养心通脉有效部位方与急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞的动员及定向归巢

背景:急性梗死心肌修复过程中,寻找可有效提高外周血骨髓间充质干细胞的数量、并动员其定向归巢于损伤心肌的骨髓间充质干细胞动员剂尤为关键.目的:探讨养心通脉有效部位方对急性心肌梗死大鼠骨髓间充质干细胞动员入血及定向归巢于梗死心肌的影响.方法:养心通脉有效部位方主要成分包括人参皂苷、丹参酮ⅡA、总生物碱、人参多糖等,由中南大学药学院依课题组稳定的制作工艺制作提供.SD大鼠70只,取8只大鼠作为正常对照组,剩余62只大鼠建立急性心肌梗死模型.取造模成功的32只大鼠,随机分为养心通脉有效部位方组、复方丹参注射液组、重组人粒细胞集落刺激因子组、模型对照组,各组均于造模3 h后给与对应药物,连续5 d.流式细胞仪检测外周血CD34+细胞数,免疫组化染色检测梗死心肌边缘区CD34+细胞数.结果与结论:与模型对照组比较,重组人粒细胞集落刺激因子组、养心通脉有效部位方组外周血CD34+细胞数均明显增加(P < 0.01);心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数均显著增加(P < 0.01).与重组人粒细胞集落刺激因子组比较,养心通脉有效部位方组心肌梗死边缘区胞浆CD34+细胞数显著增加(P < 0.01).养心通脉有效部位方能促进骨髓干细胞动员入血,并定向归巢于梗死心肌,其作用与重组人粒细胞集落刺激因子大体相当,在归巢CD34+细胞方面甚至强于重组人粒细胞集落刺激因子,是一种良好的骨髓间充质干细胞动员剂.     

尾静脉注射骨髓基质细胞和腹腔注射粒细胞集落刺激因子治疗大鼠脑梗死

背景:骨髓间充质干细胞具有成神经分化特性,有很多试验也证实粒细胞集落刺激因子可以用于改善脑梗死后的神经功能。目的:比较静脉移植骨髓间充质干细胞和腹腔注射粒细胞集落刺激因子动员干细胞来治疗大脑中动脉闭塞模型大鼠疗效。方法:实验以改良的Zea-longa线栓法阻断大脑中动脉建立SD大鼠脑梗死模型,造模24h后分别通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞或腹腔注射粒细胞集落刺激因子。结果与结论:两种治疗方法均可改善脑梗死模型大鼠的运动和认知功能,且粒细胞集落刺激因子对脑梗死模型大鼠的运动和认知功能的改善比尾静脉注射骨髓间充质干细胞明显,移植后第7,14天,粒细胞集落刺激因子组梗死面积小于骨髓间充质干细胞组(P<0.05),粒细胞集落刺激因子组BrdU阳性细胞数多于骨髓间充质干细胞组(P<0.05)。提示粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗脑梗死的疗效可能优于骨髓间充质干细胞静脉注射的移植方法。     

尾静脉注射骨髓基质细胞和腹腔注射粒细胞集落刺激因子治疗大鼠脑梗死

背景：骨髓间充质干细胞具有成神经分化特性,有很多试验也证实粒细胞集落刺激因子可以用于改善脑梗死后的神经功能.目的：比较静脉移植骨髓间充质干细胞和腹腔注射粒细胞集落刺激因子动员干细胞来治疗大脑中动脉闭塞模型大鼠疗效.方法：实验以改良的Zea-longa线栓法阻断大脑中动脉建立SD大鼠脑梗死模型,造模24 h后分别通过尾静脉注射骨髓间充质干细胞或腹腔注射粒细胞集落刺激因子.结果与结论：两种治疗方法均可改善脑梗死模型大鼠的运动和认知功能,且粒细胞集落刺激因子对脑梗死模型大鼠的运动和认知功能的改善比尾静脉注射骨髓间充质干细胞明显,移植后第7,14天,粒细胞集落刺激因子组梗死面积小于骨髓间充质干细胞组（P 〈 0.05）,粒细胞集落刺激因子组BrdU阳性细胞数多于骨髓间充质干细胞组（P 〈 0.05）.提示粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞治疗脑梗死的疗效可能优于骨髓间充质干细胞静脉注射的移植方法.     

