宁波地区耐多药结核分枝杆菌链霉素耐药 相关基因狉狆狊犔和狉狉狊突变研究

摘要：目的　阐明宁波地区耐多药结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因狉狆狊犔和狉狉狊的分子突变特征,为宁波
地区耐多药结核病的有效防控提供科学依据。方法　从宁波市疾病预防控制中心收集６７例耐多药结核分枝
杆菌临床分离株,包括耐链霉素菌株４０株和链霉素敏感菌株２７株。采用ＰＣＲ 直接测序法分析狉狆狊犔和狉狉狊
基因的分子突变特征。对链霉素耐药与基因突变率关系之间的差异采用χ
２ 检验,犘＜０．０５为差异有统计学
意义。结果　４０株耐链霉素菌株中,３１株（７７．５０％）检测到狉狆狊犔发生突变。突变位点集中在第４３位和
第８８位密码子;６ 株耐链霉素菌株（１５．００％） 检测到２ 种不同类型的狉狉狊基因突变, 分别为Ａ１４０１Ｇ
（７．５０％,３／４０）;Ａ５１４Ｃ （７．５０％,３／４０）。２７株链霉素敏感菌株中有４株（１４．８１％）发生狉狆狊犔突变,突
变位点集中在第１０４位和第１１９位密码子,１株链霉素敏感菌株的狉狉狊基因检测到Ａ１４０１Ｇ 突变。耐多药结
核分枝杆菌中链霉素耐药株狉狆狊犔基因突变率高于链霉素敏感株, 两者之间差异有统计学意义（χ
２ ＝
２５．３８７,犘＜０．０５）。结论　宁波地区耐多药结核分枝杆菌对链霉素的耐药与狉狆狊犔突变高度相关,耐药基
因突变类型存在地域差异。
关键词：耐多药结核;链霉素;狉狆狊犔基因;狉狉狊基因
中图分类号：Ｒ３７８．９１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１６）１０ ０７４４ ０６     

广州地区耐喹诺酮结核分枝杆菌gyr基因突变特点

目的分析广州地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床菌株的gyr基因突变特点,为进一步研究结核分枝杆菌耐喹诺酮类药物的分子机理提供地区性资料。方法采用绝对浓度法测定结核分枝杆菌对左氧氟沙星的敏感性,应用DNA直接测序法检测结核分枝杆菌gyr基因的突变情况。结果23株左氧氟沙星耐药株中,15株存在gyrA基因突变,突变率为65.2%,突变位点包括89位、90位、91位和94位;1株存在gyrB基因突变,突变率为4.3%,突变位点为511位。结论广州地区耐喹诺酮结核分枝杆菌临床菌株的gyr基因突变情况与其它地区存在差异。     

脓肿分枝杆菌对抗结核药物的耐药基因研究

目的分析脓肿分枝杆菌对抗结核药物链霉素、乙胺丁醇的耐药基因,探讨其耐药机制。方法 PCR-单链构象多态性(PCR-SSCP)分析6株耐链霉素、乙胺丁醇的脓肿分枝杆菌临床株的rrs、rpsl、embB基因,观察其基因突变情况。结果 6株脓肿分枝杆菌的rrs、rpsl、embB基因与对链霉素、乙胺丁醇敏感的结核分枝杆菌标准株(H37RV)的相应基因序列比较,其中rrs基因第513位密码子核苷酸序列出现A→C突变,rpsl基因核苷酸序列无变化,embB基因第303³05位密码子的核苷酸序列存在差异,仅第303、304位核苷酸编码的氨基酸序列不同。结论脓肿分枝杆菌对链霉素的耐药性可能与rrs基因突变有关,对乙胺丁醇的耐药性可能与embB基因突变有关。     

结核分枝杆菌部分耐药相关基因的突变特点

目的 分析结核分枝杆菌耐药相关基因的突变特点,评价DNA序列分析用于结核分枝杆菌快速耐药性检测的应用价值.方法 利用DNA序列分析检测结核分枝杆菌的katG、rpoB和gyrA基因片段.结果 86.81%(79/91)异烟肼耐药株存在katG基因的点突变和/或单碱基插入,最常见的突变形式为R463L,占76.92%(70/91).90.38%(94/104)的利福平耐药株在rpoB基因耐药决定区(RRDR)发生突变,突变类型有26种,涉及11种氨基酸,突变集中在密码子第507～533位.70.49%(86/122)氧氟沙星耐药株在gyrA基因耐药决定区(QRDR)发生突变,突变主要形式为A90V、D94Y、D94N、D94H及S91P.结论 耐药相关基因突变的检测,可作为临床快速检测结核分枝杆菌耐药性的方法之一.     

