Ca~(2+)/钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ信息通路在DPDPE长时程作用的NG108-15细胞中的作用

目的　观察阿片类依赖时Ca2 + /钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ (CaMKⅡ )信息通路的变化 ,以及Ca2 + /CaMKⅡ信息通路与cAMP水平之间的关系。方法　以NG10 8 15细胞作为体外的细胞模型 ,分别采用竞争性蛋白结合法及放射免疫法、PDE法、γ 3 2 P参入法以及RT PCR测定cAMP水平、钙调蛋白 (CaM)活性、CaMKⅡ活性和mDOR的mRNA表达水平的变化。结果　DPDPE长时程作用NG10 8 15细胞 ,cAMP水平升高 ,形成阿片依赖 ;细胞CaM活性和CaMKⅡ活性也升高 ,该升高可被CaM拮抗剂W 7所抑制 ,而CaMKⅡ活性的升高可被CaMKⅡ特异性抑制剂KN 6 2所抑制。W 7或KN 6 2可抑制阿片依赖导致的细胞cAMP水平的升高。阿片依赖时 ,加入纳洛酮诱发戒断 ,CaM活性、CaMKⅡ活性进一步增高。而在阿片依赖时 ,δ阿片受体的mRNA表达水平无明显变化。结论　Ca2 + /钙调蛋白依赖的蛋白激酶Ⅱ信息通路可通过调节cAMP水平参与阿片依赖的机制。     

阿片类药物对NG108-15细胞Ca~(2 )/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II信息通路的作用

目的　观察阿片类依赖时Ca2 钙调蛋白依赖的蛋白激酶II信息通路的变化。方法　以NG10 8 15细胞作为体外的细胞模型 ,分别用竞争性蛋白结合法及放射免疫法、PDE法、γ 32 P参入法测定cAMP水平、钙调蛋白(CaM)活性和钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(CaMKII)活性。结果　DPDPE作用NG10 8 15细胞 48h可使细胞浆和细胞核CaM和CaMKII活性升高 ,该变化可被CaM特异性拮抗剂W 7所抑制 ;CaMKII特异性抑制剂KN 6 2可抑制CaMKII活性的增高 ,而对CaM活性无明显影响。DPDPE作用NG10 8 15细胞 48h后 ,加入纳洛酮 ,CaM活性、CaMKII活性进一步增高。结论　Ca2 CaMKII信息通路参与了阿片依赖的机制。     

阿片类药物对NG108-15细胞Ca2+/钙调蛋白依赖的蛋白激酶II信息通路的作用

目的　观察阿片类依赖时Ca²⁺ 钙调蛋白依赖的蛋白激酶II信息通路的变化。方法　以NG108-15细胞作为体外的细胞模型,分别用竞争性蛋白结合法及放射免疫法、PDE法、γ-³² P参入法测定cAMP水平、钙调蛋白(CaM)活性和钙调蛋白依赖的蛋白激酶II(CaMKII)活性。结果　DPDPE作用NG108-15细胞48h可使细胞浆和细胞核CaM和CaMKII活性升高,该变化可被CaM特异性拮抗剂W-7所抑制;CaMKII特异性抑制剂KN-62可抑制CaMKII活性的增高,而对CaM活性无明显影响。DPDPE作用NG108-15细胞48h后,加入纳洛酮,CaM活性、CaMKII活性进一步增高。结论　Ca²⁺ CaMKII信息通路参与了阿片依赖的机制。     