干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子与心肌梗死大鼠体内骨髓间充质干细胞的迁移

背景:外周静脉移植间充质干细胞只有1%～5%的移植细胞能归巢到心肌梗死区域。目的:观察干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子对骨髓间充质干细胞归巢的影响。方法:采用贴壁培养法分离培养SD大鼠骨髓间充质干细胞,取传至3～5代细胞。建立SD大鼠急性心肌梗死模型,干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组、干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组在骨髓间充质干细胞移植前3d和移植后3d单独或混合皮下注射干细胞生长因子、粒细胞集落刺激因子,骨髓间充质干细胞组不注射细胞因子。结果与结论:荧光显微镜下观察,骨髓间充质干细胞迁移至心肌梗死组织,骨髓间充质干细胞组、干细胞生长因子组、粒细胞集落刺激因子组迁移至心肌梗死区的骨髓间充质干细胞数量没有明显的区别(P>0.05),干细胞生长因子+粒细胞集落刺激因子组的骨髓间充质干细胞数量明显高于其他3组(P<0.05)。免疫荧光组织化学显示,植入的部分骨髓间充质干细胞表达心肌特异蛋白cTnI。结果说明干细胞生长因子和粒细胞集落刺激因子两种细胞因子联合应用可以促进骨髓间充质干细胞归巢至心肌梗死区域,在体内微环境的诱导下,骨髓间充质干细胞能够转化为心肌样细胞。     

粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞原位移植治疗大鼠缺血性脑梗死

背景:粒细胞集落刺激因子是骨髓造血干细胞的强有力的动员剂,已经证实粒细胞集落刺激因子具有同时动员造血干细胞和间充质干细胞的能力。目的:观察应用粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞进入脑梗死部位,对缺血性脑梗死大鼠的治疗作用。设计:随机分组设计、动物实验。单位:中山大学干细胞与组织工程中心。材料:实验于2004-09/2005-01在中山大学(北校区)动物实验部和中山大学干细胞与组织工程中心完成。选择雄性Wistar大鼠200只,随机分为自体骨髓干细胞移植组和对照组,每组100只。方法:两组均用线栓法制作大鼠缺血脑梗死模型。自体骨髓干细胞移植组于复制缺血脑梗死模型后1h腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子(60μg/kg)。对照组于术后1h腹腔注射等量生理盐水。①术前及术后24h,48h,1周测各组大鼠的体质量,计算体质量减轻率_并对大鼠进行神经病学分级。分级标准:0级:正常_1级:对侧前肢屈曲_2级:提尾时,对侧前肢抓力减弱_3级:自主运动无方向性,提尾时向对侧旋转_4级:自主运动时,向对侧旋转。②将两组大鼠各取15只,分别于术后24,48h和1周开颅取脑,用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积、苏木精-伊红染色检查脑组织病理变化、免疫组织化学检测CD34阳性细胞浸润情况。主要观察指标:体质量减轻率,神经病学分级,脑梗死体积,脑组织病理变化,CD34阳性细胞浸润情况。结果:纳入动物200只,造模成功180只,造模后1～7d死亡48只,存活132只,随机选择120只进入结果分析。①体质量测定、神经病学分级:术后24h,48h两组大鼠体质量减轻率比较差异无显著性(P<0.05);术后1周自体骨髓干细胞移植组体质量减轻率显著低于对照组,差异显著[分别为(10.5±8.2)%,(17.8±7.1)%,P<0.05]。自体骨髓干细胞移植组的神经损伤与对照组比较差异无显著性。②梗死灶体积:对照组梗死灶体积和梗死灶体积占全脑体积百分比高于自体骨髓干细胞移植组,差异显著[分别为(251.69±52.77),(145.72±28.05)mm3,(17.00±2.69)%,(9.90±1.62)%,P<0.01]。③病理学改变:术后24h,两组大鼠均出现典型的脑缺血梗死病理变化,自体骨髓干细胞移植组大鼠的梗死区可见少量单个核细胞,而对照组则无。术后48h神经细胞大片消失,胶质细胞变性,自体骨髓干细胞移植组有大量单个核细胞浸润,对照组相对较少。1周后对照组梗死区脑组织液化变软,坏死灶周围可见较多的单核和淋巴细胞浸润_自体骨髓干细胞移植组大鼠部分坏死灶被新生毛细血管和胶质细胞增生修复,炎性细胞浸润不明显。④免疫组织化学检查:术后24h,自体骨髓干细胞移植组大鼠的手术侧脑组织中检测到CD34阳性的单个核细胞,对侧脑组织及对照组大鼠的脑组织无此类细胞。术后48h,自体骨髓干细胞移植组手术侧脑组织除有CD34阳性单个核细胞浸润,还发现呈锥形并且带有突起的CD34阳性细胞。对侧脑组织、对照组大鼠的脑组织均未见CD34阳性细胞。结论:粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞进行自体干细胞原位移植治疗,可以减轻大鼠缺血性脑梗死程度,减少脑梗死体积。     

