丙型肝炎病毒体外感染Hep G2细胞的研究

目的　建立接近体内自然感染状态并能长期复制的丙型肝炎病毒(HCV)感染细胞模型。方法　用HCVRNA阳性血清感染人肝癌细胞株HepG2 ,培养6 0d ,用套式逆转录聚合酶链反应(nestedRT PCR)检测培养细胞及上清中正、负链HCVRNA。结果　HepG2 在感染后第2～30天,细胞中可以间断检出HCV正链RNA ;负链RNA在感染后第3～30天可以间断检出,检出率与正链RNA接近。在第31～6 0天仍可间断检出HCVRNA正、负链,但检出率逐渐降低。HepG2 培养上清中HCV正链RNA感染后也呈间断阳性,检出率与细胞内正链RNA基本一致。培养上清中均未检出HCV负链RNA。结论　HepG2 细胞对HCV易感,并能支持HCV长期复制,HepG2 细胞是较为理想的HCV体外感染细胞模型。     

RT-PCR检测肝炎和肝癌组织中的HCV复制中间体

应用逆转录聚合酶链反应(RT—PCR)检测11例血清抗HCV阳性的药瘾患者尸检肝组织和10例原发性肝细胞癌(PHC)患者手术切除肝癌组织中HCV基因(正链HCV RNA)和HCV复制中间体(负链HCV RNA)。结果8/11例肝组织和7/10例肝癌组织中正链HCV RNA阳性,其中各有6例负链HCV RNA亦阳性。HCV各基因区的检出率差别较大,5′NC区检出率最高、C区次之、NS区检出率较低。在同例肝(癌)组织中,若负链HCV RNA阳性,则其信号强度与正链基因无明显差别;但未发现肝癌组织中癌细胞分化程度与HCV的检出率有关。上述结果提示HCV感染与肝癌发生有密切关系,HCV的持续复制可能在癌肿形成中起作用。     

丙型肝炎病毒体外感染人肝癌细胞株HepG2的研究

目的：研究人肝癌细胞株HepG2体外对丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV)的易感性。方法：慢性丙型肝炎患者的血清与HepG2共同孵育后，以逆转录－聚合酶链反应、免疫组化法、原位杂交法分别检测细胞和（或）培养上清中的HCV正、负链RNA、HCV抗原表达和HCV RNA在细胞内的定位。结果：感染血清和细胞共同孵育后的第2－40天，从细胞内和培养上清中均可间断地检测出HCV正、负链HCV RNA，HCV NS3抗原在细胞内能稳定表达，原位杂交证实HCV RNA阳性物质多位于细胞质中。结论：HepG2细胞在体外不但对HCV易感，而且可以支持HCV体外复制。     

丙型肝炎病毒体外感染原代人胎肝细胞的研究

目的　研究丙型肝炎病毒 (HCV)体外细胞培养方法。方法　原代人胎肝细胞与HCV感染血清共孵育后 ,用逆转录 聚合酶链反应、原位杂交、免疫组化分别检测细胞和培养上清中的HCVRNA和HCV抗原表达。结果　从感染血清和细胞共同孵育后的 2～ 2 5d ,细胞内和 /或培养上清中可间断检出HCV正、负链RNA ;HCVNS3抗原在细胞内能稳定表达 ;原位杂交显示HCV负链RNA阳性物质多位于细胞浆。结论　原代人胎肝细胞对HCV易感 ,可用作HCV体外感染和复制的靶细胞     

丙型肝炎病毒阳性血清体外感染人肝细胞的研究

目的 研究丙型肝炎病毒(HCV)抗体(Ab)阴性,HCV-RNA阳性血清建立体外感染肝细胞模型.方法 HCV Ab阴性,HCV-RNA阳性的窗口期血清与人肝细胞共同培养,用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、免疫荧光染色、Western blot、共聚焦显微镜和透射电镜等方法检测细胞内HCV核酸复制、蛋白质表达及超微结构改变.结果 细胞与病毒共同培养7～45 d,细胞内和/或培养上清中可间断检出HCV正、负链RNA;细胞浆内有HCV 核心和NS3抗原的表达;细胞超微结构有改变,并于感染后第24天时观察到类似病毒样颗粒.结论 窗口期血清中的HCV能在人肝细胞7701中复制一段时间.     

