嵌合抗体。方法：从分泌抗CD4单克隆抗体的杂交瘤细胞中提取总RNA，通过RT－PCR扩增出VH和VL的DNA 片优，对VH和VL进行DNA序列测定和分析，证实VH和VL具有小鼠Ig可变区完整的结构功能后，将VH亚克隆至重链表达载体pγ1-Expr,VL亚克隆至轻链表达载体pκ－Expr转化XL2－Blue细菌，通过菌落或质粒PCR筛选阳性克隆，通过电转染将VH－Pγ1，LV－pκ共转染至小鼠骨髓瘤细胞X63Ag8,653，通过G418筛选，ELISA和免疫荧光鉴定。结果：得到分泌抗CD4人－鼠嵌合体的阳性转染瘤细胞克隆。所得到的嵌合抗体在体外对PHA和IL－2诱导的PBMC增殖具有抑制作用。结论：人－鼠嵌合抗体得到成功表达，并有可能作为免疫抑制剂应用于抗移植排斥和自身免疫疾病的治疗。     

抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的表达及体外对癌细胞浸润的抑制效应

目的 制备抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体。方法从分泌抗人组织蛋白酶B单克隆抗体的杂交瘤细胞株提取总RNA，通过RT-PCR扩增单克隆抗体VH和VL的DNA片段，对其进行序列分析，证实具有小鼠可变区完整的结构，利用基因工程技术将它们分别和人Ig的Cγ1和Ck恒定区基因连接组建人鼠嵌合轻链和重链Fab抗体，并克隆到pcDNA3真核细胞表达载体。将重组体转染到中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，通过G418筛选、ELISA检测和Western blot鉴定，分离纯化抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体，用于体外抑制癌细胞浸润的试验。结果得到分泌抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体的中国仓鼠卵巢细胞克隆(O62A2)，分泌的抗人组织蛋白酶B人-鼠嵌合抗体在体外能抑制癌细胞浸润。结论人-鼠嵌合抗体的成功表达，将有可能用于组织蛋白酶B过度表达的有关疾病的治疗。     

抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链的真核表达

目的:在Sp2/0细胞中表达抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链.方法:采用RT-PCR技术从稳定分泌抗人L-PGDS单克隆抗体(mAb)的小鼠杂交瘤细胞中扩增抗体轻链可变区基因VL, 并构建到人-鼠嵌合轻链表达载体pAG4622.重组质粒pAG4622/VL经DOTAP试剂转染入Sp2/0细胞, 酶酚酸筛选后用ELISA和RT-PCR检测表达产物.结果:在筛选后的转染细胞上清中检测到抗人L-PGDS人-鼠嵌合轻链蛋白, 且其细胞中存在相应嵌合轻链mRNA.结论:嵌合轻链的稳定表达, 为后续抗人L-PGDS人-鼠嵌合抗体的获得奠定基础.     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及其功能研究

目的:实现抗人CD40的人-鼠嵌合抗体(ch-5C11)在的CHO细胞中的稳定表达并对其生物学活性进行初步的研究。方法:pIRES/hu5C11嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞,采用RT-PCR对CHO细胞进行基因水平鉴定,以流式细胞术(FCM)和Western blot对表达上清中ch-5C11人免疫球蛋白Fc段和κ链成分进行检测,利用Protein G亲和层析和Lowry法进行纯化和定量,MTT实验检测表达ch-5C11对Daudi细胞增殖的抑制效应。结果:获得稳定分泌目的蛋白的CHO稳定株,RT-PCR结果表明目的基因成功整合在CHO稳定株中,FCM和Western blot结果表明稳定株上清中含有抗人CD40抗体,且含人免疫球蛋白Fc段和κ链;Lowry法定量ch-5C11浓度为0.535mg/L,并经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯度良好;ch-5C11能抑制Daudi细胞增殖。结论:获得了持续分泌ch-5C11的CHO稳定株,功能学研究显示ch-5C11能抑制B细胞淋巴瘤细胞株体外增殖。     

人-鼠嵌合抗体表达载体的构建和抗人HER2抗体的表达

目的 :构建表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体 ,用于以嵌合抗体的形式表达PCR获取的小鼠抗体可变区基因 ,以便将人 鼠嵌合抗体应用于临床治疗。方法 :用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建人 鼠嵌合抗体的表达载体 ,并转染真核细胞 2 93T进行表达。用RT PCR、FACS和ELISA进行抗体表达的鉴定。结果 :利用人Tac抗原信号肽以及人IgCκ基因和γ1CH基因 ,构建了用于表达人 鼠嵌合抗体的通用真核表达载体。用本研究设计的引物 ,扩增小鼠抗人HER2抗体的V区基因片段 ,酶切后先后插入所构建的载体的相应克隆位点 ,转染 2 93T细胞可将PCR获得的小鼠抗体V区基因片段表达为人 鼠嵌合抗体。用RT PCR、FACS和ELISA证实 ,本系统可表达嵌合抗体。结论 :构建了人 鼠嵌合抗体的真核表达载体 ,并证实了其可在 2 93T细胞中表达。     

