家兔角膜内皮细胞的快速培养

目的:短期内体外扩增获得角膜内皮细胞。方法:采用揭膜法与消化法相结合获取原代角膜内皮细胞。并采用本实验室自行研制的角膜内皮细胞培养体系,在24孔培养板中分别以1×106,5×105,1×105,5×104,1×104,5×103细胞/孔浓度传代培养细胞,观察细胞的生长情况。结果:以1×105～5×105个细胞/孔浓度的细胞悬液并添加消化后的Descemet膜原代培养细胞,4d后细胞形成与在体细胞相似的密集单层,可以快速获取纯化的角膜内皮细胞。传代培养时,虽然不同接种浓度在4d的细胞增殖倍数差异不显著,但以1×105～5×105个细胞/孔的浓度传代,3d就可生长成密集单层并可继续传代,现已传至第10代,但传至第4代,细胞形态开始发生改变;而以5×105个细胞/孔以上的浓度传代细胞时,1d的细胞贴壁率下降;以5×104个细胞/孔以下浓度传代,需7d方可长满皿底,并且细胞开始老化,体积变大,不能继续传代培养。或者细胞不能铺满皿底就衰老死亡。结论:本实验的培养体系可在短期内获得实验用角膜内皮细胞。角膜内皮细胞体外培养的增殖能力与其培养浓度和增殖的空间有关,1×105～5×105个细胞/孔的浓度是角膜内皮细胞快速增殖的适宜培养浓度。     

改良揭膜消化法分离培养恒河猴角膜内皮细胞

目的　分析改良揭膜消化法分离培养恒河猴角膜内皮细胞的可行性。方法　揭取恒河猴角膜后弹力层和内皮层,反复剪碎,用１ｍｇ·ｍＬ－１胶原酶Ａ消化１５ｍｉｎ,离心后重悬接种。待原代细胞长满８０％ ～９０％时,以４０×１０６个·Ｌ－１的密度传代。观察记录原代及传代细胞生长情况、传代时间,进行细胞鉴定,并与组织贴壁法相比较。结果　改良揭膜消化法获取的原代细胞生长较慢,２１ｄ融合成单层铺路石样结构,无基质细胞污染;传代细胞生长较快,５～６ｄ可传一代;神经元特异烯醇化酶表达阳性。组织贴壁法分离组织２４ｈ后组织片体积变小,透亮度明显下降,疑似溶解,高倍镜下观察显示,后弹力层纤维排列紊乱,细胞观察不清;继续培养至第５天,细胞完全溶解,组织片碎裂,轮廓不清,未见角膜内皮细胞爬出。结论　改良揭膜消化法能简易高效地获得大量恒河猴角膜内皮细胞。     

兔角膜内皮、上皮及基质细胞体外培养扩增的研究

目的 建立角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养扩增的简单稳定的方法，为组织工程化角膜的构建提供种子细胞。方法 内皮细胞与后弹力层在培养基中孵育后消化法获原代细胞，胰酶消化去除表层上皮后取角膜缘，组织块法培养角膜缘上皮细胞，基质细胞应用胶原酶消化法获原代培养，各细胞融合后胰酶消化依次传代培养。结果 原代内皮细胞4—5d融合成单层细胞，可连续传6—7代。上皮细胞1周左右生长融合，连续传3—4代后细胞形态改变。基质细胞接种6—7d后近融合，传代后增殖明显，可连续传10代。结论依据角膜组织特征选择合适的方法体外分离、培养角膜3种细胞成分，可获连续传代扩增的角膜细胞。     

丝裂霉素对体外培养兔角膜内皮细胞的毒性影响

目的探讨丝裂霉素C(mitomycinC,MMC)对角膜内皮细胞的毒性作用。方法体外培养家兔角膜内皮细胞,接种于96孔板,加入不同浓度的MMC,分别为1×10-6g·L-1、1×10-5g·L-1、1×10-4g·L-1、1×10-3g·L-1、1×10-2g·L-1、1×10-1g·L-1,动态观察细胞的形态变化和增殖情况,加药22h后MTT法检测吸光度值,应用t检验比较各组间的差异。结果10-2g·L-1、10-1g·L-1浓度组8h后细胞部分死亡,20h细胞几乎全部死亡,其余各组变化不明显。统计学结果显示:10-6g·L-1、10-5g·L-1组和对照组比较无显著性差异(P>0.05),10-4g·L-1组有显著性差异(0.01相似文献   