宁波地区耐多药结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs突变研究

目的阐明宁波地区耐多药结核分枝杆菌链霉素耐药相关基因rpsL和rrs的分子突变特征,为宁波地区耐多药结核病的有效防控提供科学依据。方法从宁波市疾病预防控制中心收集67例耐多药结核分枝杆菌临床分离株,包括耐链霉素菌株40株和链霉素敏感菌株27株。采用PCR直接测序法分析rpsL和rrs基因的分子突变特征。对链霉素耐药与基因突变率关系之间的差异采用χ2检验,P0.05为差异有统计学意义。结果 40株耐链霉素菌株中,31株(77.50%)检测到rpsL发生突变。突变位点集中在第43位和第88位密码子;6株耐链霉素菌株(15.00%)检测到2种不同类型的rrs基因突变,分别为A1401G(7.50%,3/40);A514C(7.50%,3/40)。27株链霉素敏感菌株中有4株(14.81%)发生rpsL突变,突变位点集中在第104位和第119位密码子,1株链霉素敏感菌株的rrs基因检测到A1401G突变。耐多药结核分枝杆菌中链霉素耐药株rpsL基因突变率高于链霉素敏感株,两者之间差异有统计学意义(χ2=25.387,P0.05)。结论宁波地区耐多药结核分枝杆菌对链霉素的耐药与rpsL突变高度相关,耐药基因突变类型存在地域差异。     

深圳市结核分枝杆菌耐药性与基因突变分析

[目的]了解我市结核分枝杆菌耐药性与基因突变情况,分析耐药表型与基因突变的相关性. [方法]从临床标本中分离培养、鉴定结核分支杆菌;应用药敏试验、单链探针反向杂交试验技术(LiPA)和基因测序分析结核分支杆菌耐药性与基因突变情况. [结果]50株结核分支杆菌中,12株耐INH,7株耐RFP,15株耐SM,2株耐EMB.LiPA检测耐RFP阳菌株,4株rpoB基因531位TCG→TTG突变;耐INH菌株中5株KatG基因315位AGC→ACC突变;酎SM菌株中6株、SM敏感株1株rpsl基因43位AAG→AGG突变,1株耐SM菌株rpsl基因88位AAG→AGG突变;rrs基因未检测到突变;1株耐EMB菌株与1株EMB敏感株的embB基因306位发生ATG→GTG突变. [结论]我市结核分枝杆菌的耐药性增加趋势显著,加强监测与综合干预非常必要.     

结核分枝杆菌利福平耐药基因突变的研究

目的评价检测rpoB基因突变在结核分枝杆菌耐利福平（I肝）耐药性测定中的应用价值。方法采用DNA序列分析法和聚合酶链反应-单链构象多态性（PER—SSCP）法对91株结核分枝杆菌临床分离株（其中药物敏感株35株，耐RFP或含耐RFP耐多药株56株）rpoB基因核心区域的突变情况进行检测。结果以结核分枝杆菌H37RV为对照，所有35株药物敏感株的rpoB基因均无突变，用DNA序列分析方法检测56株耐药株中53株发生突变，敏感性为94．6％（53／56），其中最常见的突变位点是531位丝氨酸和526位组氨酸。PER—SSCP检测56株耐RFP分离株中，52株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性为92．9％（52／56）。结论DNA序列分析对判断结核分枝杆菌耐利福平非常有价值。PER—SSCP可初步筛选结核分枝杆菌RFP耐药性。     

焦磷酸测序技术在利福平rpoB基因突变检测中的应用评价

目的 应用焦磷酸测序技术检测结核分枝杆菌rpoB基因突变,并探讨其在结核分枝杆菌利福平耐药性检测中的应用价值.方法 利用焦磷酸测序技术,测定150株结核分枝杆菌临床分离株rpoB基因81个碱基的利福平抗药性决定区(RRDR),分析rpoB基因突变特点,并与绝对浓度法和MIC法药敏结果进行比较.结果 150株结核分枝杆菌中66株耐药84株敏感,54株为耐多药菌株,rpoB基因突变涉及6个密码子12种突变基因型,最常见的突变位点及突变形式分别为531位TCG突变为TYG,占60.6%,526位CAC突变为TAC、GAC,占22.7%.耐药性检测结果表明,焦磷酸检测法与绝对浓度法二者的符合率为92.7%,与MIC法的符合率为97.8%.结论 焦磷酸测序检测技术不仅是一种快速、准确、高通量的利福平分子药敏检测方法,同时也是结核分枝杆菌耐药性研究的有用工具.     