CaMKⅡ在收缩促进骨骼肌细胞GLUT4转位中的作用

目的:探讨钙-钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)在收缩促进骨骼肌细胞葡萄糖转运子4(GLUT4)转位机制中的作用。方法:将接种在培养板中的C2C12GLUT4myc小鼠肌管随机分为对照组和氨乙酰胆碱(Cch)组,各组分为抑制剂亚组和对照亚组。分别用10μmol/LCaMKⅡ的特异性抑制剂KN93或KN62预孵育,用酶联免疫吸附法(ELISA)测定细胞膜上GLUT4myc的含量(转位);用KN93预孵育后,免疫印迹法测定蛋白激酶CaMKⅡ的磷酸化。结果:氨乙酰胆碱使细胞膜上GLUT4myc的水平显著增加。KN93和KN62抑制氨乙酰胆碱刺激的GLUT4myc转位。氨乙酰胆碱可增加CaMKⅡ的磷酸化,KN93不影响对照组CaMKⅡ的磷酸化水平,但可以抑制Cch刺激的CaMKⅡ磷酸化。结论:CaMKⅡ位于Ca2+下游并有介导收缩促进骨骼肌细胞GLUT4myc转位的作用。     

褪黑素对吗啡戒断大鼠脑内CaM和CaMKⅡ活性的影响

目的 :观察褪黑素对吗啡戒断大鼠海马和脑干内CaM及CaMKⅡ活性的影响。方法 :以剂量递增法连续 5d皮下注射吗啡建立吗啡依赖大鼠模型 ,分别用流式细胞术和放射酶法检测脑内CaM及CaMKⅡ的活性变化。结果 :(1)与对照组比较 ,吗啡依赖大鼠海马和脑干内钙调蛋白活性明显升高 (P <0 .0 1) ,而CaMKⅡ活性则显著降低 (P <0 .0 5 )。纳洛酮催促戒断后海马和脑干内CaMKⅡ活性明显高于吗啡依赖大鼠 (P <0 .0 1) ,但钙调蛋白相对活性无显著变化 (P >0 .0 5 ) ;(2 )与吗啡依赖组比较褪黑素可使吗啡戒断大鼠海马和脑干内CaM及CaMKⅡ的活性明显降低 (P <0 .0 5或P <0 .0 1)。结论 :褪黑素对吗啡依赖大鼠戒断综合征的抑制作用可能与MT降低脑干和海马内CaM及CaMKⅡ活性有关。     

钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ抑制剂对心房肌细胞钙超载的影响

目的 探讨钙/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ(ealmodulin-dependent protein kinase II,CaMKII)抑制剂KN93对大鼠心肌细胞钙超载及CaMKII蛋白表达的影响.方法 培养大鼠心房肌细胞原代细胞,应用钙离子导入剂ionomyein(1.0 μmol/L)诱导心肌钙超载模型,KN93(0.25、0.5、1.0 μmo/L)作用下,Fluo-3/AM负载心房肌细胞,激光共聚焦显微镜观察心房肌细胞的收缩频率及细胞游离[Ca2+]i的动态变化,计算平均钙瞬变幅度;采用Western blot法检测CaMKⅡ表达水平.结果 KN93可抑制ionomyein诱导的心肌细胞钙超载,且其抑制率与KN93呈剂量依赖关系,KN93可使心房肌细胞CaMKⅡ表达下降.结论 CaMKII抑制剂KN93可纠正ionomyein诱发的大鼠心房肌细胞的钙超载,并下调细胞CaMKⅡ表达水平.     

遗传性癫痫大鼠海马组织Ca~(2+)/Ca_V1.2/CaM/CaMKⅡ信号通路的异常变化

目的研究遗传性癫痫大鼠(tremor,TRM)海马组织电压门控性L型钙离子通道α1C亚单位(CaV1.2)、钙调蛋白(CaM)、钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的变化情况。方法应用West-ern blot法与免疫荧光双标法检测TRM海马CA1、CA3和DG区CaV1.2、CaM和磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)的蛋白表达及分布;激光共聚焦显微镜检测TRM海马组织中[Ca2+]i。结果与正常Wistar大鼠相比,TRM海马组织中CaV1.2和CaM的蛋白表达明显升高(P<0.01),而p-CaMKⅡ的蛋白表达明显下降(P<0.01);免疫荧光双标法结果显示:CaV1.2、CaM、p-CaMKⅡ在CA1、CA3区的锥体细胞和DG区的颗粒细胞群表达丰富,同时CaV1.2与CaM、p-CaMKⅡ与CaM在海马各区域均存在共定位;激光共聚焦显微镜检测TRM海马细胞[Ca2+]i明显增强(P<0.01)。结论Ca2+/CaV1.2/CaM/CaMKⅡ通路的异常变化可能参与遗传性癫痫大鼠的癫痫发生与发展。     