胎儿角膜上皮细胞分离方法的研究

目的:为了利用流产儿角膜组织体外培养获取角膜上皮细胞,做为构建组织工程化角膜上皮的种子细胞。方法:收集30例(60个角膜)人流产胎儿,分别采用酶消化法、酶消化法结合组织块法和组织块法3种方法分离并培养人胎儿角膜上皮细胞。结果:用Dispase和胰蛋白酶冷消化角膜上皮后,在获取细胞总数、细胞活力和原代培养成功率上没有明显差异,但用Dispase消化后原代细胞容易成活,传代可得到纯化的上皮细胞;酶消化法结合组织块法培养时加入角膜缘组织块可以缩短细胞形成单层的时间,增加传代后细胞的活力;组织块法培养时,在胎儿全角膜组织培养时可得到角膜上皮细胞,角膜组织切割后培养不能获得纯化的角膜上皮细胞。结论:体外构建组织工程化角膜上皮时,种子细胞的获取可以采用流产儿角膜组织为材料分离并培养角膜上皮细胞。     

富血小板血浆促猫角膜内皮细胞增殖的研究

目的 观察富血小板血浆对体外培养猫角膜内皮细胞增殖的影响.方法 采用揭膜法与消化法相结合获取猫角膜原代内皮细胞,培养基采用DMEM培养基(含体积分数10％胎牛血清).采用二次离心法提取富血小板血浆.在完全培养基中加入体积分数分别为5％、10％、20％的富血小板血浆培养角膜内皮细胞,以未加入富血小板血浆的完全培养基为对照.CCK-8试剂盒检测细胞增殖情况,扫描电镜观察细胞形态变化.结果 富血小板血浆体外培养角膜内皮细胞时间越长,其促增殖作用越明显,与对照组比较差异均有显著统计学意义意义(均为P ＜0.01),且随着富血小板血浆含量的增加,角膜内皮细胞增殖越明显,呈剂量依赖性.扫描电镜检测表明,与对照组相比,PRP作用组角膜内皮细胞表面可见丰富的微绒毛,且随着富血小板血浆含量的增加,微绒毛越丰富.结论 富血小板血浆能明显促进体外培养猫角膜内皮细胞增殖.     

体外培养的兔角膜内皮细胞生物学特性

背景如何选择高质量、生物学特性更接近在体生理状态的角膜内皮种子细胞是组织工程角膜研究的基础。角膜内皮细胞（CECs）的培养、鉴定及生物学特性检测是优选角膜内皮种子细胞的瓶颈问题。目的建立兔CECs原代培养及鉴定的方法,检测传代后细胞的生物学特性。方法从30只新西兰大白兔的角膜组织完整撕除后弹力层及CECs层,采用胰蛋白酶消化法进行原代培养,观察培养细胞的生长状态。分别从形态学、基因水平和蛋白水平鉴定细胞：茜素红染色法观察细胞形态,并与新鲜角膜组织的内皮细胞进行对比;逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法检测IVα2型胶原（COL4A2）、血管内皮生长因子受体2（FLK1）、Na^-K^＋ATP酶α亚单位（ATPIA1）、水通道蛋白1（AQP1）、电压依丛性阴离子通道（VDACs）等相对特异性基因;免疫细胞化学法观察神经元特异性烯醇化酶（NSE）、Na^-K^＋ATP酶及紧密连接蛋白ZO-1的表达。采用MTT比色法测定传代细胞的增生活性变化,采用超微量ATP酶试剂盒及免疫荧光法分别测定传代细胞Na^-K^＋ATP酶活性及其表达量的变化。结果原代培养的兔CECs多在24h内贴壁,2—3d达融合,形态呈六边形。随着传代代数的增加,细胞形态逐渐发生改变,第2代、第3代细胞可见空泡样变。原代培养的细胞茜素红染色可见清晰的细胞轮廓,与在体的CECs形态相似。RT—PCR法检测可见COL4A2、FLKl、ATP1Al、AQP1、VDACs等基因在培养细胞中表达。免疫荧光染色结果显示NSE、Na^-K^＋ATP酶、ZO-1在培养细胞中呈阳性表达。MTT检测结果显示,传代后细胞的增生活性逐渐下降,尤其第2代、第3代细胞下降明显。定量检测结果显示随着传代代数的增加,兔CECs的Na^-K^＋ATP酶活性逐渐降低,各代细胞的Na^-K^＋ATP酶活性总体比较的差异有统计学意义（F=77．174,P=0．000）。结论成功用酶消化法建立了体外培养兔CECs的方法,并从多个层次建立了纯化细胞的鉴定方法。研究结果证实经传代后的CECs的增生活性和功能均有所下降,因此在进行相关的研究时应选用前2代的细胞。     

