RASSFlA基因对膀胱癌细胞凋亡及化疗药物敏感性的影响

目的探讨RASSFIA基因表达对人膀胱癌细胞凋亡及对化疗药物敏感性的影响。方法采用脂质体介导的基因转染法建立野生型和突变型RASSFlA基因的真核表达载体及空载体转染膀胱癌BIU87细胞株,细胞株分为空白对照组（A组）、空载组（B组）、转染突变型RASSFlA组（c组）与转染野生型RASSFlA组（D组）,B,C,D组采用化疗药物丝裂霉素作用于细胞,四甲基偶氮唑蓝法检测细胞增殖程度,原位凋亡细胞检测技术检测膀胱癌BIU87细胞凋亡。Westernblot测定Caspase-3蛋白的表达水平。结果成功建立稳定表达野生型和突变型RASSFlA基因的膀胱癌细胞株;加入丝裂霉素前、后D组细胞增殖比、凋亡指数及Caspase-3蛋白表达水平与A,B组比较差异均有统计学意义（P〈0．05）,C组与A,B组比较,差异均无统计学意义（P〉0.05）。结论野生型RASSFIA的重表达可促进膀胱癌BIU87细胞凋亡,提高膀胱癌细胞对丝裂霉素的敏感性。     

导入RASSF1A基因抑制膀胱癌细胞增殖的研究

[目的]探讨RASSF1A基因的表达对人膀胱癌细胞株体外增殖的影响.[方法]通过脂质体介导的基因转染法将野生型RASSF1A基因的真核表达载体及空载体转染膀胱癌BIU87细胞株.以四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖程度,原位凋亡细胞检测技术和流式细胞仪检测膀胱癌BIU87细胞凋亡和细胞周期,Western blot检测膀胱癌BIU87细胞Cyclin D1蛋白表达的改变.[结果]成功建立稳定表达野生型RASSF1A基因的膀胱癌细胞株.野生型RASSF1A基因的表达可明显抑制膀胱癌细胞在体外的生长,可以显著降低BIU87细胞的增殖比和增高BIU87细胞的凋亡指数,与对照相组比差异显著( P <0.05).BIU87细胞的细胞周期发生 G1/S期阻滞,Cyclin D1蛋白的表达水平下调.[结论]野生型RASSF1A的重表达通过下调Cyclin D1,抑制膀胱癌BIU87细胞体外增殖.     

PTEN基因对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响

目的研究抑癌基因PTEN转染对人膀胱癌细胞系BIU-87化疗敏感性的影响。方法将携有PTEN基因的重组真核表达质粒pBp-PTEN转化大肠杆菌DH5α并扩增,抽提纯化质粒并进行酶切鉴定;pBp-PTEN体外转染BIU-87细胞（pBp-PTEN-BIU87）,筛选稳定转染的细胞并扩增培养,以转染了空质粒pBp的BIU87细胞（pBp-BIU87）和正常BIU-87细胞为对照,用RT-PCR检测PTEN的表达情况,应用MTT法分别研究转染前、后膀胱癌细胞对不同浓度抗癌药物丝裂霉素（MMC）、羟基喜树碱和吡柔比星的敏感性变化。结果RT-PCR证实PTEN在转染的BIU-87细胞中能稳定表达。PTEN转染后,BIU-87细胞对MMC的药物敏感性明显提高,对吡柔比星和羟基喜树碱的药物敏感性无明显变化。结论PTEN基因转染能提高人膀胱癌细胞系BIU-87对抗癌药物MMC的敏感性。     