支持HCV 1b亚基因组复制的细胞模型的建立

目的 建立一个稳定支持中国人群HCV 1b亚基因组高效复制的体外细胞模型。方法 构建中国人群HCV 1b亚型亚基因组复制子质粒，通过体外转录的方法获得亚基因组复制子RNA，采用电穿孔技术把RNA转染到Huh-7.5.1细胞中，经过G418筛选含有HCV 1b亚基因组的细胞集落。RT-PCR检测细胞集落中的HCV亚基因组以及Western blot检测细胞集落中的HCV蛋白的表达。用干扰素（IFN）处理含有HCV亚基因组的细胞，观察细胞中HCV RNA的变化。结果 G418药物筛选得到了支持HCV1b亚基因组复制的细胞集落。RT-PCR 检测有HCV RNA NS4B的表达，Western blot检测有HCV的非结构蛋白NS5B的表达。IFN处理含有HCV复制子的细胞，HCV RNA水平明显降低。结论 成功建立了支持中国人群HCV 1b亚基因组高效复制的体外细胞模型，为进一步研究HCV致病机制、治疗药物筛选及疫苗方面的研究打下了基础。     

丙型肝炎病毒Ⅱ型阳性PBMC永生化细胞株的生物学特性

目的 观察丙型肝炎病人外 因B细胞长期存活状态下其中是否仍有丙型肝炎病毒（HCV）存在,探讨建立HCV体外复制细胞模型的可能性, 方法 利用EB病毒转化B淋巴细胞技术,建立丙型肝炎患者外周血单个核细胞（PBMC）HCV阳性传代细胞株（LCL）,并应用细胞培养、染色体显示、流式细胞荧光染色、逆转录－聚合酶链反应（RT－PCR）、免疫组化、原位RT－PCR及电镜等技术研究其分子生物学和免疫学特性。结果 （1）LCL细胞核型47,XX,＋mar,细胞表面CD19、CD20抗原阳性,CD21分子消失。（2）传代培养细胞中HCV RNA正链持续12个月阳性,而培养上清中则呈间断性阳性,无明显规律。HCV RNA负链在LCL细胞中也呈间断阳性。HCV基因分型为Ⅱ型株。（3）免疫组化、原位PCR和电镜发现HCV抗原蛋白、HCV RNA和病毒颗粒均在于LCL细胞浆中;电镜发现HCV病毒颗料呈圆球型,双层膜结构,定位于细胞胸质空泡内,直径多为45－70nm,个别为110nm。结论 HCV可以在EB病毒转化病人B细胞株中长期存活、复制和分泌。     

肝细胞癌病理学研究的新进展

1 原位PCR检测石蜡包埋肝组织中丙型肝炎病毒 HCV是单股正链RNA病毒,Negro等用原位杂交研究发现HCV共存于人肝组织细胞核及细胞质中,但主要位于胞质中。原位PCR检测肝组织HCV感染的敏感性比原位杂交高40％-50％,血清HCV阳性患者的肝组织检出率高达86％”。尤其对HBsAg阴性的癌旁组织进行检测可使50％原因不明的肝癌得到诊断。存档多年的蜡块也可进行检测。     

长链非编码RNA HOXD-AS1通过RUNX3促进骨肉瘤细胞增殖

目的观察长链非编码RNA HOXD-AS1对骨肉瘤细胞增殖的影响及可能机制。方法应用Western blot与real-time PCR方法检测长链非编码RNA HOXD-AS1与RUNX3在骨肉瘤组织及癌旁组织中的表达,CCK-8法检测过表达长链非编码RNA HOXD-AS1后对骨肉瘤细胞增殖活力的影响以及RUNX3的表达变化,过表达RUNX3后检测长链非编码RNA HOXD-AS1对骨肉瘤细胞增殖活力的影响。结果长链非编码RNA HOXD-AS1在骨肉瘤组织中表达水平高于癌旁正常组织,而RUNX3在骨肉瘤组织中的表达低于癌旁正常组织,过表达长链非编码RNA HOXD-AS1表达后骨肉瘤细胞增殖活力显著增强,RUNX3的表达水平减少,过表达RUNX3后过表达长链非编码RNA HOXD-AS1,长链非编码RNA HOXD-AS1对骨肉瘤细胞的促增殖抑制作用减弱。结论长链非编码RNA HOXD-AS1促进骨肉瘤细胞增殖与RUNX3相关。     

丙型肝炎病毒实验室检测技术的研究进展

丙型肝炎病毒（HCV）是一种主要经血液传播的肝炎病毒,是造成慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌的主要病原之一。HCV属于黄病毒属,为单股正链的RNA病毒,基因组长度约9.6kb,含有单个开放阅读框架（ORF）,编码一个由约3010个氨基酸组成的多聚蛋白。到目前为止,丙型肝炎的实验室检测技术主要有抗-HCV检测、HCVRNA核酸扩增检测、HCV核心抗原的检测三种类型。现就HCV实验室检测的研究现状作一综述,为致病机理的研究及抗HCV药物的开发和疫苗的研制等提供理论依据。     