八肽胆囊收缩素及其受体拮抗剂对吗啡戒断大鼠脑内CaMK Ⅱ蛋白表达的影响

目的观察八肽胆囊收缩素(CCK-8)、CCK-1受体拮抗剂L-364,718及CCK-2受体拮抗剂LY-288,513对吗啡戒断大鼠额叶皮质、海马、纹状体细胞内钙/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)表达的影响。方法建立吗啡依赖及纳洛酮催促戒断大鼠模型,观察CCK-8、L-364,718及LY-288,513对吗啡依赖大鼠戒断症状的影响;采用Western blot方法检测上述脑区CaMKⅡ蛋白表达的变化。结果①CCK-8、L-364,718及LY-288,513能明显改善吗啡依赖大鼠戒断症状的发生;②与盐水对照组相比,吗啡依赖组大鼠额叶皮质、海马、纹状体细胞内CaM KⅡ蛋白表达明显升高;纳洛酮催促戒断后上述脑区CaM KⅡ蛋白表达较吗啡依赖组均明显降低;③CCK-8、L-364,718及LY-288,513均使吗啡戒断大鼠额叶皮质、海马及纹状体内CaMKⅡ蛋白表达升高。结论 CaMKⅡ参与了吗啡依赖及戒断的形成,CCK-8及其受体拮抗剂抑制吗啡依赖大鼠戒断反应的机制可能与其对相关脑区CaMKⅡ蛋白表达的调节有关。     

阿片类药物对诱导型NO合酶稳定表达神经细胞受体介导AC-cAMP系统的影响

目的:利用稳定表达诱导型NO合酶的NG LNCXiNOS细胞,观察阿片类药物对受体介导AC cAMP系统的影响。方法:竞争性蛋白结合法和完整细胞受体结合实验测定cAMP含量和受体结合力。结果:阿片类药物短时程作用抑制AC活性,受阿片受体介导的、百日咳毒素敏感的G蛋白信号通路调节。阿片类药物长时程作用和纳洛酮急性戒断引起受体脱敏,呈时间和剂量依赖性,伴有受体下调。结论:成功地建立阿片耐受和依赖细胞模型,可用于研究AC cAMP系统和NO cGMP系统在阿片耐受和成瘾中的调节。     

Ca~(2+)/CaMKⅡ信号通路在肿瘤坏死因子-α诱导心肌肥大中的作用

目的研究钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)信号通路在肿瘤坏死因子-α(TNF-α)诱导心肌细胞肥大中的作用。方法Lowry法测心肌细胞蛋白含量;计算机图像分析系统测心肌细胞体积;[3H]-亮氨酸参入法测心肌细胞蛋白合成;Till阳离子测定系统观察胞内[Ca2+]i瞬变;Westernblot法测定CaMKⅡδB的表达。结果①TNF-α(100μg.L-1)明显诱导心肌细胞蛋白含量、蛋白合成及体积的增加,CaMKⅡ特异性抑制剂KN93(0.2μmol.L-1)明显抑制TNF-α诱导的心肌肥大,但对正常心肌细胞生长无影响。②TNF-α引起心肌细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)瞬间变化幅度增高,KN93明显降低TNF-α诱导的上述改变。③TNF-α明显增强心肌细胞内CaMKⅡδB的表达。结论TNF-α可能通过引起心肌细胞[Ca2+]i升高,促进CaMKⅡδB表达诱导心肌细胞肥大的。     