长链非编码RNA结肠癌相关转录物2(CCAT2)在膀胱癌中的表达及作用机制

目的探讨长链非编码RNA(lncRNA)结肠癌相关转录物2(CCAT2)在膀胱癌中的表达及作用机制。方法选取膀胱癌组织及癌旁正常组织、膀胱癌细胞(EJ、BIU87、T24、T24-ADM)及膀胱正常上皮细胞(sv-HUC-1),采用qRT-PCR检测CCAT2表达。选取膀胱癌细胞,分别转染siRNA-NC和siRNA-CCAT2,采用qRT-PCR检测细胞中CCAT2表达;采用CCK8法检测细胞增殖活性;流式细胞仪检测细胞凋亡;划痕实验检测细胞迁移;Western blot法检测凋亡相关蛋白表达。结果 CCAT2在膀胱癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织(P0.05);与sv-HUC-1细胞比较,CCAT2在EJ、BIU87、T24、T24-ADM细胞中的表达明显增高(P0.05),其中以EJ、BIU87细胞最高。与转染siRNA-NC相比较,转染siRNA-CCAT2后细胞中CCAT2表达显著降低(P0.05)。与转染siRNA-NC相比较,转染siRNA-CCAT2后细胞增殖活性显著降低(P0.05)。与转染siRNA-NC相比较,转染siRNA-CCAT2后细胞凋亡率显著增高(P0.05)。与转染siRNA-NC相比较,转染siRNA-CCAT2后细胞迁移能力显著减弱(P0.05)。与转染siRNA-NC相比较,转染siRNA-CCAT2后细胞Bcl-2蛋白表达显著减少,而Bax蛋白表达显著增高(P0.05)。结论 CCAT2在膀胱癌组织和细胞中高表达,沉默CCAT2可抑制膀胱癌细胞增殖和迁移,并促进膀胱癌细胞凋亡,其机制可能与调控Bcl/Bax比率有关。     

沉默Caveolin-1基因对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响

目的探讨沉默 Caveolin-1（Cav-1）基因对人膀胱癌细胞株5637增殖和凋亡的影响。方法通过siRNA转染人膀胱癌细胞株5637（沉默组）,以转染 FAM-siRNA为阴性对照组,未转染细胞为正常对照组。Re-al-time PCR法检测Cav-1基因沉默的效率,CCK-8法检测各组细胞的增殖情况,流式细胞术检测各种细胞的凋亡情况。结果 siRNA转染可显著降低人膀胱癌细胞株5637中 Cav-1 mRNA 的表达水平。沉默组细胞的增强能力明显减低,而细胞凋亡率明显升高（均P＜ 0.05）。结论沉默Cav-1基因可抑制人膀胱癌细胞株5637的细胞增殖并促进细胞凋亡。     

HMGB1对膀胱癌细胞增殖和凋亡的影响及机制

目的研究高迁移率蛋白1(HMGB1)对膀胱癌细胞增殖、凋亡的影响及机制。方法膀胱癌细胞BIU-87分成对照组、siRNA control组、HMGB1 siRNA组共3组,siRNA control组、HMGB1 siRNA组细胞为感染siRNA control慢病毒和HMGB1 siRNA慢病毒的BIU-87细胞,对照组为不感染慢病毒的BIU-87细胞。用Realtime PCR和Western blot检测细胞中HMGB1表达水平。MTT检测膀胱癌细胞增殖活性,流式细胞术检测膀胱癌细胞凋亡,Western blot检测膀胱癌细胞中CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)、活化型Caspase-12(Cleaved Caspase-12)、活化转录因子4(ATF4)蛋白水平。结果 HMGB1 siRNA可以下调膀胱癌细胞中HMGB1的表达和转录,siRNA control对膀胱癌细胞中HMGB1表达没有影响。沉默HMGB1后膀胱癌细胞增殖能力下降,细胞凋亡率升高,细胞中凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-12表达水平升高,内质网应激蛋白CHOP、ATF4表达水平也升高。结论 HMGB1沉默可以通过内质网途径诱导膀胱癌细胞凋亡,抑制膀胱癌细胞增殖。     

