成熟心肌细胞诱导胚胎干细胞定向分化为心肌样细胞

目的： 拟证实成熟心肌细胞对胚胎干细胞（ESCs）定向分化的诱导作用。方法：分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,以DAPI（4’6-联眯-2-苯基吲哚）染核作为细胞标记。取昆明小鼠3.5-4 d的囊胚培养后分离出ESCs,以1和（或）2代的小鼠ESCs细胞团与心肌细胞共培养。录像动态观察ESCs向心肌细胞分化的情况;分别于共培养后3、7、14 d对ESCs行肌钙蛋白T（cTnT）免疫荧光染色检测。结果：1代或2代的ESCs和/或细胞团与心肌细胞共培养约7 d左右出现成节律搏动的心肌样细胞;最好实验批次,可计数到1/4以上的ESCs和/或ESCs细胞团出现节律性搏动。心肌细胞共培养体系中添加0.6% DMSO时,节律搏动的心肌样细胞分化率未见提高。心肌细胞诱导组,记录已搏动和未搏动ESCs诱导分化后心肌样细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;ESCs与心肌成纤维细胞共培养诱导组,分化的细胞cTnT蛋白荧光染阴性;0.6% DMSO诱导组约3％的细胞cTnT蛋白荧光染色阳性;DMSO联合心肌细胞诱导组,结果与单纯心肌细胞诱导组相似。结论：未经建系操作的ESCs可直接诱导分化为节律搏动的心肌细胞;成熟心肌细胞与ESCs共培养状态下,成熟心肌细胞是ESCs定向分化较强的诱导因素。     

与心肌细胞共培养的小鼠胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的 探讨心肌细胞促进胚胎干细胞（ESCs）分化为心肌样细胞的诱导作用。方法 收集小鼠3.5d胚龄的囊胚,将其培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,4～5d后取内细胞团接种在饲养层上分离培养出ESCs。取3～5代ESCs,先将ESCs悬浮培养形成2～3d的拟胚体(EBs),再与新生大鼠心肌细胞共培养诱导向心肌细胞分化,相差显微镜下观察分化细胞的形态学变化,免疫细胞荧光技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)、α－肌动蛋白（α-Actin）的表达。结果 诱导第3天起可见自发性、有节律跳动的拟胚体出现,12d时第2组约有93%的拟胚体出现节律性收缩,显著高于其他各组,均表达心肌细胞特异性蛋白cTnT、а-actin,心肌细胞直接接触诱导组其分化比率达56.5%,高于其他各组,并且分化的细胞形态较单一。结论 心肌细胞和心肌细胞裂解液均可诱导ESCs向心肌细胞定向分化,且心肌细胞的诱导作用强于心肌细胞裂解液。     

二甲基亚砜诱导胚胎干细胞分化伴随凋亡发生

目的：标准化二甲基亚砜（DMSO）诱导胚胎干细胞（ESC）向心肌细胞分化的方法,及DMSO是否同时诱导细胞凋亡。方法：MTT法确定DMSO的应用剂量,不同条件培养基对ESC进行诱导分化,并在形态学、蛋白质及基因水平鉴定ESC源心肌细胞。利用形态学、流式细胞仪等对细胞凋亡进行观测。结果;DMSO的最佳应用浓度为1％,拟胚体经诱导后跳动率为96．7％。该心肌细胞表达多种心肌蛋白,且肌小节结构发育成熟。DMSO的促分化效应可能与心肌转录因子GATA-4的表达有关,1％DMSO可诱导ESC部分产生凋亡,且具有时间和剂量依赖性。结论：1％DMSO不但能够高效诱导ES-D3分化为心肌细胞,且以时间依赖的方式诱导ES-D3细胞部分凋亡。     

TGF-β1联合内脏内胚层END-2细胞诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞及与凋亡的关系