重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞对大鼠脑出血后脑水肿的影响

目的:国内外研究报道,重组粒细胞集落刺激因子可以动员骨髓干细胞向脑梗死病损部位迁徙,减轻脑缺血后的脑水肿和脑损伤,但是,国内关于该类药物对脑出血后脑水肿影响的报道鲜见.观察重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞对大鼠脑出血后脑水肿及血肿周边区脑组织基质金属蛋白酶9表达的影响.方法:实验于2006-03/11在泸州医学院中心实验室进行.①实验材料:健康雄性SD大鼠144只,体质量(300±20)g,由泸州医学院动物科提供.实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准.②实验方法:将大鼠随机分为假手术组、脑出血组、治疗组,48只/组.脑出血组和治疗组参照Yang的方法,采用断尾取自体血方式制备大鼠脑出血模型.假手术组用生理盐水代替自体血,其余条件与脑出血组一致.治疗组于造模1h后腹腔注射重组粒细胞集落刺激因子 60μg/kg.③实验评估:检测大鼠脑组织含水量,并采用免疫组织化学法检测大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达.结果:144只大鼠中共有16只大鼠脱落,其中7只大鼠术后模型评价为0级,9只死亡.均在实验过程中予以补足.①脑出血组大鼠脑组织含水量明显高于假手术组(P < 0.05),脑出血组含水量在造模后48,72 h最明显,且与造模后6 h、12 h、24 h、7 d相比差异显著(P < 0.05).治疗组大鼠脑组织含水量明显低于脑出血组 (P < 0.05).②脑出血组大鼠脑组织基质金属蛋白酶9的表达明显高于假手术组(P < 0.05),在造模后48 h、72 h最明显,且与6 h、12 h、24 h 、7 d相比差异显著(P < 0.05).治疗组造模后各时间点基质金属蛋白酶9的表达低于脑出血组(P < 0.05).结论:重组粒细胞集落刺激因子动员骨髓干细胞能下调脑出血后血肿周边组织基质金属蛋白酶9的表达,并减轻脑水肿的程度.     

重组人粒细胞集落刺激因子动员急性心肌缺血大鼠自体骨髓干细胞归巢缺血心肌的短期安全性评价

背景:骨髓中存在多潜能干细胞,利用其多向分化和归巢的能力,已成为近年来多种疾病治疗的研究方向.目的:观察重组人粒细胞集落刺激因子动员急性心肌梗死大鼠骨髓干细胞归巢于缺血心肌的高度选择性,并评价其短期安全性.设计、时间及地点:随机对照动物实验,于2006-09/2007-04在占林大学基础医学院病理生理实验室完成.材料:选取清洁级SD大鼠82只,雌雄各半,体质量250～300g,62只大鼠结扎冠状动脉前降支制成急性心肌梗死模型,20只作为假手术组.方法:造模成功41只,分为模型组(n=20)和动员组(n=21).模型组:皮下注射生理盐水2mL/d,连续7d:动员组:皮下注射生理盐水稀释至浓度2.5 mg/L重组人粒细胞集落刺激因子15 μg/(kg·d),连续7 d.假手术组:在相应冠状动脉结扎部位穿线,不结扎,其余操作步骤相同,皮下注射生理盐水2 mL/d,连续7 d.主要观察指标:1周后计数3组大鼠外周血白细胞及单个核细胞百分比,4周后比较3组大鼠存体心功能.并取大鼠心脏、肺脏、肝脏、骨骼肌组织制切片行苏木精-伊红染色及CD34免疫组织化学染色观察心脏组织病理改变,毛细血管密度和CD34+细胞归巢情况.结果:①造模1周后动员组大鼠的外周血白细胞及单个核细胞百分比较动员前明显增加(P＜0.05),且动员组大鼠的外周血白细胞计数及微核细胞率明显高于模型组(P＜0.05).⑦造模1周时.动员组较模犁组大鼠心肌梗死区可见较多CD34+细胞(P＜0.05);4周时,动员组和模型组均末见CD34+细胞.各组大鼠肝脏、肺脏及骨骼肌各个时段则均无明显差异.造模后4周,动员组心功能各项指标均优于模型组(P＜0.05),梗死面积明显小于模型组(P＜0.05),毛细血管密度明显高于模型组(P＜0.05).结论:重组人粒细胞集落刺激因子动员心肌梗死后大鼠自体骨髓十细胞到外周血循环并归巢于梗死心肌,并可分化成心肌样细胞及毛细血管内皮细胞,减少心肌梗死范围,改善心功能.短期观察重组人粒细胞集落刺激因子对肺脏、肝脏、骨骼肌无明显组织学影响.     

粒细胞集落刺激因子动员对大鼠内皮祖细胞体外扩增的影响

背景:内皮祖细胞在缺血性疾病治疗应用中存在数量低的问题,许多细胞因子影响其动员效果和功能。目的:观察粒细胞集落刺激因子动员对体外扩增骨髓源性内皮祖细胞数量及功能的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-08/2008-03在北京大学人民医院肝病研究所完成。材料:SPF级健康成年SD雄性大鼠16只,随机分为动员组和对照组,8只/组。重组人粒细胞集落刺激因子为麒麟鲲鹏生物药业有限公司产品。方法:实验前动员组大鼠皮下注射经生理盐水稀释的重组人粒细胞集落刺激因子10μg/kg,2次/d,共5d。采用密度梯度离心法分别从两组大鼠骨髓获取单个核细胞,洗涤后按2×107/孔接种在包被大鼠纤连蛋白的6孔板上,采用贴壁法纯化得到内皮祖细胞。主要观察指标:骨髓单个核细胞集落数及细胞表型,骨髓源性内皮祖细胞贴壁情况及细胞表型,通过DiI-acLDL摄取、体外血管生成进行内皮祖细胞功能学鉴定,透射电镜观察细胞超微结构。结果:与对照组比较,动员组骨髓单个核细胞集落增多,CD45 /CD34 、CD133 和Flk-1 阳性率均明显升高(F=5.655~61.892,P<0.05)。培养第7,9天与对照组比较,动员组骨髓源性内皮祖细胞贴壁数、CD45 /CD34 、CD133 和Flk-1 阳性率均明显升高(F=5.694~38.879,P<0.05)。贴壁细胞F1TC-UEA-1/Dil-acLDL双荧光染色阳性率为90%,接种于Matrigel包被的培养板24h后形成毛细血管索样结构,胞质内有Weibel-Palade小体存在。结论:粒细胞集落刺激因子动员能增加骨髓源性内皮祖细胞的数量,并促进其分化、增殖功能。     

