淡色库蚊抗性种群和敏感品系中铁蛋白基因表达量的分析

目的对淡色库蚊抗性种群和敏感品系中的铁蛋白基因表达量进行分析。方法设计引物,扩增目的基因全长、纯化测序、序列分析,荧光定量PCR检测铁蛋白基因的表达水平;采用假设检验中的t检验方法,对2种不同处理的淡色库蚊样本体内铁蛋白基因表达量进行统计分析。结果成功扩增淡色库蚊铁蛋白基因片段,经荧光定量PCR测定,淡色库蚊敏感品系铁蛋白荧光定量(F敏)和抗性种群铁蛋白荧光定量(F抗)平均值分别为11.41和15.73,内参基因荧光定量(β敏和β抗)平均值分别为10.03和18.27,铁蛋白基因在淡色库蚊抗性种群中的表达量是敏感品系的15.08倍,t检验结果显示,两样本体内铁蛋白基因表达差异有统计学意义(t=26.100,P0.001)。结论淡色库蚊铁蛋白基因可作为蚊虫抗性检测及治理的靶标基因。     

三种品系白纹伊蚊转铁蛋白基因表达量的比较分析

目的 进行不同品系白纹伊蚊转铁蛋白基因表达量的分析.方法 据二维电泳获得肽段序列设计引物扩增基因片段,荧光定量PCR检测在白纹伊蚊抗性品系、敏感品系、现场采集品系蚊体内的表达水平差异.结果 成功扩增白纹伊蚊转铁蛋白基因片段,荧光定量PCR表明转铁蛋白基因在抗性品系蚊体内的表达量是敏感品系的10.51倍,现场品系是敏感品...     

淡色库蚊CYP6F1基因的克隆及表达差异的鉴定

目的克隆淡色库蚊细胞色素P450（CYP6F1）基因并进行表达差异的鉴定。方法采用RT-PCR技术和RACE策略，从淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系Ⅳ龄幼虫中克隆细胞色素P450基因（CYP6F1），用相应的软件进行生物信息学分析，并用实时定量PCR和RT-PCR技术分析敏感、抗性品系蚊的CYP6F1表达水平及对蚊各期CYP6F1进行表达鉴定。结果成功克隆出CYP6F1基因，基因全长1639bp，开放阅读框为1527bp，编码508个氨基酸（GenBank登录号：AY662654）。序列分析显示该基因与已克隆的日本致倦库蚊细胞色素P450基因（CYP6F1）有99％的同源性，并具有所有的细胞色素P450基因的保守性特征，一个膜锚定信号、两个还原酶结合位点、一个的典型的血红素蛋白结合位点和ETLR基序等。实时定量PCR和半定量RT—PCR结果表明，CYP6F1在淡色库蚊对溴氰菊酯抗性品系中表达水平高于敏感品系，且．CYP6F1基因在淡色库蚊各个发育阶段有不同的表达。结论CYP6F1基因可能与杀虫剂抗药性相关，并且在各个发育阶段有不同的表达。     

抗氯氰菊酯淡色库蚊P450特异性探针的制备及应用

目的 制备淡色库蚊氯氰菊酯抗性株细胞色素P450特异性DNA探针，并用于抗性品系与敏感品系的检测。方法 简并引物PCR法制备特异性DNA探针，生物素杂交检测氯氰菊酯抗性淡色库蚊。结果 摸索得到合适的区分抗性与敏感品系的探针浓度，在该探针浓度下抗性与敏感品系杂交点的阳性率有差异。结论 该方法为抗拟除虫菊酯类杀虫剂媒介昆虫基因检测的实用性研究及抗性分子生物学机制的研究打下了基础。     