脊髓灰质炎病毒单链RNA和双链RNA在去核细胞中的不同感染性

脊髓灰质炎病毒在细胞内复制过程中,产生一种复制中间体(replieative form RNA),简称RF。即可能是一个带有基因组的正链和一个互补的负链组成的一个完整的双链RNA分子,这种复制中间体的感染性问题,正在引起人们的注意。一般认为带有单链RNA的病毒粒子对细胞感染     

丙型肝炎病毒核心抗原在静脉吸毒者血清中的检测

目的 调查丙型肝炎病毒核心抗原（HCVcAg）在静脉吸毒者血清中的检出状况。方法 对93例静脉吸毒者血清同时进行HCVcAg、HCV RNA定量、抗HCV IgG、HBsAg检测,分析HCVcAg检出率与HCV RNA定量及合并HBV感染之间的关系。结果 在93例静脉吸毒者中,抗HCV IgG阳性79例,HCV RNA阳性68例,HCVcAg阳性37例。以HCV RNA作比较,HCVcAg检测的特异性和敏感性分别是100％和54％;HCVcAg检出率与HCV RNA载量对数值呈正相关,r=0.958,P=0.010;HCV RNA阳性静脉吸毒者中,HBsAg阳性和HBsAg阴性时HCVcAg的检出率分别为38％和69％,两者比较P＜0.01;2例抗HCV IgG阴性、HCV RNA阳性静脉吸毒者,HCVcAg检测呈阳性。结论 HCVcAg在静脉吸毒者血清中检测其特异性好,而敏感性较差;HCVcAg的检出率与HCV RNA载量的对数呈正相关;在静脉吸毒者,合并HBV感染可能是血清HCVcAg检测的干扰因素,可能是HBV抑制了HCVcAg的表达。     

长链非编码RNA ANRIL对膀胱尿路上皮癌细胞侵袭能力的作用

目的检测膀胱尿路上皮癌(bladder urothelial carcinoma,BUC)中长链非编码RNA Antisense Noncoding RNA在INK4 Locus(ANRIL)基因的表达,研究ANRIL基因对BUC细胞侵袭能力的调控作用。方法实时定量PCR法检测84例BUC组织和T24细胞系中ANRIL基因的表达。统计分析ANRIL基因在BUC组织的表达与BUC临床病理因素的相关性。ANRIL抑制剂(ss-ANRIL)沉默T24细胞中ANRIL的表达,Transwell小室法检测T24细胞的侵袭能力。结果与癌旁正常组织相比,ANRIL基因在BUC组织的表达显著上调。ANRIL基因在T24细胞系中的表达显著高于其在人膀胱上皮永生化细胞系SV-HUC-1中的表达。而且,ANRIL基因在高病理分级、侵袭肌层以及淋巴结转移阳性的BUC组织中的表达更高。转染ss-ANRIL能够显著抑制T24细胞中ANRIL的表达,而ANRIL沉默能够显著抑制T24细胞的侵袭能力。结论长链非编码RNA ANRIL在BUC组织及细胞系中高表达,且于BUC的侵袭转移相关,其表达沉默能够抑制BUC细胞的侵袭能力。     

慢性HCV感染状态与机体细胞免疫功能关系的探讨

目的:探讨慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染患者丙型肝炎病毒RNA(HCV RNA)增殖状态与T细胞亚群功能及血浆中IL-2和slL-2R活性的关系。方法:以间接免疫荧光法,ELISA法和RT-PCR分别检测75名慢性HCV感染患者(其中HCV RNA阳性47例,HCV RNA阴性28例)外周血T细胞亚群,IL-2及sIL-2R的水平和HCV RNA。结果:慢性HCV感染患者周围血CD3~+,CD4~+淋巴细胞亚群,CD4~+/CD8~+比值及IL-2水平均显著低于正常对照组(P<0.01),而sIL-2R明显升高(P<0.01);血清HCV RNA阳性患者T细胞亚群,CD4~+/CD8~+比值及IL-2水平显著低于HCV RNA阴性患者(p<0.01)。结论:慢性HCV感染患者的机体免疫功能紊乱。细胞免疫功能低下,HCV RNA阳性患者较阴性患者更甚,提示细胞免疫功能受抑可能是HCV持续增殖的原因。     