丙戊酸钠协同5-氮-2'-脱氧胞苷对U266细胞RASSF1A基因表达调控的影响

目的 探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-氮-2'-脱氧胞苷(5-Azs-CdR)联合组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸钠(VPA)对人多发性骨髓瘤细胞株U266细胞中Ras相关区域家族1基因(RASSF1)的表达调控以及对细胞生物学活性的影响.方法 5-Aza-CdR、VPA单独或联合干预U266细胞,甲基化特异性PCR(MS-PCR)法和实时荧光定量-PCR(RQ-PCR)法检测药物干预前后RASSF1A基因甲基化状态和RASSF1A mRNA的表达;MTT法检测细胞增殖活性;流式细胞术分析细胞凋亡及细胞周期的改变.结果 未经药物处理的U266细胞检测到RASSF1A基因启动子区域的高甲基化,RASSF1A基因微弱表达,5-Aza-CdR可逆转RASSF1A基因CpG岛高甲基化.诱导U266细胞RASSF1A基因呈剂量依赖性表达(P<0.05),VPA不能诱导U266细胞RASSFlA基因表达,联合用药组U266细胞RASSF1A mRNA的表达明显增强(P相似文献   

突变型与野生型c—myc在非p53依赖性通路中对Bim基因表达的影响

目的探讨突变型与野生型c-myc基因在非p53依赖性通路中对Bim基因表达调控及细胞凋亡的诱导功能。方法分别用携带突变型与野生型c-myc基因慢病毒载体感染p53缺失型乳癌HCCl937细胞，并得到二者过表达的稳定细胞株，以未感染组及感染不携带cmyc基因的慢病毒细胞做空白对照和感染对照，RT-PCR检测突变型与野生型c-myc及Bim基因mRNA表达，MTT、TUNEL检测突变型与野生型c-myc基因过表达乳癌HCCl937细胞增殖与凋亡情况。结果RT-PCR结果显示，突变型组与野生型组cmyc基因mRNA过表达，野生型组Bim基因mRNA表达量与突变型组比较，差异有显著性（F=125．191、157．974，P％0．05）。突变型组细胞增殖活性显著高于野生型组（F=769，64，P％0．05）。突变型组与两对照组细胞凋亡率较低，三者相比差异无显著性，野生型组细胞凋亡率显著高于突变型组与两对照组（F=61．57，P％0．05）。结论非p53依赖性通路中，野生型c-myc基因过表达能明显上调Bim基因表达，通过Bim诱导细胞凋亡，而突蛮后此作用丧失,致瘤件增高。     

靶向沉默c-FLIPs基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及机制

目的探讨抑制c-FLIPs基因表达对膀胱癌细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法 RT-PCR及Western blot分别检测膀胱癌组织及细胞中c-FLIPs基因的表达;si-c-FLIPs转染人膀胱癌T24细胞,同时转染正常对照组(normal)和阴性对照组(si-control),48 h后Western blot检测c-FLIPs、Cleaved caspase 8、β-链蛋白(β-catenin)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)蛋白表达;细胞计数试剂盒-8(CCK8)实验检测细胞增殖;流式细胞仪检测细胞凋亡。结果膀胱癌组织及细胞中c-FLIPs基因的表达均显著高于癌旁组织(P0.01)。T24细胞中c-FLIPs基因的表达最高,选择作为研究对象;转染si-c-FLIPs后FLIPs的表达显著降低;si-c-FLIPs组细胞存活率及β-catenin和Cyclin D1蛋白表达显著低于normal组,细胞凋亡率及Cleaved caspase 8蛋白表达显著高于normal组(P0.01)。结论抑制膀胱癌中c-FLIPs基因表达可降低癌细胞的增殖及诱导细胞的凋亡,其机制与下调Wnt/β-catenin信号通路有关。     