目的: 探讨体外诱导胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化过程中分化与凋亡的关系,为优化组织工程的种子细胞提供依据。方法: 先将ESCs悬浮培养形成2-3 d拟胚体(embryoid bodies,EBs),再向培养液中添加转化生长因子-β1(TGF-β1)，以及与内脏内胚层样END-2细胞条件培养液共培养联合诱导ESCs向心肌细胞分化。以自然分化为对照组。 激光共聚焦显微技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。用AnnexinⅤ/PI双染后，在流式细胞仪上检测ESCs分化过程中的凋亡情况。 结果: EBs经TGF-β1诱导后,有（43.00±2.08）%的拟胚体出现自发节律性收缩,表达心肌细胞特异性蛋白TnT,以及观察到心肌样超微结构，尤其是联合TGF-β1和END-2细胞条件培养液诱导,自发性收缩的拟胚体高达（88.00±1.42）%(P＜0.01),收缩区域较大且拥有较成熟的心肌样结构。然而自然分化组发生自发节律性收缩的拟胚体只有（12.00±1.53)%。经2种诱导条件诱导后，检测两者的凋亡率分别为（5.58±0.65）%,(9.60±0.75)%(P＜0.05)。 结论: 联合TGF-β1和内脏内胚层样END-2细胞条件培养液对心肌细胞分化有较高的诱导率，两者发挥协同诱导作用，可能机制是直接诱导ESCs分化或促进不向心肌细胞分化的ESCs凋亡。     

人胚胎干细胞体外培养并分化为心肌细胞

目的 :体外培养并鉴定人胚胎干细胞 (EG细胞 ) ,在不添加细胞因子的条件下 ,观察细胞集落分化情况。方法 :取 4～ 6周人胚胎生殖嵴、肠背系膜和中肾嵴 ,进行组织块培养 ,利用组织化学和免疫组织化学技术对培养的细胞进行鉴定。结果 :培养 7～ 8小时 ,在组织块周围出现成纤维细胞 ;5～ 7天后 ,在成纤维细胞上出现EG细胞集落 ,集落内细胞表达阶段特异性胚胎表面抗原SSEA 1和SSEA 3,并表达碱性磷酸酶 (ALP)活性 ;培养 1 8天后 ,有6个集落分化为有节律跳动的心肌细胞 ,这些细胞集落在继续培养 1 5天后 ,仍能有节律收缩。此时集落内细胞ALP表达呈阴性 ,但仍有少量细胞表达SSEA 1和SSEA 3。结论 :体外培养人胚生殖嵴、肠背系膜和中肾嵴组织块 ,以内源性的成纤维细胞作为饲养层 ,可以分离得到EG细胞集落 ,一些EG细胞集落可以自发地分化成心肌细胞。     

5-氮胞苷诱导体外培养的胚胎干细胞向心肌样细胞分化

目的研究5-氮胞苷(5-aza)体外诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的可行性。方法将P19细胞接种于培养板中或铺有琼脂的培养板中,5μmol/L5-aza培养7d后用不含5-aza的培养基继续培养。倒置显微镜观察细胞跳动情况,用免疫细胞化学、RT-PCR检测及电镜观察等方法鉴定细胞分化。结果5-aza暴露结合悬浮培养可诱导P19细胞分化为有节律跳动的心肌细胞。分化的细胞表达心肌特异的GATA-4、α-MHC mRNA及α-sarcomeric actin、cTnT蛋白,同时透射电镜观察到细胞质内有明显的肌丝。结论5-aza在体外可诱导胚胎干细胞向心肌样细胞分化,悬浮培养有助于细胞的心肌化过程。     