不同时间自体骨髓动员急性缺血心肌的血管再生

背景：正常组织在损伤后可动员骨髓干细胞至损伤组织,在局部微环境作用下定向增殖分化修复组织。目的：应用集落刺激因子动员猪急性心肌梗死模型,观察骨髓动员对猪急性心肌梗死模型的心功能影响及新生血管的作用。方法：健康太湖梅山猪15头,明胶海绵栓塞冠状动脉（左前降支）法建立猪缺血性心脏病-心肌梗死模型,随机分为3组。对照组建模后4周后经冠状动脉注射DMEM;立即动员组建模后3h并连续5d注射粒细胞集落刺激因子;1周动员组：建模1周后连续5d注射粒细胞集落刺激因子。结果与结论：与对照组相比,立即动员组和1周动员组射血分数、左室舒张期内径、左心室收缩期内径心功能指标均有改善。骨髓动员后,两组血清血管内皮生长因子水平上升明显,血管密度明显增加,对照组无明显变化。提示自体骨髓干细胞动员后可归巢到心肌受损区域,在局部环境诱导下可分化成原始的血管结构,参与缺血区的血管形成。     

大鼠心肌梗死后心肌炎症与骨髓干细胞归巢于缺血心肌的关系

目的:分析大鼠急性心肌梗死后心肌组织炎症与骨髓干细胞归巢于缺血心肌的关系。方法:实验于2005-05在西安交通大学动物实验中心完成。①选取清洁级健康雄性SD大鼠128只,取8只大鼠作为正常对照组,剩余120只大鼠随机数字表法分为单纯粒单细胞集落刺激因子组、地塞米松干预组、假手术组,40只/组。②单纯粒单细胞集落刺激因子组、地塞米松干预组建立急性心肌梗死模型,假手术组在左前降支挂线不结扎,正常对照组不进行任何手术。③单纯粒单细胞集落刺激因子组、地塞米松干预组、假手术组大鼠于造模前连续5d皮下注射粒单细胞集落刺激因子50μg/(kg·d)。地塞米松干预组于造模后1h一次性给予地塞米松500μg/kg肌注。④各组大鼠于造模后1,3,5,10d免疫组化观察心肌组织中ckit阳性细胞数及肿瘤坏死因子的表达。造模后28d进行梗死灶组织形态学观察。结果:128只SD大鼠全部进入结果分析。①术后28d各组心肌梗死灶组织形态学观察结果:单纯粒单细胞集落刺激因子组心内膜下有完整的心肌结构,心肌细胞排列整齐,中层由从梗死区边缘伸向斑痕区的心肌组织和结缔组织组成;地塞米松干预组心内膜下仅有散在的心肌细胞,心内膜与心外膜之间的结缔组织稀薄,中层未见有心肌组织;假手术组心脏结构完整未见瘢痕组织。②术后不同时间点各组ckit多克隆抗体特异性免疫组化染色结果:术后1,3,5d各时相点,以单纯粒单细胞集落刺激因子组ckit 细胞密度最大,地塞米松干预组ckit 细胞明显受到抑制(P<0.01);术后10d两组梗死区周边均未发现ckit 细胞。假手术组术后各时间点均未见ckit 细胞。③术后不同时间点各组肿瘤坏死因子的表达情况:地塞米松干预组术后1,3,5,10d各时间点肿瘤坏死因子表达均显著低于单纯粒单细胞集落刺激因子组(P<0.01),而假手术组未发现有肿瘤坏死因子表达。结论:心肌损伤后的炎症反应是骨髓干细胞归巢的先决条件,炎症抑制后限制了骨髓干细胞归巢。提示骨髓干细胞归巢于缺血心肌是机体潜在的修复机能。     

粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞原位移植治疗大鼠缺血性脑梗死

背景：粒细胞集落刺激因子是骨髓造血干细胞的强有力的动员剂，已经证实粒细胞集落刺激因子具有同时动员造血干细胞和间充质干细胞的能力。 目的：观察应用粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞进入脑梗死部位，对缺血性脑梗死大鼠的治疗作用。 设计：随机分组设计、动物实验。 单位：中山大学干细胞与组织工程中心。 材料：实验于2004-09／2005-01在中山大学（北校区）动物实验部和中山大学干细胞与组织工程中心完成。选择雄性Wistar大鼠200只，随机分为自体骨髓干细胞移植组和对照组，每组100只。 方法：两组均用线栓法制作大鼠缺血脑梗死模型。自体骨髓干细胞移植组于复制缺血脑梗死模型后lh腹腔注射重组人粒细胞集落刺激因子（60μg／kg）。对照组于术后lh腹腔注射等量生理盐水。①术前及术后24h，48h，1周测各组大鼠的体质量，计算体质量减轻率；并对大鼠进行神经病学分级。分级标准：0级：正常；1级：对侧前肢屈曲2级：提尾时，对侧前肢抓力减弱；3级：自主运动无方向性，提尾时向对侧旋转．4级：自主运动时，向对侧旋转。②将两组大鼠各取15只，分别于术后24，48h和l周开颅取脑，用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积、苏木精一伊红染色检查脑组织病理变化、免疫组织化学检测CD34阳性细胞浸润情况。 主要观察指标：体质量减轻率，神经病学分级，脑梗死体积，脑组织病理变化，CD34阳性细胞浸润情况。 结果：纳入动物200只，造模成功180只，造模后1-7d死亡48只，存活132只，随机选择120只进入结果分析。①体质量测定、神经病学分级：术后24h，48h两组大鼠体质量减轻率比较差异无显著性（P〈0．05）；术后l周自体骨髓干细胞移植组体质量减轻率显著低于对照组，差异显著[分别为（10．5&;#177;8．2）％，（17．8&;#177;7．1）％，P〈0．05]。自体骨髓干细胞移植组的神经损伤与对照组比较差异无显著性。②梗死灶体积：对照组梗死灶体积和梗死灶体积占全脑体积百分比高于自体骨髓干细胞移植组，差异显著[分别为（251．69&;#177;52．77），（145.72&;#177;28．05）mm^3，（17.00&;#177;2.69）%，（9.90&;#177;1.62）％，P〈0．01]。③病理学改变：术后24h，两组大鼠均出现典型的脑缺血梗死病理变化，自体骨髓干细胞移植组大鼠的梗死区可见少量单个核细胞，而对照组则无。术后48h神经细胞大片消失，胶质细胞变性，自体骨髓干细胞移植组有大量单个核细胞浸润，对照组相对较少。l周后对照组梗死区脑组织液化变软，坏死灶周围可见较多的单核和淋巴细胞浸澜；自体骨髓干细胞移植组大鼠部分坏死灶被新生毛细血管和胶质细胞增生修复，炎性细胞浸润不明显。④免疫组织化学检查：术后24h，自体骨髓干细胞移植组大鼠的手术侧脑组织中检测到CD34阳性的单个核细胞，对侧脑组织及对照组大鼠的脑组织无此类细胞。术后48h，自体骨髓干细胞移植组手术侧脑组织除有CD34阳性单个核细胞浸润，还发现呈锥形并且带有突起的CD34阳性细胞。对侧脑组织、对照组大鼠的脑组织均未见CD34阳性细胞。 结论：粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞进行自体干细胞原位移植治疗，可以减轻大鼠缺血性脑梗死程度，减少脑梗死体积。     

骨髓干细胞动员疗法对心肌梗死大鼠心脏的促血管生成作用

目的探讨干细胞动员疗法对心肌梗死大鼠冠脉新生血管形成的影响及其作用机制。方法结扎Wistar大鼠左冠状动脉制作急性心肌梗死模型，应用粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞释放并归巢于缺血心肌，建模后第24h、48h和4周时处死大鼠，取出心脏，HE染色检测梗死面积，免疫组化方法观察心肌梗死灶、边缘区和正常心肌组织CD34^＋胞、血管内皮生长因子（VEGF）及其受体（Flk—1）的表达以及Ⅷ因子表达。结果使用干细胞动员剂后，动员组大鼠心肌梗死区可见CD34^＋浸润，心肌梗死面积明显减小，梗死灶及周围组织中微血管密度、VEGF及其受体的表达量均明显高于AMI组及假手术对照组。结论骨髓干细胞动员疗法在大鼠AMI模型中，通过动员骨髓干细胞归巢于梗死灶内，有效促进微血管形成；通过上调VEGF和VEGF受体Flk-1的表达，促进血管再生，促进缺血心脏功能恢复。     