葡萄籽提取物原花青素对人膀胱癌BIU87细胞增殖和凋亡的影响

目的 探讨葡萄籽提取物原花青素(GSPE)对人膀胱癌细胞株BIU87细胞增殖和凋亡的影响。方法 BIU87细胞与50、100、200μg/ml的GSPE共同孵育24h后,采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖抑制率,流式细胞术分析细胞凋亡情况。结果 不同浓度（50、100、200μg/mL）GSPE对BIU87细胞的增殖抑制率分别为(13.0±1.5)%、(31.8±2.1)%和(48.6±1.8)%;凋亡率分别为(8.7±0.7)%、(28.2±1.6)%和(48.5±0.7)%;细胞增殖抑制率和凋亡率均随GSPE浓度的升高而增高（P＜0.01）。结论 葡萄籽提取物原花青素在体外可呈浓度依赖性抑制膀胱癌BIU87细胞增殖并促进其凋亡。     

BHRF1基因对丝裂霉素诱导胃癌细胞SGC7901凋亡影响

目的探讨EB病毒早期基因BHRF1的表达对丝裂霉素诱发胃癌细胞SGC7901凋亡的影响。方法构建pcDNA3.1-BHRF1表达载体,应用脂质体转染法将BHRF1表达载体转染胃癌细胞系SGC7901,MTT法检测细胞生长情况。实验分为细胞对照组、空载体对照组和目的基因转染组,细胞对照组仅接种SGC7901细胞,空载体对照组将pcDNA3.1空载体转染入SGC7901细胞中,目的基因转染组将重组质粒pcDNA3.1-BHRF1转染入SGC7901细胞中。分别培养24、48和72 h后,用浓度为30 mg/L的丝裂霉素处理,流式细胞术检测细胞凋亡率,Hoechst33258荧光染色方法检测凋亡小体。结果 pcDNA3.1-BHRF1重组质粒构建成功。MTT实验显示目的基因转染能明显拮抗由于丝裂霉素作用导致的细胞生长抑制;BHRF1转染＋丝裂霉素处理组凋亡小体明显少于对照组,细胞凋亡率明显低于对照组,差异均有统计学意义（F=6 250.510,q=56.992、51.613,P〈0.01）。结论 BHRF1基因具有明显拮抗丝裂霉素诱导胃癌SGC7901细胞凋亡的作用。     

miR-203过表达对结肠癌HT-29细胞紫杉醇化疗敏感性的影响及可能机制

目的采用脂质体转染法制备miR-203过表达结肠癌HT-29细胞,探讨miR-203过表达对结肠癌HT-29细胞紫杉醇化疗敏感性的影响及可能机制。方法取对数生长期结肠成纤维细胞CCD-18Co和结肠癌HT-29细胞,采用实时荧光定量PCR法检测miR-203相对表达量。取对数生长期结肠癌HT-29细胞,分为过表达组(转染miR-203-pcDNA 3.1质粒)、空载组(转染NC-pcDNA3.1质粒)和对照组(不作任何干预),采用实时荧光定量PCR法检测3组转染48h时miR-203相对表达量。取转染48h时过表达组、空载组、对照组细胞,用1、5、10、50、100μmol/L紫杉醇处理细胞48h,采用MTT法测定细胞增殖抑制率,并计算3组紫杉醇对细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC₅₀)。转染48h,取对照组细胞分为对照1组和紫杉醇组,取过表达组细胞分为过表达1组和过表达+紫杉醇组,紫杉醇组和过表达+紫杉醇组应用对照组IC₅₀值(28.20μmol/L)浓度的紫杉醇处理,对照1组和过表达1组不进行处理,48h后采用流式细胞术检测4组细胞凋亡,采用Western blot法检测4组细胞磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol-3 kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt、caspase-3蛋白相对表达量。结果结肠癌HT-29细胞miR-203相对表达量(0.38±0.05)低于CCD-18Co细胞(1.01±0.09)(P<0.05)。转染48h,过表达组miR-203相对表达量(1.87±0.11)高于空载组(0.39±0.04)和对照组(0.40±0.05)(P<0.05),空载组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。1、5、10、50、100μmol/L紫杉醇处理48h,过表达组细胞增殖抑制率高于空载组和对照组(P<0.05),IC₅₀值低于空载组和对照组(P<0.05),空载组与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。紫杉醇处理48h,过表达1组、紫杉醇组、过表达+紫杉醇组细胞凋亡率[(18.25±1.70)%、(19.11±1.83)%、(57.59±4.31)%]高于对照1组[(8.10±1.14)%](P<0.05),过表达+紫杉醇组高于过表达1组和紫杉醇组(P<0.05),过表达1组与紫杉醇组比较差异无统计学意义(P>0.05)。紫杉醇处理48h,过表达1组、紫杉醇组、过表达+紫杉醇组PI3K(0.81±0.05、0.83±0.05、0.32±0.04)、磷酸化Akt(0.57±0.04、0.55±0.04、0.18±0.03)、caspase-3(0.67±0.13、0.65±0.10、0.19±0.10)蛋白相对表达量低于对照1组(1.12±0.09、0.80±0.06、1.25±0.12)(P<0.05),过表达+紫杉醇组低于过表达1组和紫杉醇组(P<0.05),过表达1组与紫杉醇组比较差异均无统计学意义(P>0.05);4组Akt蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论结肠癌HT-29细胞miR-203呈低表达,过表达miR-203可提高结肠癌HT-29细胞对紫杉醇的敏感性,促进HT-29细胞凋亡,其机制可能与抑制PI3K、caspase-3激活及Akt磷酸化有关。     