嘉兴市２７７株结核分枝杆菌耐药性监测分析

摘要：目的　了解结核分枝杆菌对一线抗结核药物的耐药性,初步评价嘉兴市近年来结核病的耐药趋势。
方法　对嘉兴市第一医院２００９－２０１１年期间的结核病患者培养阳性菌株进行菌群鉴定及采用比例法对４种
一线抗结核药物异烟肼（Ｈ）、利福平（Ｒ）、链霉素（Ｓ）、乙胺丁醇（Ｅ） 进行药物敏感性测定,用ＳＰＳＳ
１７．０统计软件进行χ
２ 检验,分析结果。结果　本研究共纳入结核分枝杆菌２７７株,总耐药率为２７．０８％,
耐多药率为１１．１９％;初治患者和复治患者耐药率分别为１７．６２％和５６．７２％,耐多药率６．１９％和２６．８７％,
两者差异均有统计学意义（χ
２＝４．９６,犘＝０．０２６;χ
２＝２１．８５,犘＜０．０１）。结论　嘉兴市结核分枝杆菌的
耐药情况依然严峻,尤其复治患者,在制定结核病防控策略时应给予充分重视,加强对复治肺结核患者高
质量的全程监督短程化疗。
关键词：结核分枝杆菌;耐药性;分析
中图分类号：Ｒ３７８．９１＋１　　文献标识码：Ａ　　文章编号：１００９ ６６３９ （２０１４）０６ ０５５０ ０３     

95株耐多药结核分枝杆菌katG基因序列分析

目的分析广州地区耐多药结核分枝杆菌katG基因突变的分子特征。方法应用PCR-测序法对来自广州地区100株耐多药结核分枝杆菌株katG基因的261～330位密码子长度约210 bp目的片段进行序列测定,并与结核分枝杆菌标准株H37Rv菌株katG基因序列(GenBank:X68081.1,1-4810)进行对比,并应用DNASTAR软件推测氨基酸突变情况。在PCR和基因序列测定中,引物设计相同,上、下游引物分别为5'-GAAACAGCGGCGCTGATCGT-3和5'-GTTGTC-CCATTTCGTCGGGG-3'。结果 100株耐多药结核分枝杆菌菌株中,95株成功扩增出katG基因,95株中有70株呈现katG基因突变(73.68%);基因突变类型均为点突变,突变均发生于315位点,未见插入或缺失型基因突变;氨基酸突变包括3种类型,其中:66株发生AGC(Ser)→ACC(Thr)突变即S315T(94.28%),2株发生AGC(Ser)→ATC(Ile)突变即S315I(2.86%),2株发生AGC(Ser)→AAC(Asn)突变即S315N(2.86%)。结论在所测菌株范围内,广州地区耐多药结核分枝杆菌katG基因突变率和突变类型具有其特点。     

结核分枝杆菌gyrA基因突变与氧氟沙星耐药水平的相关性研究

目的探讨结核分枝杆菌耐药相关基因gyr A突变与氧氟沙星耐药水平之间的相关性。方法采用微孔板Alamar blue显色法检测经比例法确认的39株氧氟沙星耐药和32株氧氟沙星敏感的结核分枝杆菌临床分离株对氧氟沙星的最小抑菌浓度(minimun inhibitory concentration,MIC),基因DNA测序法检测氟喹诺酮耐药相关基因gyr A的突变情况,并用卡方检验检测gyr A基因突变与氧氟沙星耐药水平的相关性。结果 32株氧氟沙星敏感株MIC均2.000μg/ml且gyr A未发现耐药相关位点突变。氧氟沙星耐药结核分枝杆菌氧氟沙星MIC≥4.000μg/ml的菌株gyr A 94位的突变率(18/24,75%)高于MIC≤2.000μg/ml(6/15,40%)的菌株(P=0.017);5/7的gyr A 91单突变菌株MIC均为2.000μg/ml;两株gyr A94和gyr A90或91位联合突变株氧氟沙星MIC明显高于其它菌株,分别为16.000μg/ml和64.000μg/ml。结论氟喹诺酮耐药菌株gyr A基因94位突变和双位点联合突变与氧氟沙星高水平耐药明显相关,gyr A 91突变与氧氟沙星低水平耐药有关。     