人胚胎成纤维细胞对人胚胎生殖细胞生长的作用

目的：研究人胚胎成纤维细胞对人胚胎生殖细胞（EG细胞）生长的作用。方法：采用组织块体外培养法体外培养人EG细胞,不添加任何细胞因子,利用源于胚胎组织自身的成纤维细胞作为饲养层,收集培养3d和9d的上清液,用抗体夹心ABC-ELISA法定量检测其白血病抑制因子（LIF）、干细胞生长因子（SCF）和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的含量。培养的细胞用免疫细胞化学法进行SSEA-3、OCT-4的检测。结果：培养9d的上清液中3种因子均含量为LIF55．25pg／ml、SCF90．39pg／ml、bFGF26．06pg／ml．均高于培养3d相应的平均含量。培养的细胞SSEA-3、OC-4呈强阳性表达。结论：上清液中LIF、SCF和bFGF的含量与胚胎成纤维细胞的生长呈正比,胚胎成纤维细胞能分泌这些细胞因子,以维持EG细胞体外增殖并抑制其分化。     

TGF-β1联合内脏内胚层END-2细胞诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞及与凋亡的关系

目的:探讨体外诱导胚胎干细胞(ESCs)向心肌细胞分化过程中分化与凋亡的关系,为优化组织工程的种子细胞提供依据。方法:先将ESCs悬浮培养形成2-3 d拟胚体(embryoid bodies,EBs),再向培养液中添加转化生长因子-β1(TGF-β1),以及与内脏内胚层样END-2细胞条件培养液共培养联合诱导ESCs向心肌细胞分化。以自然分化为对照组。激光共聚焦显微技术检测心肌细胞特异性肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。用AnnexinⅤ/PI双染后,在流式细胞仪上检测ESCs分化过程中的凋亡情况。结果:EBs经TGF-β1诱导后,有(43.00±2.08)%的拟胚体出现自发节律性收缩,表达心肌细胞特异性蛋白TnT,以及观察到心肌样超微结构,尤其是联合TGF-β1和END-2细胞条件培养液诱导,自发性收缩的拟胚体高达(88.00±1.42)%(P<0.01),收缩区域较大且拥有较成熟的心肌样结构。然而自然分化组发生自发节律性收缩的拟胚体只有(12.00±1.53)%。经2种诱导条件诱导后,检测两者的凋亡率分别为(5.58±0.65)%,(9.60±0.75)%(P<0.05)。结论:联合TGF-β1和内脏内胚层样END-2细胞条件培养液对心肌细胞分化有较高的诱导率,两者发挥协同诱导作用,可能机制是直接诱导ESCs分化或促进不向心肌细胞分化的ESCs凋亡。     

心肌梗死大鼠血清促进大鼠骨髓间质干细胞分化为心肌细胞的作用

 目的: 探讨急性心肌梗死（AMI）大鼠血清在体外对大鼠骨髓间质干细胞（BMSC）分化为心肌细胞的作用。方法: 将大鼠BMSC分为6组进行细胞培养：Ⅰ组为未诱导组(对照组),Ⅱ组为5-aza诱导组,Ⅲ组为5-aza＋AMI血清诱导组,Ⅳ组为5-aza＋正常大鼠血清诱导组,Ⅴ组为AMI血清诱导组,Ⅵ组为正常大鼠血清诱导组。培养30 d后进行分化细胞鉴定，检测细胞的形态变化和心肌肌钙蛋白（cTnT）、心肌细胞转录因子GATA-4和结蛋白（desmin）的表达。结果: 大鼠BMSC经5-aza或5-aza联合血清诱导后，向心肌样细胞分化，其cTnT、GATA-4、desmin表达阳性。对照组和单纯血清诱导组的BMSC未见形态改变，其cTnT亦为阴性，但GATA-4、desmin却呈弱阳性。另外，5-aza联合血清诱导组在诱导2周后可观察到部分细胞呈缓慢而有节律的跳动，而单纯5-aza诱导组未见细胞跳动。结论: 单纯用AMI大鼠血清不能诱导BMSC向心肌细胞分化，但AMI血清能促进5－aza诱导的BMSC向心肌细胞分化，并促进分化的心肌细胞成熟。     

胚胎干细胞向生殖细胞分化的研究进展

近年来,人们探索如何在体外诱导胚胎干细胞获得配子,以了解性别决定的基因调控和环境影响.这些研究都是用胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES）建立1个类原始生殖细胞（primordial germ cell-like cells）的细胞群体,然后移植到睾丸或继续培养从而获得雄性或雌性配子.原始生殖细胞的迁移和向生殖干细胞的分化依赖于自身基因表达以及与周围细胞的相互作用.本文将对原始生殖细胞分化为雄性生殖细胞（有少许为雌性生殖细胞）的关键环节、原始生殖细胞和生殖干细胞分化过程中的标志物做一综述.     

