CD4+CD25+调节性T细胞在慢性乙型肝炎患者免疫发病机制中的作用

目的:探探讨CD4~ CD25~ 调节性T细胞(regulatory T Cell,Treg)在慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者免疫发病机制中的作用以及其可能在治疗中的应用前景.方法:收集未经抗病毒治疗的CHB患者34例和健康对照18例外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)标本,以三色/四色流式分析法对PBMC中CD4~ CD25~ Treg的频率及表面分子表达进行分析,并同时通过磁珠分选去除CHB患者PBMC中的CD4~ CD25~ Treg,分别以MHC-肽-五聚体法和酶联斑点计数法(enzyme-linked immunospot assay,Elispot)检测HBV core18-27抗原肽刺激的对HBV特异性的CTL(cytotoxic T lymphocyte)频率的升高以及IFN-γ的分泌.结果:CHB患者外周血中CD4~ CD25~ CD45RO~ CTLA4~ T细胞群以及CD4~ CD127~(lo)CD25~(hi-int)T细胞群所占CD4~ T细胞群的比例与健康对照相比均明显上升(3.78%±1.87%.4.40%±2.11%vs 1.58%±0.76%,2.11%±1.26%;t=4.86,t=5.96;P<0.01)去除CHB患者中CD4~ CD25~ Treg后,特异性CTL的频率以及其分泌IFN-γ的频数与未去除组比出现显著上调(0.94%±0.38%,26±13 vs 0.20%±0.18%,119±30;t=5.25,t= 9.886;P<0.01).结论:CHB患者循环中增多的Treg可能参与抑制抗HBV的免疫应答抑制,去除Treg以及联合病毒抗原肽刺激的进一步研究可能为CHB的免疫治疗提供新的思路.     

大鼠部分肝移植后自体骨髓干细胞动员的研究

目的 探讨大鼠部分肝移植后骨髓干细胞动员的情况。方法 建立大鼠性别交叉部分肝移植模型，分为部分肝移植组、全肝移植组和假手术组，分别与术后1、3、5、7d取标本。用流式细胞法检测骨髓中干细胞标记的细胞群体的数量变化，荧光原位杂交检测移植肝脏内Y染色体特异的Sry基因的表达，免疫组织化学法检测移植肝脏内干细胞标志CD34，c—kit和Thy-1．1的表达。结果 与全肝移植组相比，部分肝移植组术后第1天，骨髓细胞中，β2微球蛋白（β2m）／Thy-1．1^＋，CD45^＋／CD34^＋有不同程度的升高，然后呈递减趋势。免疫组织化学检测汇管区和炎性灶周围可见CD34、c—kit和Thy-1．1单个核细胞表达，并于第5至7天后减少。同时免疫组织化学双染可检出CD34^＋／CD45^＋细胞。全肝移植组汇管区CD34、c—kit和Thy-1．1表达较少，假手术组CD34、c-kit和Thy-1．1偶见表达。在部分肝移植物可检出Sry^＋细胞，但Srg^＋／CD34^＋，Sry^＋／Thy-1．1^＋细胞较少。全肝移植组Sry^＋偶见。结论 部分肝移植中，骨髓源性的干细胞发生动员；同时肝内有干细胞被激活，其中外源性干细胞较少。     

树突状细胞的非特异性免疫功能降低对HBV、HCV清除及细胞毒性T淋巴细胞应答无影响

目的 观察HBV、HCV感染者树突状细胞(DC)的非病毒特异性免疫功能状态与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)免疫应答以及病毒清除的关系。方法 对25例成人慢性HBV和HCV合并感染者进行了间隔8年的两次调查、依据临床转归分为HBV和HCV均清除组(A组)14例、单独HCV清除者(B组)6例，单独HBV消除者(C组)3例，HBV和HCV均未清除者(D组)2例，对照组(N组)为同一地区健康献血员11例。体外分离培养DC，检测其表型及抗原摄取功能、刺激异体淋巴细咆增殖能力和4组感染者的CTL免疫应答情况。结果 B、C、D组与A组、N组比较，DC的非病毒特异性免疫功能降低，表现为CD86表达的降低、刺激异体淋巴细胞增殖的能力下降以及抗原摄取能力降低。A组对HBV和HCV的4条抗原表位多肽均有较高的CTL应签率(11／12)；B组对HCV的两条抗原表位多肽均有应答(5／5)，但无对HBV两条表位多肽均应签者、仅有1例对P2有反应；C组对HBV的抗原表位多肽均有应答，但无对两条HCV表位多肽均应答者；D组及N组对HBV或HCV所有实验多肽均无应答。结论 HBV和HCV的清除与病毒特异性的CTL应答相关。HBV和(或)HCV持续存在可能是导致DC功能异常的原因。     