人类免疫缺陷病毒Ⅰ型和丙型肝炎病毒核酸联合检测试剂的评价

目的 了解人类免疫缺陷病毒Ⅰ型（HIV-1）和丙型肝炎病毒（HCV）核酸联合检测试剂检测的敏感性、特异性以及检测中国不同亚型样品的适应性。方法 用酶联免疫试剂对来自于不同地区的HIV感染者或可疑感染者献血员样品进行HIV抗体和HCV抗体检测。对HIV抗体阳性者进行抗体确证。用HIV-1和HCV核酸联合检测试剂对样品进行检测，对初次检测阳性者，用HIV RNA和HCV RNA鉴别试剂单独检测，区分是HIV RNA阳性或是HCV RNA阳性。结果 74份HIV和HCV抗体均阳性的样品，HIV／HCV RNA检测也为阳性，5份HIV和HCV抗体均阴性的样品，HIV／HCV RNA检测也为阴性；84份HIV抗体确证为阳性的样品，有82份检测为HIVRNA阳性，7份HIV抗体阴性的样品检测均为HIV RNA阴性，12份HIV抗体不确定的样品，有6份检测为HIV RNA阳性；81份HCV抗体阳性样品中有70份检测为HCV RNA阳性，22份HCV抗体阴性样品中有18份检测为HCV RNA阴性，4份检测为HCV RNA阳性。结论 该试剂的灵敏度较高，尤其在HCV抗体阴性样品中检出HCV RNA阳性者。因此，可用于献血员筛查，减少窗口期的传播。     

KRTAP5-AS1负调控miR-335对甲状腺癌细胞增殖、迁移及凋亡的影响

目的:探究长链非编码RNA(lncRNA)KRTAP5-AS1是否通过负调控miR-335影响甲状腺癌细胞的增殖、迁移和凋亡.方法:qRT-PCR检测33例甲状腺癌组织中KRTAP5-AS1和miR-335的表达.甲状腺癌细胞SW579分为si-NC组、si-KRTAP5-AS1组、si-KRTAP5-AS1+miR-...     

HCV入胞相关分子及其作用机制的研究进展

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)是一种有包膜的单股正链RNA病毒, 属于黄病毒科丙型肝炎病毒属.包膜病毒感染细胞的初始步骤即是病毒外膜与靶细胞膜相互结合作用的过程, 多种病毒蛋白及宿主细胞分子参与其中.HCV主要的靶细胞是肝细胞, 病毒颗粒首先要通过肝细胞膜进入胞浆才能开始其生命周期.     

长链非编码RNA CCHE1在胰腺导管腺癌中的表达及临床意义

目的 检测长链非编码RNA(lncRNA)CCHE1在胰腺导管腺癌(PDAC)细胞和组织中的表达,探讨lncRNA CCHE1与PDAC临床病理特征及预后间的关系.方法 RT-PCR检测PDAC组织及配对癌旁组织以及PDAC细胞和胰腺导管上皮细胞中lncRNA CCHE1的表达;利用单因素方差分析探讨lncRNA CC...     

负链RNA病毒反向遗传学技术的建立及发展应用

负链RNA病毒基因组由单负链RNA构成。其基因组RNA需要被转录为mRNA才能引导病毒蛋白在细胞内合成。使用传统的DNA重组技术对负链RNA病毒进行基因操作已经难以奏效。反向遗传学方法是通过反转录病毒RNA为cDNA,从而构建成含有病毒基因组cDNA的质粒并转染相应细胞产生病毒。通过中间的DNA环节在DNA相对负链RNA病毒基因组进行人工操作,这使得研究者可以自定义产生需要的病毒。因而研究反向遗传学技术的建立、发展过程以及它在相关病毒基因片段结构功能、疫苗研制、外源基因表达、基因治疗等方面的应用很有意义。     

定量竞争核糖核酸（RNA）多聚酶反应法检测丙型肝炎病毒RNA水平：高滴度病毒血症与疾病进展期相关

目前认为丙型肝炎病毒(HC)感染是慢性肝炎肝硬化及终末期肝病的主要原因.此外,新近认为HCV至少与两种肝外综合征有关,包括原发性混合性冷沉淀球蛋白血症和膜增生性肾小球肾炎.有症状或无症状的HCV感染者的血浆或血清中,用RNA多聚酶链反应法(RNA—PCR)检测HCV—RNA基因组是HCV感染的最敏感标志物.在用干扰素治疗慢性丙型肝炎时,病毒RNA阴转与临床反应有很好的相关.而病毒RNA再阳预示复发.精确检测病毒血症患者的HCV—RNA水平能增进我们对HCV感染、传播和发病机理的了解,亦有助于对慢性丙型肝炎患者进行临床分期和治疗.因此,建立了一种定量竟争(QC)RNA—PCR检测法来检测临床样本中的HCV—RNA实际水平.该方法在RNA提取,cDNA合成和PCR扩增过程中的一个合成的HCV—RNA分子作为内对照物.由于HCV分溶物的HCV—RNA 5’端核苷酸高度保守,故选该区做为靶序列.PCR对该编码区要比HCV基因组的其他区更加灵敏,而且与5’端编码区相对稳定,易于处理和贮存,可能与该区有丰富的二级结构有关.应用定量竞争PCR检测法.检测了121例病毒血症患者的HCV—RNA水平,包括无症状的供血员,慢性肝炎病人及将行肝移植的晚期肝病病人.