合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB突变特征研究

目的:了解合肥地区结核分枝杆菌利福平(RFP)耐药株rpoB基因突变特点。方法:应用PCR-直接测序法对合肥地区肺结核病人痰液中分离的90株结核分枝杆菌的rpoB基因629 bp(包括rpoB基因利福平耐药决定区(RRDR)的81 bp)序列进行测定分析。结果:90株结核分枝杆菌中69株对RFP耐药,21株对RFP敏感;69株耐利福平临床分离株中53株发生rpoB基因突变,突变率为76.8%;突变发生在531位丝氨酸的31株,发生率为44.9%,发生在526位组氨酸的8株,发生率为11.6%;还有6株发生了联合突变,发生率为8.7%。21株敏感株中1株rpoB基因发生突变,突变位点是533位亮氨酸。结论:合肥地区结核分枝杆菌利福平耐药基因rpoB基因的RRDR发生了突变,其中531位丝氨酸和526位组氨酸是最常见的突变位点。     

结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药与embB基因突变的相关性研究

目的分析西安地区耐乙胺丁醇(EMB)结核杆菌临床分离株embB基因突变的特点,建立快速检测结核分枝杆菌乙胺丁醇耐药性的方法。方法应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术检测104株结核分枝杆菌临床分离株的embB基因。结果以H37Rv标准株为对照,35株药物敏感株的SSCP和RFLP分析结果均与标准株一致,不存在突变;69株耐乙胺丁醇分离株中,39株(56.52%)SSCP泳动与标准株不一致,存在基因异常;19株(27.54%)RFLP分析存在基因异常。结论西安地区结核杆菌临床分离株对乙胺丁醇耐药与embB基因(尤其是306位密码子)突变有关,PCR-SSCP和PCR-RFLP技术可快速、准确地检测结核分枝杆菌对EMB的耐药性。     

结核分支杆菌rpoB基因突变与耐利福平的研究

目的：研究结核分支杆菌耐利福平（RFP）分离株rpoB基因突变情况并评价其应用价值。方法：采用聚合酶链反应一单链构象多态性(PCR-SSCP)方法对355株结核分支杆菌临床分离株（其中敏感株109株，耐RFP或含耐RFP株246株）rpoB基因进行检测，并对其中31株耐药株用双脱氧末端终止法进行测序分析。结果：以结核分支杆菌标准株H37Rv为对照，所有109株药物敏感株rpoB基因均无突变；246株耐药株中，225株rpoB基因SSCP图谱异常，其敏感性为91.5％。31株耐药株（其中SSCP异常25株，正常6株）PCR扩增产物经测序证实，19株在531位密码子TCG-TTG，7株526位密码子CAC-TAC，3株在516位密码子GAC-GTC，2株未改变。结论：rpoB基因突变是耐 RFP结核分支杆菌耐药性的主要分子机制；其最常见的突变位点是531位色氨酸和526位组氨酸，PCR-SSCP可快速检测结核分支杆菌RFP耐药性。     

大肠埃希菌对氟喹诺酮类的耐药性及其机制研究

目的 探讨大肠埃希菌(ECO)对氟喹诺酮类药物的耐药率及耐药机制.方法 K-B法测定100株ECO对5种氟喹诺酮抗菌药物的耐药性,试管稀释法测定耐环丙沙星和左氧氟沙星的最低抑菌浓度(MIC);错配PCR技术检测耐环丙沙星ECO gyrA基因和parC基因的突变.结果 100株ECO中耐环丙沙星有65株;环丙沙星MIC50、MIC90分别是32、128 μg/ml,左氧氟沙星MIC50、MIC90是16、64 μg/ml;基因位点结果显示,耐环丙沙星的65株中,有60株发生gyrA、parC一个或多个基因位点的突变,有5株未发生突变.结论 gyrA、parC基因突变是该地区ECO,对氟喹诺酮类药物耐药的重要机制,且基因突变位点越多其耐药程度越高.     

结核分枝杆菌inhA基因突变的研究

目的：了解我国结核分枝杆菌耐异烟肼（INH）临床分离株inhA基因突变情况,探讨快速检测结核分枝杆菌耐药基因型的分子药敏检测方法。：方法：用PCR单链构象多态性（PCR－SSCP）和PCR直接测序法（PCR－DS）分析30 结核分枝杆菌临床分离株inhA基因。结果：以结核分枝杆菌H37Rv标准株对照观察所有INH敏感株的PCR－SSCP和PCR－DS图谱,均未发现inhA基因突变,在12株INH耐药株中,有5株无PCR－SSCP和PCR－DS图谱异常,占INH耐药株的41．7％,另有5株和2株分别发生核苷酸错义突变和同义突变,共占INH耐药株的58．3％,结果：多数结核分枝杆菌耐INH与inhA基因突变密切相关,但检测inhA基因突变不宜作为临床分离株耐药性的快速检测指标。     