短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子对小鼠外周血造血干细胞的动员作用

背景:外周血造血干细胞用于损伤组织的修复及再生需要快速有效的动员方法.常规的动员方案多采用重组人粒细胞-集落刺激因子或大剂量化疗联合重组人粒细胞-集落刺激因子,该方案耗时长、程序复杂.目的:对常规的外周血造血干细胞动员方案进行改进,观察短程高剂量重组人粒细胞-集落刺激因子动员KM小鼠外周血造血干细胞的效果.设计、时间及地点:于2006-09/2007-03在大连医科大学附属第二医院血液科实验室开展的随机对照动物实验.材料:雄性8周龄KM小鼠24只,以给药方式分为3组;常规给药组、短程高剂量给药组、生理盐水对照组.方法:常规给药组,皮下注射重组人粒细胞-集落刺激因子.0.2μg次,2次/d,共6d;短程高剂量给药组,前4d注射等量生理盐水,后2d皮下注射重组人粒细胞-集落刺激因子.2.5μg次,2次/d;生理盐水对照组,每日注射等量生理盐水,共6d.主要观察指标:各组小鼠外周血白细胞计数、粒-巨核细胞集落数.结果:常规剂量组及短程大剂量组小鼠外周血白细胞迅速增高,对照组无明显变化.粒-巨核细胞集落培养7d后,常规剂量组和短程高剂量组的粒-巨核细胞集落计数较对照组显著升高达50倍以上(P<0.01),常规剂量组和短程高剂量组两组间比较差异无显著性意义(P0.05).结论:短程高剂鼠重组人粒细胞-集落刺激因子动员小鼠外周血造血干细胞,有着良好的可行性及有效性,是对小鼠外周血造血干细胞动员模型的成功改进     

粒细胞集落刺激因子与干细胞因子合用对急性心肌梗死模型大鼠心功能的影响

背景:骨髓干细胞动员以其无创伤、无免疫排斥反应,不需要干细胞提取、培养、扩增等工作倍受青睐。目的:观察联合应用粒细胞集落刺激因子和干细胞因子对大鼠急性心肌梗死的治疗作用。设计:随机对照观察。单位:锦州医学院药理教研室实验室。材料:选用32只成年雄性SD大鼠,体质量(200±20)g,购自锦州医学院实验动物中心。重组人粒细胞集落刺激因子(北京双鹭制药),重组人干细胞因子(成都地奥有限公司)。方法:实验于2005-07/11在锦州医学院药理教研室实验室进行。①5mg/kg盐酸异丙基肾上腺素左下腹腔注射复制急性心肌梗死模型,3h后将大鼠随机分为4组,每组8只。综合治疗组:用生理盐水稀释浓度至10mg/L的重组人粒细胞集落刺激因子1mL/kg和重组人干细胞因子1mL/kg皮下注射,连续5d。粒细胞集落刺激因子组:单用生理盐水稀释浓度至10mg/L的rhG-CSF1mL/kg皮下注射,每只大鼠和综合治疗组大鼠注射药品差量用生理盐水(1mL/kg)补足,连续5d。干细胞因子组:单用生理盐水稀释浓度至10mg/L的人干细胞因子1mL/kg皮下注射,每只大鼠和综合治疗组大鼠注射药品差量用生理盐水(1mL/kg)补足,连续5d。对照组:单用生理盐水(2mL/kg)皮下注射。②分别于造模后第14d和28d,摸球法从每组大鼠中抽取4只麻醉,自左心室心尖部插入内充肝素钠的塑料管至左心腔,用Medlab-u18c生物信号采集处理系统描记左心室峰压,左心室舒张末压,左室内压最大上升/下降速度,并同步记录心率。拔出气管插管,立即剪掉心脏,剪掉心房及右心室,微量天平称重,计算左心室质量/体质量,评估心肌重塑情况,将组织块切片,光镜下观测大鼠心肌病理形态及梗死面积。采用细胞图像分析仪病理图文分析每组大鼠心肌梗死面积。主要观察指标:各组大鼠左心功能指标、心肌梗死面积、心率和心室重塑情况及大鼠心肌病理形态。结果:纳入大鼠32只全部进入结果分析,无脱落。①大鼠左心功能指标比较结果:综合治疗组大鼠造模14,28d后左心室收缩压、左心室舒张末压、左心室内压最大上升/下降速度高于其他3组,造模28d时上述各指标均高于14d,差异有统计学意义(P<0.05),粒细胞集落刺激因子组两时间点上述指标均大于干细胞因子组及对照组(P<0.05)。②大鼠两时间点心肌梗死面积、心率和心室重塑情况:综合治疗组大鼠造模14,28d后心肌梗死面积及左心室重量小于其他3组,造模后28d心肌梗死面积小于14d(P<0.05),粒细胞集落刺激因子组两时间点上述指标均小于干细胞因子组与对照组。③大鼠心肌病理形态改变:造模后14及28d,综合治疗组和粒细胞集落刺激因子组均未见明显心肌瘢痕组织,有新生毛细血管生长,粒细胞集落刺激因子组毛细血管密度小于综合治疗组,均有成纤维细胞浸润。干细胞因子组和对照组可见瘢痕组织呈散在的灶性分布,有成堆或散在分布的淋巴细胞,其核小、深染、胞浆少,细胞间胞浆融合,新生肉芽组织增生不明显。结论:粒细胞集落刺激因子和干细胞因子合用对急性心肌梗死大鼠缺血损伤心肌的保护和再生作用优于单用,可改善急性心肌梗死大鼠的心室功能。     