淡色库蚊乙酰胆碱酯酶Ι基因单链构象多态性分析

为了解不同地区淡色库蚊样本乙酰胆碱酯酶Ι基因(ace1)多态性,探讨单链构象多态性分析(SS-CP)技术在蚊虫抗性分子监测中应用的可行性,本文采集浙江省杭州、舟山、湖州、金华等市区淡色库蚊样本,对其进行ace1基因PCR扩增及SSCP分析。结果显示,浙江省淡色库蚊现场品系以及敏感品系ace1基因片段共存在2个SSCP型,分别命名为ace1-A型(杭州、舟山、湖州现场品系以及敏感品系)和ace1-B型(金华现场品系)。经序列测定,SSCP型ace1-A和ace1-B之间存在两个碱基的差异。实验证明PCR-SSCP可快速高效分析淡色库蚊ace1基因的多态性,适于蚊虫抗性分子监测使用。     

淡色库蚊抗吡丙醚及敏感种群解毒酶活性及其mRNA的表达差异

目的探讨2种解毒酶在淡色库蚊吡丙醚抗性中的作用及其相关基因mRNA表达量的差异。方法采用分光光度法测定羧酸酯酶(CarE)和谷胱甘肽硫转移酶(GSTs)的酶活性,采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)测定CarE及GSTs相关基因的相对表达量。结果淡色库蚊抗吡丙醚种群和敏感种群CarE和GSTs的最适底物分别为1-氯-2,4-二硝基苯(CDNB)和乙酸-2-萘酯(β-NA)。2个蚊虫种群CarE活力分别为3.998×10~(-2)△OD/(mg protein·min)和3.010×10~(-2)△OD/(mg protein·min),两者差异有统计学意义(t=5.486,P0.05);GSTs酶活力分别为3.626×10~(-4)和2.737×10~(-4)nmol/(mg protein·min),两者差异有统计学意义(t=3.899,P0.05)。2个种群EST-2、GST1、GST2基因mRNA相对表达量差异无统计学意义(P0.05),EST-3基因mRNA相对表达量差异有统计学意义(P0.05)。结论吡丙醚可能诱导淡色库蚊EST-3基因上调表达而增强了羧酸酯酶的解毒酶活性,GSTs酶活性升高与GST1和GST2基因没有关系。     

浙江省淡色库蚊钠离子通道基因单链构象多态性分布特征研究

目的了解浙江省不同地区淡色库蚊钠离子通道(vssc)基因多态性分布特征。方法采集杭州、舟山、湖州、金华等市区淡色库蚊样本,PCR扩增vssc基因片段,扩增产物进行基因单链构象多态性(single strand conformation polymorphism,SSCP)分析。对不同的SSCP型进行测序,并进行氨基酸序列预测。结果四地市淡色库蚊现场品系以及敏感品系vssc基因片段经SSCP分析共发现7个SSCP型,分别属于3个不同的氨基酸序列型,即野生型、L1014S突变型以及L1014F突变型。结论浙江省淡色库蚊vssc基因存在较高的多态性,使其在面对菊酯类等相关杀虫剂选择压力时具有较高的耐受度,进而可能会增大相关杀虫抗性防制的难度。     

抗氰戊菊酯淡色库蚊的抗性谱与抗性遗传分析

目的 探讨抗氰戊菊酯淡色库蚊（Culex pipiens pallens）的抗性谱和抗性遗传方式。方法 利用浸渍法测定淡色库蚊抗氰戊菊酯品系和敏感品系Ⅳ龄幼虫对啶虫脒、阿维菌素、吡虫啉、多杀菌素、茚虫威和锐劲特的敏感性，并通过正交、反交和回交试验做进一步的抗性遗传分析。结果抗氰戊菊酯的淡色库蚊对啶虫脒、阿维菌素、吡虫啉、多杀菌素、茚虫威和锐劲特均无交互抗性；抗性遗传分析表明，淡色库蚊对氰戊菊酯的抗性是不完全显性、多基因控制的常染色体遗传。结论淡色库蚊对氰戊菊酯的抗性性状容易遗传给后代，影响蚊虫的抗性治理，在外环境用氰戊菊酯防制成蚊时，应注意合理用药，以延缓抗性的产生和发展。     