终末期肝病患者乙型肝炎病毒感染与肝祖细胞激活的关系

目的探讨终末期肝病患者乙型肝炎病毒感染与祖细胞激活和扩增的关系。方法 16例终末期慢性乙型肝炎患者的肝活检标本,以细胞角蛋白(CK7)为标记做免疫组织化学,定量分析祖细胞数目和胆管反应面积的相关性。结果全部患者均从组织学证实为肝硬化,并且炎症反应严重(炎症活动度评分12～17分)。祖细胞数目和胆管反应面积呈显著正相关。血清HBVDNA水平与祖细胞数目和胆管反应面积均显著相关。结论在终末期慢性乙型肝炎患者中,祖细胞的激活和扩增明显,HBV感染可能参与肝祖细胞的激活和扩增。     

转录因子Foxp3在肝癌细胞中的表达及意义

目的研究转录因子Foxp3在肝癌细胞中的表达及其对肿瘤免疫微环境的作用。方法用常规RT-PCR和基因表达谱芯片检测Foxp3在10种肝癌细胞系中的表达,进一步用Western blot、免疫组化和流式细胞术验证其蛋白水平的表达;将表达Foxp3的肿瘤细胞及用Foxp3 shRNA沉默后的肿瘤细胞分别与CD4＋CD2-5T细胞共培养,CFSE评价免疫效应细胞增殖情况。结果 Foxp3在所有的肝癌细胞系中均出现表达;肝癌细胞与CD4＋T细胞进行共培养,可显著抑制共培养体系中CD＋4T细胞增殖及其表面标记的表达;肝癌细胞Foxp3表达沉默后,可显著逆转共培养体系中肝癌细胞对CD4＋T细胞增殖的表达抑制。结论在肝细胞癌（HCC）细胞系及部分HCC患者组织中均发现Foxp3的表达,肝癌细胞Foxp3的表达参与对肿瘤微环境中效应性T细胞增殖的抑制。     

核酸扩增产物的量化酶免疫通用型检测方法

目的以丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）ＲＮＡ（ＲＮＡ）核酸扩增产物的量化酶免疫（ＥＩＡ）通用型检测方法及试剂,以准确评价疗效,指导治疗。方法选择合适的扩增循环数使聚合酶链反应（ＰＣＲ）在“平台期效应”出现前即停止;同时将第２次ＰＣＲ所用的引物进行生物素标记,使扩增产物带有生物素标记成分,再通过固相包被的链霉亲合素进行捕获、氢氧化钠解链变性、荧光素标记的ＨＣＶ特异性探针杂交以及辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的抗荧光素酶标抗体反应后,ＴＭＢ显色测定,通过显色反应颜色的深浅,反映样品中ＨＣＶＲＮＡ模板的情况。结果ＨＣＶＲＮＡ扩增产物的ＥＩＡ检测结果表明：所建立的方法操作简便、重复性好、特异性强、敏感度高、结果判断客观准确,而且可以反映样品中病原体核酸模板量的多少;干扰素治疗期间,ＨＣＶ感染的慢性丙型肝炎患者不同时间系列血的动态检测结果提示,在临床监测治疗、评价疗效上,本方法具有较大的指导意义。结论所建立的方法可以成为一种通用型检测技术,用于量化分析病毒、细菌等致病因子及人类某些基因（如ＨＬＡＢ２７）的核酸扩增产物的研究,具有广阔的应用前景。     

MAGE-3抗原肽体外诱导肝癌患者免疫应答的研究

目的：利用载有MAGE－3抗原肽的树突状细胞（DC）活化原发性肝细胞癌（HCC）患者T淋巴细胞，探讨是否可以体外诱导特异性细胞毒T细胞细胞（CTL）应答。方法：通过逆转录多聚酶链反应和测序分析MAGE－3多肽表位密集区的核苷酸变异状况，体外培养HLA－A2表型的HCC患者及正常献血员外周血来源DC，并经孵育携带MAGE－3／HLA－A2抗原肽FLWG－PRALV，用以活化T淋巴细胞，利用特异性杀伤实验检测CTL应答。结果：中国HCC患者表达的MAGE－3序列高度保守。用特定细胞因子和无血清培养基可成功培养HCC患者外周血精源的DC。经多肽冲击的DC诱导，3例HCC例者和3例正常献血员可成功培养HCC患者外周血来源的DC。经多肽冲击的DC诱导，3例HCC患者的3例正常献血员中各有2例产生CTL免疫应答。结论：载有MAGE－3抗原肽的DC可以体外诱导特异性的CTL免疫应答。提示HLA－A2限制性的MAGE－3抗原肽经DC递呈可以作为有潜力的肝癌免疫治疗疫苗。     