骨髓干细胞动员与缺血心肌血管再生

目的:探讨动员急性心肌梗死大鼠骨髓干细胞归巢于梗死心肌后实现血管再生的能力。方法:实验选用10～12周龄的雄性Wistar(清洁级)大鼠60只,随机分为3组:急性心肌梗死+动员组、急性心肌梗死组及对照组,每组20只。结扎Wistar大鼠左冠状动脉制作心肌梗死模型,用骨髓干细胞动员剂粒细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞释放并归巢于心肌梗死灶,于造模后24,48h和4周杀死大鼠,取出心脏,通过免疫组化方法观察心肌梗死灶、边缘区和正常心肌组织CD34阳性细胞、血管内皮生长因子及其受体的表达,以及VIII因子表达,并应用流式细胞术比较动员前后外周血中CD34阳性细胞数量的变化。结果:急性心肌梗死+动员组大鼠造模24h,4周后外周血CD34细胞数量分别为(0.919±0.187)%,(0.834±0.110)%,明显高于造模前犤(0.043±0.023)%犦及心肌梗死组大鼠造模24h,4周后犤(0.071±0.104)%,(0.062±0.296)%犦(t=2.697,2.354,2.492,2.195,P<0.05)。急性心肌梗死+动员组大鼠心肌梗死区可见CD34阳性细胞浸润;制模后4周,急性心肌梗死+动员组微血管新生数明显多于急性心肌梗死组和对照组(t=3.125,3.308,P<0.01)。急性心肌梗死+动员组大鼠梗死灶及周围组织中血管内皮生长因子及其受体的表达量均明显高于急性心肌梗死组及假手术组(t=2.099～3.398,P<0.05)。结论:骨髓干细胞动员的方法在大鼠急性心肌梗死模型中,能通过动员内皮干细胞归巢于梗死灶内,有效促进微血管形成;还通过上调血管内皮生长因子及其受体的表达,促进血管再生,促进缺血心脏功能恢复。     

外科手术联合自体骨髓干细胞动员治疗大鼠脑缺血

背景:研究表明干细胞治疗能够促进脑功能恢复,联合外科干预能更有效地改善预后。目的:分析外科手术联合自体骨髓干细胞动员治疗脑缺血的疗效和机制。方法:用线栓法制作SD大鼠脑缺血模型后随机分为4组:对照组不干预,其他3组分别行外科手术、重组人粒细胞集落刺激因子和粒/巨噬细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞治疗或联合治疗。结果与结论:外科手术联合自体骨髓干细胞动员组大鼠的神经功能缺损评分、缺血坏死面积和细胞凋亡数明显低于对照组、外科手术组和自体骨髓干细胞动员组(P<0.01);BrdU、BDNF阳性细胞数、微血管数较其他组明显增多(P<0.05)。结果显示外科手术联合自体骨髓干细胞动员可减少大鼠脑梗死面积,抗细胞凋亡,促进神经再生和修复,改善脑功能。     

骨髓干细胞动员对心肌梗死大鼠心功能的影响

目的 探讨应用粒细胞集落刺激因子(G—CSF)动员大鼠自体骨髓干细胞治疗心肌梗死对心功能的影响及其可能机制。方法 用异丙肾上腺素(ISO)制作大鼠心肌梗死模型，用骨髓干细胞动员剂G—CSF动员自体骨髓干细胞释放和迁移至心肌梗死灶，于用ISO后24、48h杀死大鼠，取出心脏；用ISO后4周，先用NPA—V多导生理仪检测大鼠血流动力学、心功能指标，随后杀死大鼠，取出心脏，通过免疫组化、HE染色和VG染色方法观察大鼠心梗灶的CD34^ 细胞的浸润及心肌再生、心肌纤维化的情况。结果 用ISO后4周，G—CSF动员组大鼠血流动力学指标、心功能参数均比对照组改善。用ISO后24h，动员组大鼠心梗区可见CD34^ 细胞浸润，并有CD34^ 阳性的新生心肌细胞生长，4周后瘢痕组织少，心肌纤维化程度轻，心肌基本结构得到保护。结论 急性心梗发生后，应用G—CSF动员自体骨髓干细胞向心梗灶内迁移、存活和向心肌细胞、血管内皮细胞等分化；并通过心肌再生、抑制缺血心肌纤维化和保护缺血心肌基本结构而改善心功能。     