微板法检测蚊虫体内乙酰胆碱酯酶活性研究

目的：检测不同敏感品系（Ｓ）蚊虫和室内选育的抗性品系淡色库蚊体内乙酰胆碱酯酶活性。方法：微滴定板法。结果：４种Ｓ品系蚊虫中,以中华按蚊体内ＡｃｈＥ水平最高;３种抗性品系蚊虫中,抗残杀威品系的ＡｃｈＥ活性〉抗氯氰区酯品系〉抗ＤＤＶＰ品系,且后者一Ｓ品系差异无显著性。蚊虫体内ＡｃｈＥ活性随发育而逐步增高,以不同浓度残杀威作抑制剂,测定室内不同品系淡色库蚊个体的ＡｃｈＥ活性,表明蚊虫ＡｃｈＥ活性的抑制率     

抗溴氰菊酯淡色库蚊酯酶同工酶IEF初步分析

本文采用等电聚焦法电泳（ＩＥＦ）初步比较分析了ＬＣ５０分别为０．０２４，２．５８和２１．２７ＰＰＭ的敏感品系与抗溴氰菊酯品系淡色库蚊的酯酶同工酶，结果显示各谱带没有质的区别，但在ＰＩ５．６２，ＰＩ５．８０这两条主带宽度有交叉变化现象，这提示淡色库蚊抗溴氰菊酯的抗性产生可能与基因的表达调控有密切关系，这可为今后研究蚊虫抗性的产生机理提供有价值的参考。     

微量滴定板法测定蚊虫非特异性酯酶检测抗药性的研究

目的：探讨简捷灵敏的蚊虫抗药性早期测报技术。方法；以β－乙酸酯为底物，坚固蓝B盐为显色剂，用微量滴定板法测定实验室和现场单个淡色库蚊非特异性酯酶尖力。结果：实验室5个品系淡色库蚊以抗DDVP品系非特异性酯酶活力水平最高，其次为抗残杀威品系和抗DDVP降解品系，抗氯氰菊酯品系较低，与敏感品系相近；3个现场淡色库蚊种群对DDVP抗性为4．15－9．36倍，对残杀威抗性为1．02－3．18倍，其非特异性酯酶活力水平均较高。结论：微量滴定板法测定非线性特异性酯酶能够检测蚊虫对有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的抗性水平。方法简单快速，结果客观准确，可重复性强，可测出抗性频率，早期发现抗性的存在；可测知抗性机制，便于制订克服抗药性的对策。     

全自动酶标仪测定淡色库蚊抗药性应用研究

[目的]根据蚊虫抗性产生的生化机制，利用生化检测法讨论蚊虫体内酯酶与抗性的关系，测定非特异性酯酶(Non-specific esterase,NSE)活性以判断其抗药性，探讨检测蚊虫抗药性敏感快速的检测方法。(方法]分别以α-乙酸萘酯和β-乙酸萘酯为底物，固蓝B盐为显色剂，用酶标板测定蚊虫NSE的活性，在酶标仪上读取OD值，同时用生物测试法检测LC50作为对照。[结果]现场品系淡色库蚊NSE活力均高于敏感品系，与生物测试结果相一致。[结论]使用全自动酶标仪可以快速测定淡色库蚊体内NSE活性，简单易行，可以作为一种淡色库蚊抗药性检测方法。以便推广应用。     

冰冻储存对淡色库蚊非特异性酯酶活性的影响

目的探讨冰冻储存对淡色库蚊非特异性酯酶（non-specific esterase,NSE）活性的影响,为蚊虫抗药性生物化学检测方法的推广应用提供依据。方法以β-乙酸萘酯为底物,坚固蓝B盐为显色剂,测定单个蚊虫NSE活性。结果DDVP抗性品系淡色库蚊NSE活性水平明显高于敏感品系;经完全随机设计的方差分析比较,-20℃冰冻0、7、14、21、28d的淡色库蚊NSE活性A值之间的差别,敏感品系4龄幼虫的F值为0．7642,该品系3日龄雌成虫的F值为0．7452,DDVP抗性品系4龄幼虫的F值为0．1092,该品系3日龄雌成虫的F值为0．1521,P值均〉0．05,差异无统计学意义。结论-20℃冰冻28d对淡色库蚊4龄幼虫和3日龄雌成虫体内NSE活性无影响,可在现场采集蚊虫带回实验室集中测定。     