RNA干扰Caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用

目的:探讨RNA干扰caspase-8基因及抑制细胞凋亡的作用效果.方法:构建针对大鼠caspase-8基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-caspase-8 shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定表达caspase-8 shRNA的细胞系.实验分为3组,(1)正常对照组,未转染的RK3E细胞;(2)阴性对照组,转染空载体pRNAT-U 6.1的RK3E细胞系;(3)实验组,转染caspase-8 shRNA的RK3E细胞系.经脂多糖孵育12 h后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PCR和Real time PCR检测mRNA的表达,以及各组caspase-8蛋白的活性.结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(P＜0.01),caspase-8的mRNA水平和蛋白活性显著降低(P＜0.01).结论:针对caspase-8的特异性shRNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制细胞凋亡的发生.     

MiRNA-326抑制人椎间盘退变髓核细胞活力和凋亡的机制

目的:探讨过表达miRNA-326对椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)髓核(nucleus pulposus,NP)细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:构建miRNA-326慢病毒表达载体,在293T细胞中获得重组慢病毒,经感染NP细胞得到稳定过表达细胞系GV369-miRNA-326-NP,同时设置空载体GV369-NP组与空白组。荧光显微镜观察慢病毒载体的标签蛋白[绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)]的表达,实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)方法检测miRNA-326的表达,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光素酶报告基因分析验证miRNA-326与FasL的靶向关系,蛋白质印迹法检测细胞中凋亡相关蛋白FADD,caspase-3,Bcl-2及Bax的表达,使用试剂盒检测细胞线粒体膜电势的变化情况。结果:荧光显微镜下示,经慢病毒感染的过表达细胞系和空载体细胞系均出现绿色荧光,而空白组未见绿色荧光。与空白组相比,GV369-miRNA-326-NP组中miRNA-326的表达水平、Bcl-2表达水平和线粒体膜电位明显升高,而细胞凋亡率,FADD,caspase-3和Bax的表达水平明显下降,差异均有统计学意义(P<0.05);GV369-NP组与空白组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。荧光素酶报告基因分析证实miRNA-326与FasL存在靶向关系。结论:MiRNA-326可抑制IDD NP细胞发生凋亡,既可通过靶向性调控外源性FasL/Fas通路参与caspase-3和FADD介导的细胞凋亡,也可通过线粒体途径对细胞凋亡发挥作用。     