叙利亚地鼠原始生殖细胞体外培养方法的初步研究

为建立叙利亚地鼠原始生殖细胞的体外培养方法．在体外无菌分离孕龄10．5d的叙利亚地鼠胚胎的生殖嵴，采用酶机械分离方法获取原始生殖细胞，在条件培养基中培养于饲养层细胞上，然后用酶组织化学染色方法鉴定碱性磷酸酶（ALP）的活性。去除分化抑制因素并诱导原始生殖细胞体外分化后．观察拟胚体和分化细胞的产生。实验结果显示孕龄10．5d的地鼠胚胎生殖嵴．用酶机械分离方法能成功地分离出具有发育多能性的原始生殖细胞，ALP染色鉴定呈强阳性，体外诱导分化后可观察到3种胚层来源的细胞。结果提示该细胞体外培养体系的建立，为生物医学工程学提供了一种新的细胞来源。     

比较体外不同条件诱导胚胎干细胞分化为心肌细胞的实验研究

目的:比较体外不同分化条件下胚胎干细胞(ESC)分化为心肌细胞的分化比率。方法:用布法罗大鼠肝细胞(BRL)条件培养基抑制ESC分化及保持其增殖,以维甲酸(RA)、二甲基亚砜(DMSO)、转化生长因子β₁(TGF-β₁)及激活素-A(activin-A)为分化诱导剂,组合成6种分化培养基,采用悬滴悬浮、贴壁三步法诱导ESC分化为心肌细胞,比较各组分化比率。结果:6种分化条件均能使ESC分化为心肌细胞,其中以TGF-β₁(2 μg/L)、activin-A(20 μg/L)及20%胎牛血清(FCS)组成的分化培养基可以使高达92.80%±2.22%的ESC分化为心肌细胞,分化比率显著高于其它各组(P＜0.01)。结论:以BRL条件培养基培养,TGF-β₁、activin-A作分化诱导剂可作为一种理想的ESC体外分化体系。     

人胚胎生殖细胞在人胚胎成纤维细胞饲养层上的生长

目的探讨以人胚胎成纤维细胞为饲养层分离、培养人胚胎生殖细胞的方法和条件。方法分离、培养3～4月胚胎成纤维细胞,取3～15代细胞经丝裂酶素处理后铺板备用;分离6．11周胚胎原始生殖细胞,将其置于人胚胎成纤维细胞饲养层上,在含生长因子、分化抑制因子的培养体系中培养胚胎生殖细胞;用免疫细胞化学方法检测胚胎生殖细胞表面标志SSEA-1和SSEA-4;钙-钴法检测碱性磷酸酶活性;RT-PCR检测转录因子Oct-4的表达。结果人胚胎成纤维细胞可连续传代25代以上(6月),3～15代细胞可以用作饲养层细胞。分离的胚胎生殖细胞在饲养层上可增殖形成典型胚胎生殖细胞集落,并能连续在体外培养超过8代。集落未分化标志检测显示SSEA—1、SSEA-4呈阳性,碱性磷酸酶活性呈强阳性,Oct-4表达阳性。结论用人胚胎成纤维细胞作为饲养层能获得可连续增殖的胚胎生殖细胞。     