阿片成瘾的相关磷酸化蛋白研究

蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白翻译后修饰方式，已有越来越多的证据表明，蛋白磷酸化在阿片耐受和成瘾机制中的重要作用，近年来有许多这方面的研究工作，涉及蛋白激酶C，cAMP依赖蛋白激酶A，依赖与钙．钙调蛋白的蛋白激酶，cGMP依赖蛋白激酶G，G蛋白受体激酶等，这些蛋白作为分子开关调控着阿片的耐受和成瘾。     

钙调蛋白激酶在L型钙通道“run-down”现象发生及恢复过程中的作用

目的;研究钙调蛋白激酶（CaMKⅡ）在钙通道“run-down”现象发生及恢复过程中的作用机制。方法：用酶分离单个豚鼠心室肌细胞,利用膜片钳单通道技术,在细胞膜面内向外的模式下,诱发L型钙通道“run-down”现象。制备活性钙调蛋白激酶（CaMKⅡ αT286D）,记录并分析它在L型钙通道“run—down”现象中的影响。结果：在细胞膜面内向外的钳制模式下1分钟后,细胞内液中加入CaMK ⅡαT286D（1-30μM）,仅使钙通道活性恢复2-10％。但发现CaMKⅡ αT286D可消除CaM对钙通道“run-down”现象恢复作用的时间依存性。在CaMKⅡ αT286D和CaM共同存在条件下,记录到第5分钟的钙通道活性（158．1&#177;62．2％）几乎等同于第1分钟的（148．4&#177;55．5％）。制备CT-1,即含豚鼠Cav1．2通道蛋白C末端1509．1789氨基酸的一个GST融合蛋白。Pull-down实验结果显示,CT-1经CaMKⅡ αT286D处理后,CaM的亲和力高于未经磷酸化或去磷酸化处理的亲和力。结论：CaMKⅡ介导的L型钙通道磷酸化调节了CaM对钙通道的亲和力,延长了CaM对钙通道“run-down”现象恢复作用时间,是“run-down”现象的一个重要调节因子。     

环维黄杨星D调控Ca2+/CaMKⅡ信号改善醛固酮诱导心肌细胞损伤的实验研究

目的探讨环维黄杨星D(cyclovirobuxine D,CVB-D)对醛固酮(aldosterone,ALD)诱导原代大鼠心肌细胞(PNRCMs)损伤的保护作用及其机制。方法通过胰酶消化法提取PNRCMs,以ALD(10μmol·L^-1)制备PNRCMs损伤模型,给予不同剂量的CVB-D处理后,采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞活力,Giemsa染色观察细胞形态变化,Flou-4AM荧光探针检测胞内Ca²⁺浓度,Western blot检测钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ、p-CaMKⅡ)和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Cleaved caspase-9的表达水平。进一步采用钙离子螯合剂(BAPTA-AM),钙离子载体(A23187)及CaMKⅡ抑制剂(KN93)进行干预处理,分析Bcl-2,Bax,Cleaved caspase-9蛋白的表达变化。结果与ALD组比较,CVB-D可显著恢复细胞活力,改善细胞的病理形态变化,上调Bcl-2/Bax的比值,下调Cleaved caspase-9和p-CaMKⅡ的表达并抑制胞内钙离子累积。进一步研究表明,BAPTA-AM和KN93能促进CVB-D上调Bcl-2/Bax的比值,下调Cleaved caspase-9的表达;而A23187可抑制CVB-D上调Bcl-2/Bax的比值,下调Cleaved caspase-9表达。结论CVB-D可改善ALD诱导的原代心肌细胞损伤,其作用机制与Ca²⁺/CaMKⅡ信号通路相关。     