基于白纹伊蚊转录组的溴氰菊酯抗性相关基因分析及验证

目的 通过对白纹伊蚊溴氰菊酯抗性品系(DR)和敏感品系(DS)进行转录组分析,筛选可能与抗性相关的差异表达基因。方法 提取白纹伊蚊实验室敏感品系(DS品系)、溴氰菊酯抗性品系(DR品系)的总RNA进行高通量测序,对差异基因进行COG和KEGG的功能注释与分析,筛选出可能与抗性相关的差异表达基因,并进行实时定量PCR验证。结果 DR品系的LC₅₀为2 087.75μg/L,相较于DS品系,抗性倍数为109.8倍,达到了高度抗性标准。RNA-seq测序后基于FPKM值进行差异性分析结果显示,差异表达的基因共有551个,其中在DR品系中上调表达基因有278个,下调表达基因有273个。COG和KEGG功能富集结果显示,显著性富集的通路和蛋白质功能预测均主要与物质代谢相关。基于此进一步分析了代谢抗性相关基因,且10个目标基因的RNA-seq结果与实时定量PCR结果在DR和DS品系中表达趋势具有一致性。结论 白纹伊蚊可能通过上调表达细胞色素P450基因、谷胱甘肽S转移酶基因、羧酸酯酶、表皮蛋白等基因应对杀虫剂的选择压力。     

无锡市淡色库蚊对6种杀虫剂的抗药性调查

目的了解无锡市淡色库蚊抗药性水平,为杀虫剂的合理使用提供科学依据。方法采用幼虫浸渍法检测淡色库蚊对溴氰菊酯、高效氯氰菊酯、氯菊酯、敌敌畏、双硫磷、仲丁威6种杀虫剂的抗药性水平。结果6种杀虫剂对淡色库蚊的半数致死浓度(LC50)由高到低依次为仲丁威敌敌畏双硫磷氯菊酯高效氯氰菊酯溴氰菊酯。与敏感品系比较,对双硫磷和敌敌畏的抗药性达到高抗水平,抗性倍数为421.25、126.93;对仲丁威达到中抗水平,抗性倍数为11.98;对氯菊酯达到低抗水平,抗性倍数为2.64;对高效氯氰菊酯和溴氰菊酯都敏感,抗性倍数为1.53、1.38。结论无锡市淡色库蚊已对部分杀虫剂产生抗药性,在灭蚊工作中应注意避免大量单独使用某种药剂。     

高分辨率熔解曲线分析检测家蝇cyp6d1基因突变

目的 探讨家蝇溴氰菊酯抗性机制.方法 使用高分辨率熔解曲线(high-resolution melting,HRM)分析与半分析定量PCR相结合的方法,分析家蝇抗性基因cyp6d1突变和扩增情况.通过对扩增的PCR产物进行测序来验证HRM准确性.结果 与敏感品系相比,抗性品系cyp6d1基因的mRNA表达量显著增加(P=0.0002),抗性品系cyp6d1基因的mRNA表达量是敏感品系的50.7倍;使用HRM对cyp6d1进行突变分析,将其分为3种基因型,分别为A型(Tm=85.5℃)、B型(Tm=87.3℃)和C型(Tm=88.5℃);经测序,该HRM分析结果分别与3类基因序列型相对应.A型基因型为纯合的1087G、1101T和1155A(对应GenBank序列号U22367.1);C型基因型为纯合的1087A、1101G和1155G;B型基因型为A型和C型的杂合型.生物信息学分析表明,该突变为无意义突变.结论杭州市家蝇抗性品系cyp6d1基因mRNA表达量显著增加,可能是家蝇抗性增加的原因之一.     