人胚肺成纤维细胞饲养兔角膜上皮和内皮细胞的体外培养

目的 研究人胚肺成纤维饲细胞体外培养兔角膜上皮和内皮细胞。方法 人胚肺成纤维细胞系细胞。经丝裂霉素C处理成饲细胞,兔角膜上皮和内皮细胞组织块原代培养,消化接种于人胚肺饲细胞瓶传代培养,体外培养的角膜上皮和内皮细胞行常规病理形态学检查。角膜上皮细胞行角蛋白,内皮细胞行神经烯醇化酶免疫组化染色检测。结果 人胚肺成纤维细胞形态均一。易于分辨,经丝裂霉素处理后推动增殖能力。角膜上皮和内皮细胞原代培养5-7天。细胞密集,经人胚肺饲细胞共培养5代。细胞无衰老现象,检测角膜上皮细胞角蛋白,内皮细胞神经烯醇化酶表达阳性,人胚肺饲细胞表达阴性。结论 人胚肺饲细胞能够明显增强角膜上皮和内皮细胞的体外生存能力。提高细胞的增殖能力。     

体外培养兔角膜内皮细胞电生理特性的初步研究

目的通过测定体外培养兔角膜内皮细胞(rabbitcorneal endothelial cells,RCECs)静息电位及全细胞电流,初步研究角膜内皮细胞的电生理特性。方法采用后弹力层及内皮层揭取联合组织块法进行RCECs体外培养,采用膜片钳全细胞记录模式记录原代及传代RCECs细胞静息电位及全细胞电流,绘制电流-电压(I/V)曲线。结果体外培养原代RCECs的平均静息膜电位水平为(20.9±1.7)mV(n=6),第2代RCECs的平均静息膜电位水平为(15.1±1.8)mV(n=6),两者差异有统计学意义(P<0.01)。在钳制电位+60mV下,原代RCECs全细胞电流为(396.2±39.0)pA(n=5),大于第2代RCECs的全细胞电流(201.4±45.2)pA(n=5),差异有非常显著的统计学意义(P<0.01)。结论后弹力层及内皮层揭取联合组织块法获得的原代及传代RCECs,在静息电位和全细胞电流等电生理特性方面存在差异。     

角膜内皮细胞改良培养技术的初步探讨

目的 评价角膜后弹力层撕除联合酶消化法分离角膜内皮细胞的效率,分析细胞体外生长的生物学特性.方法 将兔角膜带有内皮细胞的后弹力层完整撕下,用胰蛋白酶-EDTA联合酶消化,纯化的角膜内皮细胞进行体外培养.观察细胞形态,用神经元烯醇化酶抗体进行细胞表型鉴定.苏木精-伊红染色以及茜素红-台盼蓝联合染色分析细胞活性,流式细胞仪检测细胞体外生长过程中Anne xiv-PE的表达情况,透射电镜和扫描电镜进行细胞超微结构形态的观察.结果 带角膜内皮细胞的后弹力层撕除联合酶消化法可快速获得大量纯化的角膜内皮细胞,快速贴壁生长并增生,体外培养3～4d即融合成单层细胞,且表达神经元烯醇化酶抗体阳性,苏木精-伊红染色及活性染色提示细胞功能良好,Annexiv-PE抗体表达水平微弱.结论 角膜后弹力层撕除联合酶消化法可提高角膜内皮细胞的获取和培养效率,为工程化角膜内皮移植膜的构建提供稳定的种子细胞来源.     

Strabisme Alternant - Etude clinique - traitement

The author defines motor and sensory alternation: the term alternation should not be used in isolation, it should always be accompanied by the name of the parameter concerned. Sensory alternation is always found together with motor alternation but the reverse is not true.The examining criteria for a diagnosis of sensory alternation are given, sensory alternation must not be confused with alternating inhibition. Working from clinical observations of cases of motor alternating strabismus, the author selects 2 types of binocular sensory relations which allow one to differentiate between:- cases of primary alternating strabismus- cases of secondary alternating strabismusThese forms will develop in different ways; in both cases a cure is possible providing that the right treatment is prescribed and once prescribed carefully followed, etc. It is always a case of serious forms of strabismus whose developmental period is spread over several years.According to the authors, the frequency of cases of true primary strabismus is from 1–3%, the frequency of cases of secondary alternating strabismus varies according to the type of therapy practised on cases of monocular strabismus with amblyopia. These latter will become cases of alternating strabismus under the influence of certain types of therapy carried out over several years (penalization, rocking, alternated occlusion, etc...).Experimental data on kittens confirm clinical data; kittens placed in abnormal environments during the sensitive period will show modification in the distribution of cortical cells and the absence of binocular cells (either because the excitation of the two eyes was not simultaneous, or not identical: artificial strabismus, occlusion, opaque glasses). This disturbances become irreversible after a certain period of exposure (a function of age, length of exposure, etc...).It is thus necessary to bear in mind: 1) the iatrogenic risks of certain orthoptic treatments, 2) the necessity for a binocular form of treatment as soon as possible, as once a certain stage is passed, cortical plasticity diminishes and the elaboration of normal binocular relations becomes impossible.

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