抗CD20嵌合抗体的构建与表达

目的构建抗CD20嵌合抗体的真核表达载体并实现在真核细胞中的表达。方法采用RT-PCR,从分泌鼠源抗人CD20抗体的杂交瘤细胞系1-28中钓取其轻、重链基因,连接至T载体,进行序列测定。还原SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗CD20单克隆抗体(mAb)1-28的轻、重链蛋白,切取轻链及重链条带,质谱测定氨基酸序列,Biolynx和pepeseq软件分析可信度。对比所测DNA序列与蛋白序列,确定所钓取基因的正确性。将mAb1-28轻重链可变区基因,连接至表达载体pCMV-VH和pCMV-VL,构建成嵌合抗体C1-28的轻链真核表达载体C1-28L及重链真核表达载体C1-28H。PCR、酶切及序列测定以确定连入基因的正确性。脂质体介导法将嵌合抗体的轻重链真核表达载体共转染入293T细胞,RT-PCR检测mRNA水平的表达,夹心ELISA法检测蛋白表达量,Westernblot检测目的蛋白的大小。结果钓取到mAb1-28基因。mAb部分蛋白序列测定结果与根据所钓取基因推出的蛋白序列相对应。成功构建了嵌合抗体的真核表达载体,并实现真核表达,表达量可达257mg/L,其相对分子质量(Mr)与人IgG的Mr一致。结论为后续研究嵌合抗CD20抗体对非霍奇金淋巴瘤的治疗提供了一定的依据。     

抗炭疽保护性抗原人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达和活性研究

目的 在CHO细胞中表达抗炭疽芽孢杆菌保护性抗原(rPA)人-鼠嵌合抗体,并对其活性进行分析.方法 RT-PCR克隆具有中和活性鼠源单克隆抗体的轻、重链可变区基因,分别与人Kappa型轻链恒定区、IgG1重链恒定区基因融合后构建了轻重链嵌合抗体基因.将轻重链嵌合抗体基因克隆表达载体上,构建了嵌合抗体的双启动子表达载体pSeeTag-5E1.将pSecTag-5E1转染CHO-dhfr(DG44)细胞,撤掉胸腺嘧啶和次黄嘌呤并不断提高氨甲蝶呤(MTX)的浓度,筛选表达量高的克隆,扩大培养,收集上清,并纯化,用纯化的嵌合抗体进行SDS-PAGE、Western blot、抗原结合活性、体外细胞保护试验和动物试验.结果 在MTX的浓度为5×10~(-8)mol/L时,获得稳定表达细胞株,表达量为18 mg/L.结论 成功在CHO-dhfr(DG44)细胞中表达了具有中和活性的抗rPA人-鼠嵌合抗体,为制备抗炭疽的被动免疫制剂奠定了良好的基础.     

用RLM-RACE法克隆抗CD20单克隆抗体可变区基因及其信号肽基因

目的:寻找一种可同时钓取抗CD20mAbVL、VH基因及其信号肽基因的方法。方法:使用Trizol提取杂交瘤细胞1-28的总RNA,分别采用传统的快速扩增5′cDNA末端(traditionalrapidamplificationof5′cDNAend,T5′RACE)和RNA连接酶介导的快速扩增5′cDNA末端(RNAligasemediatedrapidamplificationof5′cDNAend,RLMRACE)的方法钓取目的基因。将其克隆到pGEMTEasy载体上,测序后,与Kabat数据库和GenBank中相应的序列进行比对。结果:采用RLMRACE法可同时钓取到抗CD20mAbVL、VH基因及其信号肽基因,而用T5′RACE法仅能获得VL基因及其信号肽基因。结论:RLMRACE法是钓取抗体V区基因和信号肽基因的好方法。     

抗人肝癌单链抗体的基因克隆和分泌型表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ技术，从分泌抗人肝癌单克隆抗体的杂交瘤细胞ＨＡｂ１８中，扩增出抗体ＶＨ和ＶＬ连接肽基因，将ＶＨ和ＶＬ连接成ＳｃＦｖ基因，并进行序列测定，结果表明，ＶＨ，ＶＬ，ｌｉｎｋｅｒ拼接正确，基因全长为７２６ｂｐ。用噬菌粒表达载体ｐＣＡＮＴＡＢ ５Ｅ在大肠杆菌中表达了可溶性的ＳcＦｖ融合蛋白，经流式细胞仪分析表达产物可特异地与肝癌细胞结合，而不与正常肝细胞及胃癌细胞结合。