由Aβ片段神经毒性诱导NG108—15细胞建立老年性痴呆细胞模型的探讨

目的：探讨Aβ片段神经毒性诱导NG108－15细胞建立老年性痴呆细胞模型的作用。方法：利用细胞计数，MTT方法，免疫印迹检查，免疫放射活性测定及电生理学测定方法观察Aβ片段神经毒性对NG108－15细胞的存活率，形态学，胆碱乙酰基转移酶活性，突触素蛋白水平及功能性突触形成率的影响。结果：Aβ片段毒性可诱导NG108－15细胞死亡，抑制细胞突起；降低ChAT活性和突触素水平，减少功能性突触形成。结论：Aβ片段神经毒性可诱导NG108－15细胞产生老年性痴呆相似的病理生理损害。     

药物成瘾中的CaMKⅡ信号转导机制

钙／钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（Ca2＋／calmodulin—dependentproteinkinaseⅡ，CaMKⅡ）是一种多功能丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，分布全身，在脑内分布尤其丰富，与神经递质合成和分泌、受体调节、细胞骨架结构调节、轴突传递、长时程增强（long—termpotentiation，LTP）以及基因表达密切相关。近年来研究表明，CaMKⅡ信号转导通路在镇痛及药物成瘾中发挥了重要作用。     

人参皂苷Rb1对慢性吗啡作用的SK-N-SH细胞的影响

目的：探讨人参皂苷Rb1对慢性吗啡作用的SK-N-SH细胞钙调蛋白激酶Ⅱβ（CaMKⅡβ）mRNA、蛋白及cAMP反应原件结合蛋白磷酸化（pCREB）表达的影响。方法：用终浓度为100 μmol·L-1的吗啡、不同浓度人参皂苷Rb1及终浓度为10 μmol·L-1的纳络酮,单独或共同作用于SK-N-SH细胞,采用RT-PCR、Western-blot及免疫组织化法分别研究人参皂苷Rbl对慢性吗啡及纳洛酮作用于SK-N-SH细胞时,CaMKⅡβmRNA、蛋白表达及核转录因子pCREB表达的影响。结果：与对照组相比,终浓度为100 μmol·L-1的吗啡,作用48 h可以显著增加CaMKⅡβmRNA、CaMKⅡβ蛋白及pCREB表达;吗啡作用完毕,再加入终浓度为10 μmol·L-1的纳络酮,作用30 min,CaMKⅡβmRNA、CaMKⅡβ蛋白及pCREB表达进一步增加;8 μmol·L-1、16 μmol·L-1、32 μmol·L-1的Rb1可以显著抑制上述指标。结论：人参皂苷Rb1可能通过调控CaMKⅡβmRNA、CaMKⅡβ蛋白表达及核转录因子CREB的磷酸化,对慢性吗啡作用的SK-N-SH细胞产生影响。     

β_1-AR对心衰心室肌细胞快激活延迟整流钾电流的调控机制

目的探讨β1-肾上腺受体(β1-AR)激活对慢性心衰(CHF)豚鼠心室肌细胞快激活延迟整流钾电流(IKr)的影响及机制。方法制备豚鼠CHF模型,采用全细胞膜片钳技术记录心室肌细胞IKr,观察选择性β1-AR激动剂对CHF心室肌细胞IKr的影响,并采用蛋白激酶A(PKA)及钙调蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)抑制剂干预研究其机制。结果β1-AR激动剂扎莫特罗使CHF心室肌细胞IKr减少了(52±8)%,延长动作电位时程。β1-AR阻滞剂CGP20712A完全抑制扎莫特罗对CHF心室肌细胞IKr的减弱作用。应用PKA抑制剂KT5720预处理,扎莫特罗仅使CHF心室肌细胞IKr减少了(28±3)%。应用CaMKⅡ抑制剂KN93预处理,KN93不能减弱扎莫特罗对CHF心室肌细胞IKr的抑制作用。结论β1-AR激活抑制CHF心室肌细胞IKr;心衰时β1-AR通过PKA通路抑制心室肌细胞IKr,与CaMKⅡ通路无关。     