PCR-SSCP检测结核分枝杆菌利福平耐药性

目的:建立PCR-SSCP快速检测结核分枝杆菌利福平耐药相关基因rpoB突变。方法:用比例法筛选出70株耐利福平结核分枝杆菌临床分离株,用PCR-SSCP方法检测菌株ropB基因突变,并与比例法检测结果进行对比。结果:70株耐利福平菌株中,单耐利福平菌株为12株,同时耐福平和异烟肼菌株为58株。扩增菌株rpoB基因,70株结核分枝杆菌临床分离株ropB基因突变率为91.43%(64/70),其中,耐多药菌株ropB基因突变率为91.38%(53/58),单耐利福平菌株ropB基因突变率为91.67%(11/12)。结论:用PCR-SSCP技术检测结核分枝杆菌RFP耐药性所用时间大幅缩短,检测出的结果与传统方法一致率高,但结核分枝杆菌表型耐药菌株,存在rpoB基因位点无突变的现象,是否存在其他耐药位点或耐药机制,值得深入研究。     

结核分枝杆菌利福平耐药株rpoB基因突变特征研究

目的了解郑州市结核分枝杆菌耐利福平临床分离株的相关耐药rpoB基因突变特征。方法应用PCR方法对40株结核分枝杆菌利福平耐药、40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株中包含"利福平耐药决定区(RRDR)"在内的rpoB基因片段(385bp)进行扩增,并将扩增产物进行测序,以H37Rv结核分枝杆菌标准株的DNA序列作为参比序列,分析结核分枝杆菌临床分离株的突变特征。结果 40株结核分枝杆菌利福平敏感临床分离株及1株H37Rv结核分枝杆菌标准株均未检测到突变,结核分枝杆菌耐利福平临床分离株中有36株检测到突变,突变率92.3%,且突变均位于RRDR区域内;突变位点为8个,共有8个突变类型;最常见的突变热点依次为531位点,该位点突变率为64.1%;526位点,其突变率为12.8%和516位点,其突变率为10.3%。结论 rpoB基因是郑州市结核分枝杆菌对利福平耐药的最相关基因,其中在RRDR内的531位点基因突变率最高,并可通过对rpoB基因的突变检测,对耐多药结核病进行预测。     

铜绿假单胞菌的耐药性及其耐氟喹诺酮机制的研究

目的：了解铜绿假单胞菌的耐药性及其耐氟喹诺酮的机制。方法：用纸片扩散法测定626株铜绿假单胞菌对11种抗生素的耐药性。琼脂稀释法测定40株耐环丙沙星的铜绿假单胞菌对环丙沙星和左氧氟沙星的最低抑菌浓度（MIC），聚合酶链反应－限制性长度多态性分析检测耐环沙星的铜绿假单胞菌的gyrA基因和parC基因突变，结果：626株铜绿假单胞菌中耐环丙沙星的180株（28．8％），耐左氧氟沙星的219株（35．0％），40株耐环丙沙星的铜绿假单胞菌有30株（75％）发生gyrA基因83位点突变，26株（65％）发生parC基因87位点突变，两种突变同时发生的25株（62．5％），结论：铜绿假单胞菌的耐药性日趋严重，临床分离的铜绿假单胞菌耐氟喹诺酮的机制大多为药物作用靶位gyrA和parC的基因突变。     

47株结核分枝杆菌利福平耐药决定区基因突变特征的研究

目的了解吉林省结核分枝杆菌的利福平耐药决定区(RRDR)基因突变特征。方法结核分枝杆菌(MTB)分离自2008-2009年吉林省临床肺结核病人的痰液标本,培养方法为改良酸性罗氏(L-J)培养基。分离出的抗酸杆菌经对硝基苯甲酸(PNB)培养基初步鉴定后选出结核分枝杆菌复合群并应用比例法进行药敏试验(DST)。根据DST结果,选择22株利福平耐药株、22株利福平敏感株以及3株临界值标本进行聚合酶链式反应(PCR)扩增rpoB中包含RRDR在内的部分基因,阳性DNA片段通过基因测序以及Bioedit软件分析方法比对基因突变情况。结果 22株利福平耐药株中,16株同时对异烟肼耐药;22株利福平敏感株中,1株异烟肼耐药。利福平耐药菌株中,95%(21/22)的菌株在利福平耐药决定区RRDR发生了基因突变,其中第531位密码子突变频率占50%,第526位占27%,第533位占9%,第516位及513位均为4.5%;22株利福平敏感株中,RRDR区全部无基因突变发生;3株临界值标本中,1株在第531位密码子发生了基因突变,1株在533位发生基因突变,最后1株无突变。结论 RRDR区点突变的发生与利福平耐药高度一致;异烟肼耐药与利福平耐药高度相关。