千岛湖镇蚊媒种群密度及抗药性监测结果

目的调查淳安县千岛湖镇蚊密度及季节消长、淡色库蚊携带流行性乙型脑炎病毒及抗药性情况,为防制流行性乙型脑炎(乙脑)提供依据。方法采用诱蚊灯法监测千岛湖镇城区蚊密度,用荧光定量PCR法检测自然种群携带乙脑病毒情况,用幼虫浸渍法检测淡色库蚊抗药性。结果千岛湖镇城区2014年成蚊平均密度为1.98只/(灯·h),以淡色库蚊为主,占捕获总数的77.94%,各种环境中牲畜棚的蚊密度最高为2.92只/(灯·h),成蚊密度消长基本呈单峰型,7月达到峰值,密度为3.70只/(灯·h);捕获的淡色库蚊和三带喙库蚊体内均未检出乙脑病毒;淡色库蚊对敌敌畏和溴氰菊酯有抗药性,抗性倍数分别为14.55和6.19,高效氯氰菊酯抗性倍数0.37、残杀威抗性倍数1.30、三氯杀虫酯抗性倍数1.15、丙烯菊酯抗性倍数1.06。结论淳安县千岛湖镇存在乙脑主要传播媒介淡色库蚊、三带喙库蚊,其中优势蚊种淡色库蚊对敌敌畏、溴氰菊酯等药物产生了抗药性。该特征可能会加大本区域乙脑的控制难度。     

家蝇抗溴氰菊酯的分子机制研究

目的研究家蝇抗溴氰菊酯的分子机制。方法在实验室选育家蝇抗溴氰菊酯品系,根据P450基因CYP6D1的保守序列设计合成引物;用PCR方法从敏感品系和抗性品系扩增特异性片段。结果用PCR方法从敏感品系和抗性品系个体都能扩增出一条约210bp的特异性片段,从片段大小和条带明亮程度上均未显示出二者之间的差异,初步表明抗性家蝇P450基因在DNA水平上没有明显的变化。RT-PCR结果多次重复显示抗性品系的扩增带明显比敏感品系的亮,揭示二者RNA的含量可能不同,抗性品系P450基因的反转录活性可能升高。结论家蝇对溴氰菊酯的抗性可能与其体内P450基因的反转录活性升高有关。     

医院获得性肺炎患者分离耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌OprD的表达

目的 研究耐碳青霉烯类抗菌药物铜绿假单胞菌(PAE) OprD的表达水平,探讨济南地区PAE耐碳青霉烯类抗菌药物的机制.方法 收集从医院获得性肺炎患者痰液中分离的PAE,提取13株耐碳青霉烯类抗菌药物菌株的RNA,应用荧光实时定量PCR分析PAE外膜蛋白oprD的基因表达水平;采用超声破碎法制备外膜蛋白,超速离心收集外膜蛋白,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离外膜蛋白,观察OprD的表达.结果 荧光实时定量RT-PCR检测PAEoprD基因表达的结果表明,实验室标准株Ct值oprD/rpsL为1.42;13株碳青霉烯类耐药株Ct值oprD/rpsL平均值为1.17,与实验室标准株相比,差异有统计学意义(t=3.0716,P＜0.01),2株碳青霉烯类敏感株Ct值的oprD/rpsL平均值为1.58,与实验室标准株相比,差异无统计学意义;外膜蛋白电泳图谱表明,碳青霉烯类耐药株在45 kDa处表达明显下降,此处外膜蛋白为OprD.结论 济南地区PAE耐碳青霉烯类抗菌药物与OprD表达水平下降有关.     

高分辨率熔解曲线分析检测家蝇kdr基因突变

目的探讨kdr基因在家蝇溴氰菊酯抗性增加中的作用。方法首次将高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)分析与半定量PCR相结合,用于分析家蝇抗性基因kdr扩增和突变情况。对扩增的PCR产物进行测序来验证HRM准确性。结果与敏感品系家蝇相比,kdr的mRNA表达量在现场品系家蝇中没有显著改变(P>0.05)。使用HRM对kdr进行突变分析,发现所有样本均为同一基因型。经核酸测序,该扩增片段没有突变位点。结论杭州家蝇溴氰菊酯抗性增加与kdr基因无关。