大鼠心肌梗死后心肌炎症与骨髓干细胞归巢于缺血心肌的关系

目的：分析大鼠急性心肌梗死后心肌组织炎症与骨髓干细胞归巢于缺血心肌的关系。 方法：实验于2005—05在西安交通大学动物实验中心完成。①选取清洁级健康雄性SD大鼠128只，取8只大鼠作为正常对照组，剩余120只大鼠随机数字表法分为单纯粒单细胞集落刺激因子组、地塞米松干预组、假手术组，40只／组。②单纯粒单细胞集落刺激因子组、地塞米松干预组建立急性心肌梗死模型，假手术组在左前降支挂线不结扎，正常对照组不进行任何手术。③单纯粒单细胞集落刺激因子组、地塞米松干预组、假手术组大鼠于造模前连续5d皮下注射粒单细胞集落刺激因子50μg／（kg&;#183;d）。地塞米松干预组于造模后1h一次性给予地塞米松500μs／kg肌注。④各组大鼠于造模后1，3，5，10d免疫组化观察心肌组织中ckit阳性细胞数及肿瘤坏死因子的表达。造模后28d进行梗死灶组织形态学观察。 结果：128只SD大鼠全部进入结果分析。①术后28d各组心肌梗死灶组织形态学观察结果：单纯粒单细胞集落刺激因子组心内膜下有完整的心肌结构，心肌细胞排列整齐，中层由从梗死区边缘伸向斑痕区的心肌组织和结缔组织组成；地塞米松干预组心内膜下仅有散在的心肌细胞，心内膜与心外膜之间的结缔组织稀薄，中层未见有心肌组织；假手术组心脏结构完整未见瘢痕组织。②术后不同时间点各组ckit多克隆抗体特异性免疫组化染色结果：术后1，3，5d各时相点，以单纯粒单细胞集落刺激因子组ckit^＋细胞密度最大，地塞米松干预组ckit^＋细胞明显受到抑制（P〈0．01）；术后10d两组梗死区周边均未发现ckit^＋细胞。假手术组术后各时间点均未见ckit^＋细胞。③术后不同时间点各组肿瘤坏死因子的表达情况：地塞米松干预组术后1，3，5，10d各时间点肿瘤坏死因子表达均显著低于单纯粒单细胞集落刺激因子组（P〈0．01），而假手术组未发现有肿瘤坏死因子表达。 结论：心肌损伤后的炎症反应是骨髓干细胞归巢的先决条件，炎症抑制后限制了骨髓干细胞归巢。提示骨髓干细胞归巢于缺血心肌是机体潜在的修复机能。     

外科手术联合自体骨髓干细胞动员治疗大鼠脑缺血

背景：研究表明干细胞治疗能够促进脑功能恢复,联合外科干预能更有效地改善预后。目的：分析外科手术联合自体骨髓干细胞动员治疗脑缺血的疗效和机制。方法：用线栓法制作SD大鼠脑缺血模型后随机分为4组：对照组不干预,其他3组分别行外科手术、重组人粒细胞集落刺激因子和粒/巨噬细胞集落刺激因子动员自体骨髓干细胞治疗或联合治疗。结果与结论：外科手术联合自体骨髓干细胞动员组大鼠的神经功能缺损评分、缺血坏死面积和细胞凋亡数明显低于对照组、外科手术组和自体骨髓干细胞动员组（P〈0.01）;BrdU、BDNF阳性细胞数、微血管数较其他组明显增多（P〈0.05）。结果显示外科手术联合自体骨髓干细胞动员可减少大鼠脑梗死面积,抗细胞凋亡,促进神经再生和修复,改善脑功能。     

粒细胞集落刺激因子对骨髓极小胚胎样干细胞的动员和募集

背景:极小胚胎样干细胞(very small embryonic-like stem cells,VSEL-SCs)是一种非造血干细胞,具有类似胚胎干细胞的生物学特性。目前,心肌梗死后 VSEL-SCs 的研究较多,而急性脑梗死后 VSEL-SCs 的动员及其修复受损组织的研究在国内外报道尚少。目的:观察小鼠急性脑梗死后粒细胞集落刺激因子对骨髓来源的 VSEL-SCs 动员、募集及其作用机制。方法:线栓法制备小鼠大脑中动脉栓塞模型,腹腔内分别注射粒细胞集落刺激因子和生理盐水,观察术后神经功能评分,流式细胞分析计数动员到外周血中的 VSEL-SCs 数量;ELISA 方法分析术后血浆及缺血侧脑组织中基质细胞衍生因子 1 水平的动态变化,免疫组化观察缺血边缘带的基质细胞衍生因子 1 阳性细胞表达。结果与结论:与生理盐水组相比,术后 108 h 粒细胞集落刺激因子组造模后神经功能评分明显降低(P < 0.05);术后 72,108 h粒细胞集落刺激因子组动员到外周血的 VSEL-SCs 含量高于生理盐水组(P < 0.05);粒细胞集落刺激因子组血浆和脑组织中基质细胞衍生因子 1 水平高于生理盐水组(P < 0.05),血浆基质细胞衍生因子 1 水平与动员到外周血的 VSEL-SCs 数量成正相关;脑组织免疫组化中,粒细胞集落刺激因子组基质细胞衍生因子 1 阳性细胞多于生理盐水组。结果显示粒细胞集落刺激因子能使更多的 VSEL-SCs 从骨髓动员到外周血中,粒细胞集落刺激因子对缺血脑组织的保护作用,可能在于其能够使缺血边缘带的基质细胞衍生因子 1 表达增加,并通过 CXCR4/SDF-1 轴的趋化作用,使募集到梗死区域的 CXCR4+细胞增多来实现的。