CaMKⅡ 在心血管疾病中作用的研究进展

钙离子/钙调素依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）具有多重作用,并在心血管事件中有着举足轻重的地位。特别是其可以作用于多种分子信号通路中的下游靶点,促进血管疾病、心衰、心肌肥厚和心律失常发生发展。CaMKⅡ通过磷酸化L型钙通道,兰尼碱受体（RyR2）和受磷蛋白（PLN）等多种钙调蛋白能够影响心肌细胞钙平衡、增加钙渗漏,亦可影响钠通道及钾通道,调节晚钠电流及ATP敏感性钾电流IKATP。此外更可直接通过激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）及脱乙酰化酶（HDAC）影响心肌细胞转录调控。而这些机制在心肌肥厚、心力衰竭、心律失常的发生发展中都有着重要作用。因此深入了解CaMKⅡ的结构与作用机制将有助于制定新的心血管疾病治疗策略。     

栝楼桂枝颗粒对神经元兴奋性毒性损伤后钙信号通路的影响

目的 研究栝楼桂枝颗粒对N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid,NMDA）诱导神经元兴奋性毒性损伤后钙信号通路的影响,并探讨其可能的机制。方法 建立NMDA诱导神经元兴奋性毒性损伤模型,栝楼桂枝颗粒干预后,采用MTT、LDH法检测神经元活性,免疫荧光染色法检测神经元特异性指标MAP-2蛋白的表达。Real-time PCR法检测神经元中CaMKⅡ、CREB mRNA的表达,Western blot法检测p-CREB、p-CaMKⅡ、CaMKⅡ、CREB及CaM蛋白的表达。结果 与NMDA组比较,栝楼桂枝颗粒（200,300 μg·mL^-1）组可显著提高细胞活力,降低LDH浓度（P<0.05或P<0.01）,明显升高CREB、CaMKⅡ mRNA水平（P<0.05或P<0.01）,明显升高MAP-2、p-CREB、p-CaMKⅡ及CREB水平（P<0.01）,而显著降低CaM水平（P<0.01）。结论 栝楼桂枝颗粒对NMDA诱导的神经元兴奋性毒性损伤具有保护作用,此作用可能与促进CREB、CaMKⅡ的磷酸化,抑制CaM的表达有关。     

CaMKⅡ信号通路在黄芪多糖抑制异丙肾上腺素诱导心肌细胞肥大中的作用

目的从钙调素依赖蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-de-pendent protein kinaseⅡ,CaMKⅡ)信号通路角度探讨黄芪多糖(astragalus polysaccharides,APS)对异丙肾上腺素(isoprot-erenol,Iso)诱导心肌细胞肥大的保护作用及机制。方法原代培养大鼠乳鼠心肌细胞,应用Iso 10μmol·L-1诱导心肌细胞肥大,观察β受体阻断剂普萘洛尔及不同浓度APS对肥大心肌细胞的影响。用消化分离法及计算机图像分析系统测细胞体积;Bradford法测心肌细胞总蛋白含量;ELISA法检测细胞外液中IL-6和TNF-α的含量;RT-PCR法检测ANP mRNA的表达;Western blot法检测心肌细胞CaMKⅡδ蛋白的表达。结果普萘洛尔(propranolol,PRO)和APS均能有效抑制Iso诱导的心肌细胞肥大,表现为体积减小、总蛋白含量降低及ANP mRNA表达降低,并能有效减少炎症反应,表现为细胞外液中IL-6、TNF-α的含量明显减少,CaMKⅡδ蛋白含量减少,且APS的作用呈一定的剂量依赖性。结论黄芪多糖对Iso诱导的乳鼠心肌细胞肥大具有保护作用,其机制可能与抑制CaMKⅡ信号通路及减少炎症反应有关。