转化生长因子β-1联合内脏内胚层样END-2细胞共培养对小鼠胚胎干细胞体外分化为心肌细胞的实验研究

目的添加转化生长因子_1β(TGF_β1)以及与内脏内胚层样END_2细胞共培养,定向诱导胚胎干细胞(ESCs)分化,探索联合使用化学诱导法与共培养法对ESCs的心肌细胞定向诱导分化作用。方法将ESCs悬浮培养形成2~3 d类胚体(EBs),再向培养液内添加TGF_β1,或(和)将2~3 d EBs与END_2细胞或END_2细胞条件培养液共培养。自然分化为对照组。免疫荧光技术检测心肌细胞特异性肌动蛋白(α_actin)及肌钙蛋白T(TnT)的表达,透射电镜观察分化心肌细胞的超微结构。结果向培养液添加TGF_β1或将2~3 d EBs与END_2细胞或END_2细胞条件培养液共培养,各自有(43±2.08)%(P<0.01),(69±3.61)%(P<0.01),(65±3.06)%(P<0.01)的EBs出现自发节律性收缩,均表达心肌细胞特异性蛋白α_Actin和TnT,观察到心肌样超微结构。自然分化组发生自发节律性收缩的EBs只有(12±1.53)%,尤其是联合使用两种诱导方法,自发性收缩的EBs高达(91±1.52)%(P<0.01),收缩区域较单一诱导组大,且细胞形态较单一。结论联合使用化学诱导和共培养2种诱导法对ESCs的心肌细胞定向分化有协同作用。     

Pluripotent stem cell lines

The derivation of human embryonic stem cells 10 years ago ignited an explosion of public interest in stem cells, yet this achievement depended on prior decades of research on mouse embryonic carcinoma cells and embryonic stem cells. In turn, the recent derivation of mouse and human induced pluripotent stem cells depended on the prior studies on mouse and human embryonic stem cells. Both human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells can self-renew indefinitely in vitro while maintaining the ability to differentiate into advanced derivatives of all three germ layers, features very useful for understanding the differentiation and function of human tissues, for drug screen and toxicity testing, and for cellular transplantation therapies. Here we review the family of pluripotent cell lines derived from early embryos and from germ cells, and compare them with the more recently described induced pluripotent stem cells.     

肝细胞生长因子诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)体外诱导骨髓间质干细胞(MSC)定向分化心肌细胞的一种新方法。方法: 分离SD大鼠骨髓MSC,培养至4-6代后,添加HGF(终浓度10 μg/L)持续培养30 d,倒置显微镜下动态观察分化细胞的自律性搏动和对0.1%异丙肾上腺素和无Ca²⁺孵育液的反应,并行心肌肌凝蛋白表达鉴定。结果: 分化第14-20 d骨髓间质干细胞增殖形成集落,10%-50%克隆中开始出现持续节律收缩的细胞群体,节律频率为70-90次/min,异丙肾上腺素加快其搏动速率,无Ca²⁺孵育液则抑制之。细胞心肌肌凝蛋白表达鉴定为心肌细胞。结论: HGF可诱导骨髓间质干细胞分化为心肌细胞,且有较高的诱导效率。     

胚胎干细胞体外分化为心肌细胞诱导因素的探讨

目的:用胚胎干细胞(ESC)体外诱导分化为心肌细胞,从分子水平上研究早期心脏发育相关基因及其功能。方法:(1)胚胎干细胞的培养。(2)胚胎干细胞的分化培养。(3)被分化的心肌细胞鉴定:RNA的提取;心脏特异性引物的合成和RT-PCR反应;探针标记、纯化和比放射活性测定;RNA斑点杂交。结果:用最适条件培养液对ESC定向诱导分化,可使80%以上的ESC分化为心肌细胞。心肌细胞以同步的方式进行收缩。反转录PCR和斑点杂交的结果显示:心肌在早期发育就开始表达其特异性基因。结论:胚胎干细胞体外能诱导分化为心肌细胞。胎牛血清、二甲基亚砜和维甲酸的浓度及它们之间的组成不同,对ES细胞定向诱导为心肌细胞均有影响。最佳诱导条件是用2 nmol/L维甲酸、0.6%二甲基亚砜和20%胎牛血清组成的条件培养液。