Colon carcinoma cells harboring PIK3CA mutations display resistance to growth factor deprivation induced apoptosis

PIK3CA, encoding the p110alpha catalytic subunit of phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), is mutated in a variety of human cancers. We screened the colon cancer cell lines previously established in our laboratory for PIK3CA mutations and found that four of them harbored gain of function mutations. We have now compared a panel of mutant and wild-type cell lines for cell proliferation and survival in response to stress. There was little difference in PI3K activity between mutant PIK3CA-bearing cells (mutant cells) and wild-type PIK3CA-bearing cells (wild-type cells) under optimal growth conditions. However, the mutant cells showed constitutive PI3K activity during growth factor deprivation stress (GFDS), whereas PI3K activity decayed rapidly in the wild-type cells. Importantly, constitutively active PI3K rendered the mutant cells resistant to GFDS-induced apoptosis relative to the wild-type cells, indicating a biological advantage under stress conditions that is imparted by the mutant enzymes. Compared with the wild-type cells, the mutant cells were hypersensitive to the apoptosis induced by the PI3K inhibitor LY294002. In addition, PIK3CA small interfering RNA significantly decreased DNA synthesis and/or induced apoptosis in the mutant cells but not in the wild-type cells. Furthermore, ecotopic expression of a mutant PIK3CA in a nontumorigenic PIK3CA wild-type cell line resulted in resistance to GFDS-induced apoptosis, whereas transfection of wild-type PIK3CA or empty vector had little effect. Taken together, our studies show that mutant PIK3CA increases the capacity for proliferation and survival under environmental stresses, such as GFDS while also imparting greater dependency on the PI3K pathway for proliferation and survival.     

nm23-H1基因转染对人舌癌Tca8113细胞株生物学行为的影响

目的研究nm23-H1基因转染对人舌癌Tca8113细胞株生物学行为的影响。方法采用脂质体转染法将真核表达载体pAdEasy-nm23-H1转染Tca8113细胞,分为Tca8113-Ad-nm23-H1组(转染pAdEasy-nm23-H1)、Tca8113-Ad组(转染空载体pAdEasy)和Tca8113组(未转染)。采用RT-PCR检测nm23-H1基因在细胞中的表达,噻唑蓝比色法检测转染前、后细胞体外增殖能力的变化,流式细胞术分析转染前、后细胞周期及凋亡的改变,采用Transwell小室和冲刷实验观察细胞侵袭、黏附、趋化运动能力的变化,克隆形成实验观察转染前、后细胞克隆形成能力。结果与Tca8113-Ad组和Tca8113组比较,Tca8113-Ad-nm23-H1组细胞体外增殖能力、细胞侵袭、黏附、趋化运动能力、克隆形成率及细胞S期比例下降(P<0.05);细胞G2/M期比例及凋亡率明显增高(P<0.05)。结论 nm23-H1基因转染后对人舌癌Tca8113细胞的增殖能力、侵袭转移能力均有明显抑制作用;nm23-H1基因可明显抑制人舌癌Tca8113细胞G2期向M期过渡,同时促进癌细胞凋亡。     

Growth inhibition and induction of apoptosis in acute myeloid leukemia cells by new indolinone derivatives targeting fibroblast growth factor, platelet-derived growth factor, and vascular endothelial growth factor receptors

In acute myeloid leukemia (AML), receptor tyrosine kinase ligands promote growth and survival and contribute to AML-associated marrow neoangiogenesis. We have tested simultaneous inhibition of vascular endothelial growth factor, fibroblast growth factor, and platelet-derived growth factor receptor signaling by novel indolinone derivatives using 14 myeloid, including 11 human leukemic, cell lines. Compounds inhibited colony formation of all cell lines in a dose-dependent fashion. Inhibitory concentrations for 50% of the colony formation/survival (IC50) for BIBF1000 were <100 nmol/L for 3 of 11, 相似文献