5-杂氮-2′-脱氧胞苷诱导肝癌细胞株癌/睾丸抗原基因表达的研究

目的探讨使用5杂氮2′脱氧胞苷(5DC)诱导肝癌细胞株癌/睾丸抗原(cancer/testis,CT)基因的可行性。方法使用5DC处理前后,用RTPCR方法检测肝癌细胞株QGY7703、HepG2215、HepG2、SMMC7721、HLE、BEL7402、Huh7、BEL7404中CT抗原基因MAGEA1、A3、A6和A10表达;Southern杂交检测细胞株基因组DNA去甲基化状态。结果CT抗原家族中MAGEA1在QGY7703、SMMC7721、BEL7402、HLE、BEL7404中表达,MAGEA3在HepG2、HLE中表达,MAGEA4和MAGEA10表达均为阴性,而MAGEA6表达均为阳性;使用5DC后,MAGEA4在QGY7703、HLE中出现表达,MAGEA10在HepG2和HLE出现表达。去甲基化后基因组DNA相对去甲基化程度明显升高(t=-4.966,P<0.01)。结论尽管5DC使肝癌细胞株基因组去甲基化程度明显升高,但不能有效地诱导CT抗原基因广泛表达。     

慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞诱导特异性T淋巴细胞应答

目的 探讨慢性乙型肝炎患者外周血树突状细胞(Dc)是否诱导特异性T细胞应答。方法(1)将研究对象分为慢性乙型肝炎患者组、急性乙型肝炎痊愈组、健康志愿者组,分离各组研究对象的外周血单个核细胞(PBMC),细胞内细胞因子染色方法检测其对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)特异表位多肽乙型肝炎病毒核心抗原(HBcAg)18-27的记忆性免疫应答;(2)培养慢性乙型肝炎患者DC,将负载有乙型肝炎抗原表位多肽的DC诱导特异的T细胞应答。采用细胞内细胞因子染色方法检测诱导的T细胞分泌的细胞因子,乳酸脱氢酶释放法测定诱导的T细胞杀伤活性。结果(1)急性乙型肝炎患者PBMC对HBcAg 18-27 CTL特异表位多肽存在记忆的免疫应答,其分泌干扰素-γ的CD8+T细胞占CD8+T细胞总数的(4.3±2.5)％,分泌白细胞介素-2的占总细胞数的(4.8±2.2)％,分泌肿瘤坏死因子-α占总细胞数的(4.6±2.3)％。而慢性乙型肝炎患者和健康志愿者对其记忆应答很低,与急性乙型肝炎患者比较差异有显著性,t值为2.508-3.305,P<0.05。(2)用多肽共孵育过的慢性乙型肝炎患者DC多次诱导的T细胞慢性乙型肝炎患者组,加肽孵育的靶细胞比例为30:1、10:1、3:1时,其杀伤率分别为(57.0±20.3)％、(49.5±20.2)％、(21.8±12.9)％,均高于对照组,表明慢性乙型肝炎患者DC可以诱导特异的T     

神经胶质成熟因子β对肝星状细胞活化和肝纤维化的影响

目的了解IFN β-1a抑制肝星状细胞活化新的作用分子，并进一步验证该分子与HSC活化和肝纤维化的关系。方法LX-2细胞经2000U／ml IFN β-1a处理48h后，采用二维电泳技术对IFN β-1a处理和未处理的LX-2细胞蛋白质进行分离，质谱鉴定IFN β-1a处理前后LX-2细胞中差异表达超过2倍的蛋白点。对于鉴定出的差异表达分子，通过Western blot和RT-PCR方法验证其在LX-2细胞中、肝组织中以及肺、脑、脾、肾、心组织中的表达情况。结果与对照组相比，IFN—β-1a处理组LX-2细胞中有31个差异蛋白点，其中1个特异表达、5个上调表达、25个下调表达。其中特异表达的蛋白经鉴定为神经胶质成熟因子β（GMFβ）；表达上调的5个点鉴定出2种蛋白，为组蛋白H2A和β-原肌球蛋白；表达下调的25个点鉴定出18种蛋白。进一步对GMFβ的表达情况进行验证发现，与对照组相比，经IFN β-1a作用后的LX-2的GMF β蛋白表达明显（t=1．81，P〈0．01）；大鼠正常肝组织中GMFβ的蛋白和mRNA相对表达量明显高于肝硬化肝组织（蛋白相对表达量为1．81对比0．10，mRNA相对表达量为0．85对比0．12，t值分别为2．53，2．13，P〈0．01）；GMFβ的蛋白和mRNA在大鼠的脑、脾、肝、肾组织中明显表达，而肺、心组织中无表达（t值分别为1．91、1．94，P〈0．01）。结论IFN β-1a处理后的LX-2的蛋白质表达存在差异，这些差异表达的蛋白质可能参与了IFN β-1a对HSC活化的抑制以及HSC的凋亡。IFN β-1a处理后的LX-2以及正常大鼠的肝组织中GMFβ有明显的表达，GMFβ可能抑制HSC的活化以及抑制肝纤维化的进展。